Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

El flujo de trabajo presentado aquí puede ayudar a ampliar nuestra comprensión del papel celular de las chaperonas durante las condiciones de estrés oxidativo. Específicamente, puede ayudar a comprender cómo las chaperonas evitan la agregación de proteínas durante las condiciones de despliegue. Para estos, dos espaldas de diferentes técnicas proporcionan información sobre la actividad de los chaperones segregados por banderas.

También se puede utilizar para estudiar la interacción de otras proteínas, como las interacciones sociales de las enzimas y la dinámica de las proteínas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que implica el uso de diferentes instrumentos que pueden ser un desafío para los nuevos usuarios. En primer lugar, centrifuga una muestra de proteína previamente descongelada para eliminar los agregados.

A continuación, añada cinco milimolares de DTT y 20 micromolares de cloruro de zinc e incube la muestra durante al menos 1,5 horas a 37 grados centígrados. Para eliminar el TDT, equilibre una columna de desalinización con un tampón de fosfato de potasio de 40 milimolares llenando la columna completamente con el tampón y dejándolo gotear. Con unas pinzas, empuje suavemente hacia abajo el filtro de disco blanco de la columna y retírelo.

Vuelva a llenar la columna con tampón de fosfato de potasio y centrifugue a 1000 veces G durante tres minutos. Después de la centrifugación, transfiera la columna a un tubo limpio y agregue la muestra de proteína lentamente al centro de la columna. Centrifugar la columna a 1000 veces G durante dos minutos para que la proteína libre de DTT esté en el flujo.

Ahora verifique la concentración de proteínas y mida su absorbancia a 280 nanómetros. Distribuya la mitad de las muestras de proteína en alícuotas. Incubar las alícuotas en condiciones anaeróbicas durante 20 minutos para la eliminación completa del oxígeno.

A continuación, selle los tubos con una película de plástico y almacene las muestras en condiciones de frío. A continuación, agregue peróxido de hidrógeno de cinco milimolares recién preparado a la muestra de proteína restante e incube durante tres horas a 40 grados centígrados mientras agita. Después de la centrifugación, verifique la concentración de proteínas, luego divida las proteínas oxidadas en alícuotas y almacene en condiciones de frío.

Prepare el sustrato desnaturalizado incubando citrato sintasa de 12 micromolares durante la noche en HEPES de 40 milimolares y cloruro de guanidinio de 4,5 molares. Al día siguiente, abra el software del fluoroespectrómetro y vaya a la medición del curso del tiempo. Establezca el ancho de banda de excitación en 2,5 nanómetros.

La longitud de onda de excitación a 360 nanómetros. La longitud de onda de emisión a 360 nanómetros. El ancho de banda de emisión a cinco nanómetros.

Y el intervalo de datos a 0,5 segundos. Ajuste la temperatura a 25 grados centígrados. Prepare la muestra agregando 1600 microlitros de HEPES de 40 milimolares a una cubeta de cuarzo.

Inserte la cubeta en el portamuestras de un fluoroespectrómetro permitiendo que la muestra alcance la temperatura deseada. Después de ajustar la agitación a 600 rpm, comience la medición hasta que se establezca la línea de base. Para medir la agregación de citrato sintasa en ausencia de un acompañante, agregue 10 microlitros de citrato sintetasa desnaturalizada, 120 segundos después de la medición.

A continuación, continúe la medición durante 1200 segundos. Para medir la agregación de citrato sintasa en presencia de Hsp33, agregue Hsp33 a los 60 segundos de la medición. Después de 60 segundos adicionales, agregue 10 microlitros de citrato sintetasa desnaturalizado y continúe la medición durante 1200 segundos.

A continuación, cargue el archivo de datos para realizar el análisis de datos y la eliminación de ruido por parte de Kfits. Para eliminar cualquier ruido, elija los parámetros de análisis, use el mejor modelo automático y seleccione que el ruido siempre está por encima de la señal. Elimine manualmente los valores atípicos obvios usando las líneas ajustables verde y roja que filtrarán los ruidos por encima de la línea verde y por debajo de la línea roja.

