Name: Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Aprende a evaluar la maduración de células mieloides mediante citometría de flujo multiparamétrica guiada por base de datos. Esta técnica reduce la subjetividad del investigador y mejora el diagnóstico de síndromes mielodisplásicos.

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Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron proporcionados por BD Biosciences. Los autores desean agradecer a su colega, el Dr. Pascale Flandrin-Gresta, desde el Departamento de Biología Molecular, laboratorio de Hematología, Universidad Hospital de Saint-Etienne, Francia, que proporciona conocimientos para la interpretación de datos NGS para la segunda Caso MDS. Los autores están agradecidos por los hematólogos del clínico para su interés y participación en este estudio y para los pacientes y donantes sanos para su acuerdo para participar en este estudio. Los autores quisieran agradecer a la Fundación "Les Amis de Rémi" apoyo financiero para la publicación.

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten. El Departamento de citometría de flujo, laboratorio de Hematología en el Hospital de la Universidad de Saint-Etienne es un miembro del consorcio EuroFlow.

La calidad de aspirado del BM podría impactar en los resultados finales. La hemodilución de la aspirada del BM podría distorsionar la distribución de células en diferentes etapas de maduración debido a la ausencia de progenitores o precursores. Probablemente emplear un bulto lisis método puede ayudar en la normalización de BM aspira por hemodilución en los análisis de citometría de flujo. Además, los pasos críticos para la evaluación de la displasia mieloide BM por citometría de flujo son la muestra procesamiento y tinci...

En la ausencia de marcadores fenotípicos específicos a los que ocurren en las células mieloides durante la MDS iniciación y progresión de los cambios displásticos, ha propuesto un nuevo enfoque en los últimos años basadas en la evaluación de las vías de maduración (expresión alterada de antígenos mieloides durante la producción de células mieloides maduras) o de la distribución anormal de los diferentes tipos de células en la médula (BM) la célula compartimientos1,2.
Este artículo presenta un nuevo método para el uso estandarizado de MFC para detectar cambios displásticos en BM compartimentos de células mieloides relacionadas con síndromes mielodisplásicos (MDS) u otras enfermedades hematológicas mieloides. Este estudio también demuestra la utilidad del uso de bases de datos de maduración para el análisis de datos MFC.
Estandarización del procedimiento de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis con las bases de datos permitiría la identificación de las anormalidades fenotípicas más relevantes relacionados con los cambios displásicos en células mieloides BM. Por lo tanto, son necesarios para el desarrollo de una estrategia de análisis que se puede utilizar en análisis posteriores subconjuntos estadísticamente seleccionados basados en formatos bien marcados y reconocidos (separador de población automático (APS) diagramas, histogramas y diagramas de punto) rondas. El descubrimiento de anormalidades fenotípicas robustos en MDS facilitaría el diagnóstico en casos con o sin displasia morfológica mínima y sin aberrancies citogenéticas. Identificación de parámetros discriminatorios lo que permite la reducción de paneles de immunophenotypic puede simplificar el actual puntuaciones2, permitiendo su aplicación en laboratorios de patología clínica.
Este método limita las interpretaciones subjetivas de datos de citometría, como se ha senalado en MDS diagnóstico3. Este paso es un requisito previo para el desarrollo de herramientas automáticas para el procesamiento y análisis de flujo de datos4.
MDS comprende un grupo heterogéneo de trastornos clonales de células madre hematopoyéticas (HSC) en el que las mutaciones del espliceosoma cooperan con modificadores epigenéticos específicos para producir el fenotipo MDS. Ahora se sabe que, junto con las mutaciones de la HSC, otros mecanismos están implicados en la fisiopatología MDS, como inflamación mediada inmune aberrante e interacciones entre HSCs malignas y el microambiente estromal del BM. Sin embargo, estos mecanismos siguen siendo mal entendidos. La heterogeneidad amplia clínica y biológica de los MDS hace el diagnóstico y la selección de la terapia óptima un desafío. En la última década, varios estudios han demostrado que MFC es a menudo más sensible en la detección de displasia2 de morfología, pero las limitaciones técnicas y económicas dificultan esta técnica estandarizar, con resultados a menudo depende de la experiencia del intérprete3. Además, no está claro cómo MFC puede inclinar la balanza hacia MDS en casos con o sin displasia morfológica mínima y en ausencia de anomalías citogenéticas o en casos extremos como hypocellular MDS, con una cuenta baja blast, de otros no clonal BM trastornos como la insuficiencia de la médula ósea (ej., anemia aplásica). También sigue siendo difícil de distinguir casos dudosos de MDS con un exceso de blastos de la leucemia mieloide aguda (AML). Por todas estas razones, las directrices clínicas integran no MFC de prueba en el diagnóstico final de MDS. En 2011, red nacional de cáncer integral de Estados Unidos (NCCN) recomendó MFC para la estimación del porcentaje de células CD34 +, detección de clones de la hemoglobinuria paroxística nocturna y la presencia de clones de células T citotóxicas en hypocellular MDS5. Estas dos últimas situaciones implican también un objetivo terapéutico porque los datos clínicos han demostrado una buena respuesta de estos pacientes a la terapia inmunosupresiva6. Las guías NCCN de 2017, citando las recomendaciones del grupo de trabajo internacional (GTI), la lista aberrante immunophenotyping detección MFC entre los co criterios para el diagnóstico de la MDS, pero sin realizar ninguna Especificaciones6. Además, la recientemente publicada clasificación de la OMS estipula que resultados MFC solamente no son suficientes para establecer un diagnóstico primario de MDS en ausencia de datos concluyentes de la morfológica y citogenética7. Sin embargo, MFC puede utilizarse como una prueba adicional que el dysregulation de células mieloides patrones de maduración y cuantificar la "distancia de normal" para un paciente en un momento específico en el curso de la enfermedad.
Este método es aplicable a los laboratorios clínicos interesados en la evaluación de la displasia de las células mieloides BM usando MFC immunophenotyping, para afinar el diagnóstico en MDS u otros desordenes mieloides con anormalidades displásticas.

