Name: Manipulación de células vivas para construir estable montaje celular 3D sin andamio Artificial (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprende a construir ensamblajes celulares 3D estables sin andamios artificiales utilizando pinzas ópticas láser y polímeros hidrofílicos como Dextran. Este método innovador facilita la ingeniería de tejidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores agradecen su generosa asistencia con la instalación experimental Shu Hashimoto, Aoi Yoshida y Taeko Ohta Universidad de Doshisha. Este trabajo fue apoyado por KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) y por el programa de MEXT-Supported para la Fundación de investigación estratégica en universidades privadas. Este estudio también fue apoyado por una beca Polaco saber (líder nacional centro de investigación) científico del consorcio de "Animal – seguro alimentos saludables", decisión del Ministerio de ciencia y educación superior no. 05-1/KNOW2/2015...

1. preparación de las células
<ol><li>Mantener NAMRU ratón glándula mamaria epiteliales células (NMuMG) con 5 mL de D-MEM con 10% (v) suero bovino fetal (FBS) y 1% (v) penicilina-estreptomicina (P/S) en un matraz de 25 cm3 . Quitar Dulbecco modificado medio del águila (D-MEM), que contiene 10% FBS y 1% P/S.</li>
	<li>Añadir 3-5 mL de solución salina de 37 ° C con tampón fosfato (PBS) (-) en el matraz. Tenga en cuenta que el pH de PBS es 7.1-7.3.</li>
	<li>Retirar el PBS del frasco utilizando un aspirador.</li>
	<li>Añadir 1,5 mL de tripsina de 37 ° C (0,25%, w/v) en el matraz.</li>
	<li>Incube el frasco de aproximadamente 1 a 2 minutos a 37 ° C en un incubador de CO2 .</li>
	<li>Añadir 3,5 mL de D-MEM con 10% FBS y 1% P/S al matraz. Pipeta para mezclar.</li>
	<li>Transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar durante 3 minutos a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que el radio de giro y velocidad de rotación de la centrífuga son 16,6 cm y 1500 rpm, respectivamente. Bajo esta condición, la fuerza centrífuga relativa es 417 x g.</li>
	<li>Añadir 5 mL de D-MEM fresco (10% FBS y 1% P/S) en el matraz después de aspirar el medio (si es necesario, criopreservar las células con solución de criopreservación, siguiendo las instrucciones del fabricante).</li>
</ol>2. preparación de dextrano (DEX)
<ol><li>Preparar 80 mg/mL de solución DEX mezclando 10 mL de D-MEM (10% FBS, 1%P/S) y 0,8 g de DEX. Tenga en cuenta que la solución DEX se puede filtrar con un filtro de jeringa (0,22 μm) después de que las células han cultivado durante tiempo suficiente.</li>
	<li>Preparar una suspensión que contiene medio DEX 40 mg/mL mediante la mezcla de 200 μL de solución DEX y 200 μL de la suspensión preparada en el punto 2.1. Tenga en cuenta que la densidad del número de células en la solución es aproximadamente 2.3 × 105 células/mL.</li>
</ol>3. preparación para el láser y la microscopía
<ol><li>Encienda el láser (onda continua, longitud de onda de 1.064 nm) (figura 1a). Tenga en cuenta que el uso de un rayo láser con una longitud de onda en el rojo para la región del infrarrojo cercano es más eficaz; esta región de longitud de onda se llama la ventana diagnóstica y terapéutica10 ya que es mínimamente absorbida por las células.</li>
	<li>Haga doble clic en el icono del software.</li>
	<li>Haga doble clic en que los iconos de la cámara ①, ② de diódos de luz (LED), foco ③ ajustan y ④ etapa en movimiento. Se mostrará la pantalla correspondiente a ①-④ (figura 1b).</li>
</ol>4. célula manipulación usando el sistema de captura de láser
<ol><li>Lugar 20 μl de la muestra preparada en el paso 2.2 en el vidrio de la cubierta inferior (0,17 mm de espesor, tamaño = 30 x 40 mm) y cúbrala con el vidrio de cubierta superior (0,17 mm de espesor, tamaño = 18 x 18 mm), con separación de dos espaciadores (0,17 mm de espesor tamaño = 10 mm × 24 mm), como se muestra en la figura 2. Tenga en cuenta que estas gafas no requieren una capa especial.</li>
	<li>Colocar la celda de muestra preparada en el paso 4.1 en el objetivo inferior (inmersión con aprox. 10 μl, ampliación de agua = 60 X, distancia de trabajo = 0,28 mm, abertura numérica = 1.2)).</li>
	<li>Fijar el objetivo superior (inmersión con aprox. 10 μl, ampliación de agua = 60 X, distancia de trabajo = 2 mm, abertura numérica = 1.0) en la parte superior de la celda de muestra.</li>
	<li>Enciende el LED luz haciendo clic en el icono 2 (figura 1b).</li>
	<li>Ajustar la distancia entre la muestra y el objetivo inferior haciendo clic en los iconos en el panel 3 (figura 1b) hasta que esté en foco.</li>
	<li>Irradiar los rayos láser en posición 1 y posición 2 (figura 1B) de la muestra haciendo clic en los iconos I, II y III (figura 1b).</li>
	<li>Ajustar la intensidad de cada rayo láser a 1.500 mW introduciendo este valor en icono IV (figura 1b).</li>
	<li>Paso la etapa de muestra haciendo clic en las direcciones que indica icono 4 (figura 1b) hasta una célula está atrapada en la posición 1 (figura 1b).</li>
	<li>Arrastre el cursor que indica posición 2 (figura 1b) hasta otra célula está atrapado en la posición 2.</li>
</ol>5. construcción de una estructura de 3 dimensiones (3D) celular
<ol><li>Manipular una sola celda que está en contacto con otra célula. Mantener esta condición por 300 s; es decir, cada célula está expuesto a un láser de 300 s.</li>
	<li>Registrar el eje X que se muestra en la figura 1b.</li>
	<li>Captura y transporte de otra célula a las células para construir un conjunto celular 2D arbitraria.</li>
	<li>Construir un conjunto celular 3D moviendo arriba y abajo del escenario.</li>
	<li>Confirma que la Asamblea sigue siendo estable después de desconecta el láser.</li>
</ol>