A continuación, establezca la línea de base y la curva de ajuste. Después de aplicar el umbral de ruido, descargue los datos procesados. Prepare muestras de complejos de sustrato proteico agregando citrato sintetasa a Hsp33 en una proporción de 1 a 1,5 a 43 grados Celsius.

Utilice al menos cuatro pasos e incube las muestras durante 15 minutos a 43 grados centígrados después de cada adición para permitir la formación de complejos. Centrifugar las muestras a 16000 veces G a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para eliminar los agregados. A continuación, coloque las muestras en insertos de vidrio de 150 microlitros y transfiéralas a viales.

A continuación, colócalos en las bandejas adecuadas. Mantenga los tampones H y D a 25 grados Celsius y mantenga las muestras y el tampón de enfriamiento a cero a dos grados Celsius. A continuación, encienda manualmente todas las unidades de enfriamiento del espectrómetro de masas.

Una vez que todos los sistemas de refrigeración alcancen sus temperaturas objetivo, encienda manualmente tanto la HPLC como las bombas de carga. Abra el software que controla ambas bombas, así como el software que controla el espectrómetro de masas y asegúrese de que el MS esté en espera. Después de esto, desconecte la válvula de salida de HPLC de la fuente MS.

Lave primero el sistema con una solución de triple limpiador. Luego con el tampón B y finalmente con el tampón A. Luego inserte la columna de pepsina en el sistema. Después de lavar el sistema con un flujo constante y una presión constante, inserte la válvula de salida de HPLC en la fuente de MS y encienda la MS.

Ahora abra el software. Cree una secuencia de ejecución e introduzca todos los puntos de tiempo, los nombres de las muestras y las ubicaciones de las bandejas, así como los nombres y las ubicaciones de los búferes. Una vez completada la ejecución, analice la cobertura peptídica de la muestra ejecutando las muestras de control no deuteradas a través del software.

Transfiera datos al software HDX Workbench y analice los resultados con el software. Guarde los péptidos seleccionados y continúe para el análisis de la absorción de deuterio. La desnaturalización química conduce a una rápida agregación de citrato sintetasa inducida por el repliegue de una proteína completamente desnaturalizada en condiciones de tampón desfavorables.

Por otro lado, la agregación inducida térmicamente es el resultado de un despliegue relativamente lento del sustrato plegado nativamente. En ambas formas de desnaturalización, la adición de Hsp33 oxidado abolió por completo la agregación, reduciendo las lecturas de 360 nanómetros a valores insignificantes. La presencia de una Hsp33 reducida no tuvo ningún efecto sobre la estabilidad de la citrato sintetasa y dio una curva de agregación similar a la detectada en ausencia de un acompañante.

El patrón de deuteración entre la chaperona Hsp33 unida y no unida a su sustrato citrato sintetasa revela un sitio de interacción con el cliente dentro del dominio de conmutación redox C-terminal de la chaperona. El Hsp33 reducido tiene una estructura completamente ordenada, pero se vuelve funcional cuando detecta el estrés oxidativo. Mientras que la Hsp33 reducida unida y no unida produce curvas peptídicas similares, la Hsp33 oxidada muestra una diferencia de deuteración del 30% entre la chaperona unida y no unida, con áreas específicas de la proteína unida que indican un obstáculo alostérico.

Una vez establecido, el ensayo de dispersión puede completarse en unas pocas horas, mientras que la metodología DHEX puede completarse en dos a cuatro días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante planificar con anticipación. Recuerde que las condiciones descritas, como la temperatura, los tiempos de incubación y las soluciones tampón, son específicas de la proteína y deben optimizarse para cada proteína.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras metodologías, como la reticulación o la precipitación, con el fin de complementar los estudios de las interacciones de los sustratos chaperonas. En conclusión, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la biología estructural exploren la plasticidad de las proteínas en las chaperonas moleculares.