<table><tbody><tr><td>Citómetro de flujo BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td>. <td>SN:</td> V33896301336 <td>configuración de 3 láseres, 4-2-2, Detalles de filtros y espejos:</td></tr><tr><td>Centrífuga https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf Awel C48-R</td><td>AWEL Industries, FR</td><td>SN: 910120016; Modelo: 320002001</td><td>centrífugas de baja velocidad; capacidad 60 tubos FACS</td></tr><tr><td>pipetas de 10 y micro; L y 200&micro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetas</td><td></td><td></td><td></td>Pasteur</tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon tubo de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polipropileno para FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano HLA-DR</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td><td></td><td>. 655874 clon L243 Ratón BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD45</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td><td>.</td><td>560777 clon HI30 Ratón IgG1, &kappa; Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD16</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU.</td><td>656146</td><td>clon CLB/fcGran1 Ratón BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD13</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td><td></td><td>. clon de 347406 L138 Ratón BALB/c X C57BL/6 IgG1, &kappa; Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD34</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU.</td> clon <td>de 347222</td><td>8G12 Ratón BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD117</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td><td>. 339217</td><td>clon 104D2 Ratón BALB/c IgG1 Fluorocromo PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD11b</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td><td>. clon de 333143</td><td>D12 ratón BALB/c IgG2a, &kappa; D12, Fluorocromo APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm</td></tr><tr><td>Ratón Anti-humano CD10 BD</td><td>Biosciences, CA, EE. UU</td><td>. clon</td><td>646783 HI10A Ratón BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD35</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU.</td><td>555452</td><td>clon E11 Ratón IgG1, &kappa; Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD64</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td><td></td><td>. 644385 clon 10.1 Ratón BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD300e</td><td>Immunostep</td><td>IREM2A-T100</td><td>clon UP-H2 Ratón BALB/c IgG1, k Fluorocromo APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD14</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU.</td><td>641394</td><td>clon MoP9 ratón BALB/c IgG2b, &kappa; Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD36</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td><td>. clon de 656151</td><td>CLB-IVC7 Ratón IgG1, &kappa; Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD105</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td><td>. 560839</td><td>clon 266 Ratón BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo PE (Ex máx. 496 nm/ Em máx. 578 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD33</td><td></td><td>345800</td><td>clon P67.6 Ratón BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Ratón Anti-Humano CD71</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td><td></td><td>. 655408 clon M-A712 Ratón BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Solución de lisis 10x Concentrado (IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td>. <td>349202</td><td></td></tr><tr><td>FACSFor fluido de vaina baja</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU</td>. <td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva CS& T Cuentas IVD</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU.</td><td>656046</td><td></td></tr><tr><td>PARTÍCULAS DE CALIBRACIÓN ARCO IRIS, 8 PICOS</td><td>Cytognos, Salamanca, España</td><td>Lotes SPH-RCP-30-5A</td><td>EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td></tr><tr><td>Partículas de compensación Multicolor CompBeads (CE/IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td><td></td></tr><tr><td>Diva software versiones 6.1.2 y 6.1.3</td><td>BD Biosciences, CA, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletas de solución salina tamponada con fosfato</td><td>R& D Systems, Minneapolis, EE.UU.</td><td>5564</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;( BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Francia</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica 99%</td><td>Sigma-Aldrich, Francia</td><td>199931</td><td></td></tr><tr><td>Infinicyt versión 1.8.0.e</td><td>Cytognos, Salamanca, España</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Un grupo de trabajo iniciado dentro de la asociación francesa de citometría (AFC) fue desarrollado con el fin de armonizar la aplicación de la citometría de flujo multiparamétrico (MFC) para el diagnóstico de enfermedad mieloide en Francia. El protocolo presentado aquí fue acordada y aplicada entre septiembre de 2013 y noviembre de 2015 en seis laboratorios de diagnóstico francés (hospitales universitarios de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Niza y Lille e Instituto Paoli-Calmettes en Marsella) y permite la estandarización de la médula ósea muestra preparación y adquisición de datos. Tres bases de datos de maduración fueron desarrollados para neutrófilos, monocítica y linajes eritroides con la médula ósea de individuos "sanos" donantes (personas sin ninguna evidencia de una enfermedad hematopoyética). Un método robusto de análisis para cada linaje mieloide debe ser aplicable para el uso rutinario de diagnóstico. Nuevos casos pueden ser analizados de la misma manera y con respecto a las bases de datos generalmente. Por lo tanto, cuantitativas y cualitativas las anormalidades fenotípicas pueden ser identificadas y aquellos por encima de 2SD en comparación con los datos de las muestras de médula ósea normal puede considerarse indicativas de patología. La principal limitación es la mayor variabilidad entre los datos que se consigue utilizando los anticuerpos monoclonales obtenidos con los métodos basados en hibridomas tecnologías y actualmente se utiliza en diagnóstico clínico. Establecimiento de criterios para la validación técnica de los datos adquiridos puede ayudar a mejorar la utilidad de MFC para el diagnóstico MDS. El establecimiento de estos criterios requiere un análisis contra una base de datos. La reducción de la subjetividad del investigador en análisis de datos es una ventaja importante de este método.