<ol><li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577(2015).</li>
<li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li>
<li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%22%5BJournal%5D)">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li>
<li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li>
<li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29248729">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li>
<li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/9/8/319">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319(2017).</li>
<li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+photothermolysis%3A+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li>
<li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009261416303207">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li>
<li>Rauch, P., Jähnke, T. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/optical-tweezers-for-quantitative-force-measurements-and-live-cell-experiments/D4853D94DFD7AE988E656F49A1DA49FB">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li>
<li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18315348">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503(2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente estudio muestra una aplicación concreta de nuestros últimos informes9,11 sobre el uso de polímeros solubles para la construcción de ensamblajes 3D unicelular. Tales asambleas se forman estable en la solución a granel cuando el número de células es hasta 10 y puede ser sostenido por un haz de láser. Asambleas de precipitan en la superficie de vidrio cuando hay más de 10 células. Aunque los experimentos están todavía en una etapa primitiva, esperamos que la nueva metodología podría ser una poderosa herramienta para la construcción de la nueva generación 3D unicelular asambleas, que son indispensables para el progreso en los campos de la biología celular y medicina regenerativa.
En una solución que contiene ningún polímero, las células repelen debido a la repulsión electrostática de la carga superficial, la fuerza de repulsión de la hidratación, el efecto de repulsión de glicocálix y ondulación de la membrana. Nuestro estudio anterior mostró que pares de células pueden ser estables durante mucho tiempo cuando las células se tratan con PEG. Lo más importante, el transporte exitoso de un par de célula a una región sin clavija, después las células se celebró en contacto durante 5 minutos en PEG, sugiere que el contacto celular se mantiene de forma estable. Esto está bien explicado en términos del efecto agotamiento del11, y esencialmente el mismo mecanismo se aplica a los conjuntos celulares mediante DEX9. Nuestros resultados actuales sugieren que otros tipos de macromoléculas naturales podrían utilizarse también para la construcción de asambleas celulares 3D estables.
Para el transporte rápido de las células, la concentración de polímero es importante. Generalmente, la viscosidad de la solución aumenta drásticamente cuando el polímero es disuelto por encima de la concentración de superposición. Bajo esta condición, es difícil manipular las células usando pinzas ópticas. Por lo tanto, el experimento debe ser realizado debajo de la concentración de superposición. Para una solución DEX, la concentración de superposición es aprox. 50 mg/mL (la viscosidad cinética es 5.5 mm2/s). Como se indica en la ref. 9, se observó una Asamblea celular estable cuando la concentración de DEX 10 mg/mL y 40 mg/mL. Este resultado sugiere que el efecto de agotamiento es lo suficientemente grande para mantener el contacto célula-célula estable incluso cuando la concentración de DEX es menor que la concentración de superposición. Se ha demostrado que la adición de DEX no afecta la viabilidad de las células hasta 40 mg/mL 9.
El establecimiento de un método para la construcción de asambleas celulares 3D es importante en el campo de la medicina regenerativa, desde mímico un en vivo microambiente celular por estructuración de las células puede facilitar el tejido derivado de células madre formación. Hasta ahora, hemos utilizado el presente Protocolo para la construcción de conjuntos celulares con Neuro2A células9 además de las células NMuMG. Esperamos establecer una metodología experimental para la construcción de asambleas celulares 3D de un mayor número de células de diferentes morfologías. El sistema de pinza óptica desarrollado por Ichikawa et al. 13 sería aplicable para este propósito ya que la orientación de las células puede ser controlada. Ensayos adicionales a lo largo de estas líneas deben ser prometedoras.