Las 54 muestras de BM en anticoagulante EDTA K se incluyeron en el estudio. Se analizaron los datos MFC en la ausencia de cualquier información sobre los pacientes. Estudio retrospectivo demostró que las muestras del BM eran de 7 donantes sanos (5 machos y 2 hembras con una edad media de 47.4 [35-48], 11 personas sin evidencia de una enfermedad hematopoyética (8 varones y 3 hembras con una edad promedio de 57.9 [35-72]) y 36 casos con varias condiciones patológicas: 1 caso con anemia y n...

La diagnosis MDS es difícil en ausencia de criterios morfológicos o citogenética no informativo. MFC podría ayudar a perfeccionar el proceso de diagnóstico de MDS. Para ser de utilidad para la práctica clínica, el análisis MFC debe basarse en parámetros con suficiente especificidad y sensibilidad, y resultados deben ser reproducibles entre diferentes operadores.

Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el diagnóstico de enfermedades mieloides como síndromes de mielodisplasia u otras enfermedades hematológicas que evolucionan con anomalías de maduración en linajes celulares mieloides. La principal ventaja de esta técnica es que reduce la subjetividad del investigador en ese análisis e interpretación. Este método puede proporcionar información sobre cuáles son los parámetros más discriminatorios para la mielodisplasia.Permite cuantificar las diferencias con respecto a las poblaciones normales de células mieloides. Demostrando el procedimiento estará Tiphanie Picot, un becario postdoctoral de nuestro laboratorio. Comience mezclando 600 microlitros de la muestra de célula primaria con 10 mililitros de tampón de lavado en un tubo cónico de 15 mililitros para dos centrifugaciones y 10 mililitros de tampón de lavado fresco por lavado.Después del segundo lavado, vuelva a suspender el pellet en 400 microlitros de tampón de lavado fresco, y transfiera 350 microlitros de la suspensión celular a un tubo FACS de polipropileno de cinco mililitros, que contiene todo el panel de anticuerpos de la columna vertebral. Después de mezclar a fond

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La formación de colonias de células (CFC) de ensayo es un ensayo in vitro en progenitores hematopoyéticos que forman colonias en un medio semi-sólido. Una combinación de la morfología de la colonia, la morfología celular y citometría de flujo se utilizan para evaluar la capacidad de los progenitores para proliferar y diferenciarse a lo largo de los diferentes linajes hematopoyéticos.

La formación de colonias de células (CFC) para el ensayo de células hematopoyéticas humanas

Mientras que los macrófagos infiltrados son continuamente reclutados en tejidos adultos a partir de precursores circulantes, los macrófagos residentes sembran su tejido durante el desarrollo, donde se mantienen sin más aportación de los progenitores. Recientemente se identificaron los progenitores de macrófagos residentes. Aquí, presentamos métodos para el mapeo de destino genético de los progenitores de macrófagos residentes.

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Detección de enfermedad residual mínima o medible (Milirutherford) es un biomarcador pronóstico importante para refinar la evaluación de riesgo y predicción de la recaída en la leucemia mieloide aguda (AML). Estas directrices amplias y recomendaciones con las mejores prácticas de identificación consistente y precisa y detección de MRD, puede ayudar en la toma de decisiones eficaces de tratamiento de AML.

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Contorneamos un protocolo para detectar la expresión simultánea de marcadores de células madre de leucemia en las células de la leucemia mieloide aguda primaria por citometría de flujo. Mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos.

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Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.

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El presente protocolo describe un método rentable para purificar, expandir y caracterizar células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC) altamente homogéneas de ratones. Este enfoque facilita la adquisición de grandes cantidades de BMSCs con alto potencial de proliferación y diferenciación, apoyando modelos de ratón y avanzando en la investigación preclínica.

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