Mientras que los tejidos humanos se componen de varias asambleas de células y pueden ayudar a mantener la homeostasis del cuerpo, las células por sí mismos también desempeñan papeles importantes a través de la interacción célula a célula. Por lo tanto, es importante aclarar cómo las células pueden ser estimuladas por señales externas y cómo transfieren dichas señales a otras células adherentes. Para ello, se han establecido varios métodos para la construcción de solo celular basado en 3 dimensiones (3D) Asambleas1,2,3,4,5,6 ,7,8. Sin embargo, todavía se pueden mejorar los materiales que se utilizan para la construcción de asambleas celulares. Por ejemplo, geles sintéticos y polímeros como polietileno glicol (PEG) poseen ciertas propiedades físico-químicas químicos y pueden afectar a las células diana (p. ej., toxicidad).
Nos informó recientemente un novedoso sistema que podría generar un montaje 3D basado en célula única de células utilizando dextrano (DEX) estableciendo contacto célula-célula estable9. Consideramos que esta tecnología podría ser útil en varios campos de investigación, incluyendo la medicina regenerativa y Biología del cáncer incluso. En este informe, describimos cómo manipular las células y construir conjuntos celulares de 3 dimensiones (3D) en presencia de varios hidrofílicos biomacromoléculas incluyendo DEX sin un andamio artificial.

<table><tbody><tr><td>Microscopio IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano (200.000; grado de biología molecular)</td><td>Wako</td><td>CAS.NO&nbsp; 9004-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Captura Láser (NanoTracker 2)</td><td>JPK Instruments</td><td>S/N T-05-0200</td><td></td></tr><tr><td>Lente de Objetivo Superior</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN60XW</td><td></td></tr><tr><td>Lente de Objetivo</td><td>Inferior Olympus UPLSAPO60XW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vidrio de cubierta superior</td><td>MATUNAMI</td><td>C022401</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio de cubierta intermedio (espaciador)</td><td>MATUNAMI-hecho</td><td></td> <td>a medida (tamaño = 10 mm y veces; 10 mm, espesor = 0,17 mm)</td></tr><tr><td>Cubierta inferior de vidrio</td><td>MATUNAMI</td><td>C030401</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>La fuente de imagen</td><td>DFK 31AF03</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoTracker2 PFM software</td><td></td></tr><tr><td>NMuMG&nbsp;</td><td>RIKEN BRC</td><td>RCB2868</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Banquero de células</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td>ZR621</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japón</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japón</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific 25200056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japón</td><td>161-23181</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulación de células vivas para construir estable montaje celular 3d sin andamio artificial

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos ofrecen varias ventajas para el tratamiento de enfermedades intratables, y varios estudios han demostrado la importancia de asambleas celulares de 3 dimensiones (3D) en estos campos. Andamios artificiales se han utilizado a menudo para construir ensamblajes celulares 3D. Sin embargo, los andamios utilizados para construir conjuntos de celulares a veces son tóxicos y pueden cambiar las propiedades de las células. Por lo tanto, sería beneficioso establecer un método no tóxico para facilitar el contacto de la célula. En este trabajo presentamos un método novedoso para la construcción de asambleas celulares estables mediante el uso de pinzas ópticas con dextrano. Una de las ventajas de este método es el que establece contacto de célula a célula estable en pocos minutos. Este nuevo método permite la construcción de asambleas celulares 3D en un polímero hidrofílico natural y se espera que sea útil para construir la próxima generación 3D unicelular conjuntos en los campos de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos.

La figura 1 muestra el microscopio y el software utilizado en este estudio. Figura 2 es una representación esquemática del procedimiento para la colocación de la solución muestra que contiene las células. Figura 3 se muestra la formación de una estructura de pirámide usando pinzas ópticas de doble haz. Si el experimento tiene éxito, estas asambleas celulares permanecen estables incluso después de desconecta el láser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> Figura 1 : (a) el sistema de control para el sistema de captura de Laser (NanoTracker2 (11)). El sistema se activa al encender el interruptor del láser siguiendo los pasos ①-③. (b) el software para controlar el sistema de captura de láser. La cámara, ajuste de luz, foco, y etapa en movimiento se activan haciendo clic en los iconos ①, ②, ③ y ④, respectivamente. La imagen microscópica se muestra en el panel 1. El control de encendido de lo LED es en el panel 2. El enfoque se controla en el panel 3. Los rayos láser son irradiados en posiciones 1 y 2 haciendo clic en los iconos I a IV. Los detalles de este Systemare de captura de láser proporcionan en Ref (12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> Figura 2: esquema representativo para colocar el vidrio de la diapositiva. 20 μl de la muestra (suspensión de la célula que contiene dextrán) se coloca en la diapositiva y utilizado para la manipulación de láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> Figura 3 : un) asambleas de células epiteliales (NMuMG) de forma prevista en un medio con DEX (40 mg/mL): una pirámide se muestra como un ejemplo de un clúster de 3D. b) también se muestra una Figura esquemática de la Asamblea celular 3D en forma de pirámide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Demostrar un método novedoso para la construcción de un conjunto de (3D) 3 dimensiones basadas en celdas individuales sin un andamio artificial.

Manipulación de células vivas para construir estable montaje celular 3D sin andamio Artificial

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Esta novedosa metodología nos permite construir conjuntos tridimensionales, adaptados a partir de células individuales deseadas, en una solución tampón acuosa que contiene polímero hidrófilo inespecífico, estableciendo un contacto estable entre células y células. En este video, demostraremos cómo manipulamos las celdas individuales deseadas y construimos conjuntos celulares 3D sin andamios artificiales. Aquí vamos a mostrar el procedimiento experimental en nuestro medio con Dextran como ejemplo.Para empezar, mantenga las células epiteliales de la glándula mamaria del ratón NAMRU con cinco mililitros de DMEM, que contienen 10%FBS y 1%Penicilina-Estreptomicina, en un matraz de 25 centímetros cúbicos durante dos a tres días. Cuando esté listo para proceder, utilice un aspirador para eliminar el DMEM suplementado y agregue de tres a cinco mililitros de PBS, que se precalienta a 37 grados Celsius para lavar las células. Con un aspirador, retire todo el PBS del matraz.Añadir 1,5 mililitros de trippsina que se precalienta a 37 grados centígrados. Incubar en una incubadora de CO2 a 37 grados centígrados durante al menos uno o dos minutos. Después de esto, añadir 3.5 mililitros de DMEM que contiene 10%FBS y 1%Penicilina-Estreptomicina.Pipetear arriba y abajo para mezclar. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros y centrifugarlo a 417 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Entonces, aspira el medio.Añadir cinco milímetros de DMEM fresco que contiene 10%FBS y 1%Penicilina-Estreptomicina. Y si es necesario, utilice una solución de criopreservación para criopreservar las células como se describe en las instrucciones del fabricante. Primera mezcla 10 mililitros de DMEM complementados con 10%FBS y 1%Penicilina-Estreptomicina con 0.8 gramos de Dextran, para preparar una solución de Dextran de 80 miligramos por mililitro.Mezclar 200 microlitros de esta solución Dextran con 200 microlitros de la suspensión celular previamente preparada, para crear una suspensión celular que contenga 40 miligramos por mililitro Medio Dextran. Para empezar, encienda el láser, tenga en cuenta que el uso de un rayo láser con una longitud de onda en la región roja a casi infrarrojo es más eficaz. A continuación, abra el software haciendo doble clic en el icono del software.Haga doble clic en el icono de la cámara y tenga en cuenta que aparecerá la pantalla correspondiente. A continuación, haga doble clic en los iconos del diodo emisor de luz, el ajuste de enfoque y la etapa móvil para abrir sus pantallas también. Primero coloque dos espaciadores de vidrio en el portaobjetos de vidrio de la cubierta inferior.Transfiera 20 microlitros, la suspensión celular suplementada de Dextran previamente preparada en el portaobjetos de vidrio de la cubierta inferior. A continuación, coloque la corredera de vidrio de la cubierta superior sobre los espaciadores que cubren la suspensión celular. Coloque la célula de muestra en la lente objetivo inferior con 10 microlitros de agua destilada para microscopía de inmersión en agua.Coloque la lente objetivo superior en la parte superior de la celda de la muestra utilizando 10 microlitros de agua destilada. A continuación, haga clic en el botón de encendido y apagado en la ventana de iluminación del microscopio para encender el LED. Haga clic en los botones de dirección en la ventana de posicionamiento objetivo para ajustar la distancia entre la muestra y el objetivo inferior hasta que esté enfocado.Establezca la intensidad de cada rayo láser en 1500 milivatios en la ventana de atenuación de señal. A continuación, haga clic en los dos iconos láser para irradiar los rayos láser en la posición uno y la posición dos. Haga clic en los botones direccionales de la ventana de posicionamiento de la muestra para mover la etapa de muestra hasta que una celda quede atrapada en la posición uno.Haga clic y arrastre el cursor indicando la posición dos hasta que otra celda quede atrapada en la posición dos. Para empezar, manipule una sola celda, de modo que esté en contacto con otra celda. Mantenga esta condición durante 300 segundos, de modo que la célula se exponga a un láser durante 300 segundos.Registre el eje x-y. Atrapa otra celda y transporta a las dos primeras celdas para construir un conjunto de celdas 2D arbitrario. A continuación, mueva el escenario hacia arriba y hacia abajo para construir un conjunto celular 3D.Confirme que el conjunto sigue siendo estable incluso después de apagar el láser. En este estudio, los polímeros solubles se utilizan en la construcción de conjuntos de células simples 3D. Aquí se muestra una estructura de ejemplo formada con las pinzas ópticas de doble haz.Si el experimento es exitoso, estos conjuntos celulares permanecen estables incluso después de que el láser está apagado. Esta nueva metodología es para la construcción de conjuntos celulares 3D en un medio acuoso con polímero hidrófilo natural. Se espera que comience la construcción de este tipo de conjuntos celulares de próxima generación con algunas de las poderosas herramientas en el campo de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos.

manipulating-living-cells-to-construct-stable-3d-cellular-assembly

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se presentan dos procesos de microfabricación de chips de polímero poroso para el cultivo de células en tres dimensiones. El primero es el estampado en caliente combinado con un proceso de soldadura vapores de disolventes. El segundo utiliza un proceso desarrollado recientemente microthermoforming combinada con la tecnología de iones de la pista que conduce a una simplificación significativa de la fabricación.

Microfabricación de chip del tamaño de andamios para el cultivo de células en tres dimensiones

Este artículo describe un método versátil para crear células derivadas de los anillos de tejido celular por auto-ensamblaje. Las células musculares lisas sembradas en forma de anillo total de agarosa pozos y el contrato de forma sólida en tres dimensiones (3D) de los tejidos dentro de 7 días. A escala milimétrica los anillos de tejido son propicias para los ensayos mecánicos y servir de base para el montaje del tejido.

Dirigida celular de auto-ensamblaje para fabricar células derivadas de tejido para el análisis de anillos de Biomecánica e Ingeniería de Tejidos

A continuación se describe el uso de un auto-montaje de andamios de 3 dimensiones para cultivo de células progenitoras neurales humanas. Se presenta un protocolo para liberar las células de los andamios para ser analizados posteriormente por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este protocolo puede ser adaptado a otros tipos de células para llevar a cabo estudios detallados de manera mecánica.

Cultivo de Células progenitoras neurales en un hidrogel de péptidos 3-dimensional de auto-montaje

Para la creación de estructuras altamente organizadas de tejido complejo, se deben ensamblar múltiples tipos de materiales y células en un compuesto integrado.  Este diseño combinatorio incorpora láminas de células estratificadas específicas de órganos con dos materiales distintos derivados de la biología que contienen una fuerte base de matriz fibrosa y células endoteliales para mejorar la formación de nuevos vasos.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Una bioimpresora cartesiana fue diseñada y fabricada para permitir la deposición de múltiples materiales en geometrías precisas y reproducibles, al tiempo que permite el control de factores ambientales. Utilizando la bioimpresora tridimensional, se pueden imprimir y reproducir fácilmente construcciones complejas y viables.

Viabilidad de Bioprinted celulares Construye El uso de un Tres Impresora cartesiana dispensador

Este protocolo describe una plataforma para la fabricación de anillos de tejido automático montado en tamaños variables utilizando un molde de plástico modificado para requisitos particulares impresa en 3D. Negativos PDMS se curan en el molde impreso en 3D; agarosa se echa entonces en los negativos PDMS curados. Las células se siembran en los pozos de agarosa resultante donde agregan en anillos de tejido.

Fabricación de pozos de agarosa personalizado para la siembra de células y tejido anillo autoensamblaje con moldes impresa en 3D

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Presentamos un procedimiento para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener una formación de patrón repetible. Un dispositivo cúbico que contiene dos diferentes hidrogeles se emplea para lograr la proyección de imagen multi-direccional para la formación de patrones de tejido.

Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible

Este protocolo detalla un método para la producción de tres tipos diferentes de esferoides de una manera que los hace adecuados para la detección y el análisis de alto contenido a gran escala. Además, se presentan ejemplos que muestran cómo se pueden analizar a nivel de células esferoides e individuales.

Un método robusto para la producción a gran escala de esferoides para aplicaciones de detección y análisis de alto contenido

Los esferoides celulares se han considerado un modelo potencial en el campo de las aplicaciones biológicas. Este artículo describe los protocolos para la generación escalable de esferoides celulares utilizando un dispositivo de ensamblaje acústico 3D, que proporciona un método eficiente para la fabricación robusta y rápida de esferoides celulares uniformes.

Dispositivo de montaje acústico tridimensional para la fabricación en masa de esferoides celulares

Aprende a construir ensamblajes celulares 3D estables sin andamios artificiales utilizando pinzas ópticas láser y polímeros hidrofílicos como Dextran. Este método innovador facilita la ingeniería de tejidos.

Manipulación de células vivas para construir estable montaje celular 3D sin andamio Artificial

Explorar más videos