Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula
November 3rd, 2018
La diagnosis MDS es difícil en ausencia de criterios morfológicos o citogenética no informativo. MFC podría ayudar a perfeccionar el proceso de diagnóstico de MDS. Para ser de utilidad para la práctica clínica, el análisis MFC debe basarse en parámetros con suficiente especificidad y sensibilidad, y resultados deben ser reproducibles entre diferentes operadores.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el diagnóstico de enfermedades mieloides como síndromes de mielodisplasia u otras enfermedades hematológicas que evolucionan con anomalías de maduración en linajes celulares mieloides. La principal ventaja de esta técnica es que reduce la subjetividad del investigador en ese análisis e interpretación. Este método puede proporcionar información sobre cuáles son los parámetros más discriminatorios para la mielodisplasia.
Permite cuantificar las diferencias con respecto a las poblaciones normales de células mieloides. Demostrando el procedimiento estará Tiphanie Picot, un becario postdoctoral de nuestro laboratorio. Comience mezclando 600 microlitros de la muestra de célula primaria con 10 mililitros de tampón de lavado en un tubo cónico de 15 mililitros para dos centrifugaciones y 10 mililitros de tampón de lavado fresco por lavado.
Después del segundo lavado, vuelva a suspender el pellet en 400 microlitros de tampón de lavado fresco, y transfiera 350 microlitros de la suspensión celular a un tubo FACS de polipropileno de cinco mililitros, que contiene todo el panel de anticuerpos de la columna vertebral. Después de mezclar a fondo las células, pipetear volúmenes iguales de la solución de anticuerpos celulares en tres nuevos tubos de polipropileno, y llevar el volumen final en cada tubo hasta 200 microlitros con tampón de lavado fresco según sea necesario. A continuación, añada el volumen adecuado de anticuerpos contra los marcadores de la superficie celular de interés con la mezcla, para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.
Al final de la incubación, añadir dos mililitros de solución de lisamiento con mezcla, para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Recoger las células de lesed por centrifugación, y desechar todos los últimos 50 microlitros de sobrenadante en cada tubo, sin perturbar el pellet. Vuelva a suspender los pellets en el sobrenadante restante, con una mezcla suave, y agregue dos mililitros de tampón de lavado fresco a cada muestra.
Después del segundo lavado, deseche el sobrenadante, dejando aproximadamente 50 microlitros de volumen residual en cada tubo, sin alterar el pellet. Re-suspender el pellet en 200 microlitros de PBS con mezcla, para su análisis inmediato. Para leer las muestras en un citómetro de flujo, abra primero un nuevo experimento en el software del citometro de flujo y cambie el nombre del experimento según el nombre, el tipo de muestra y la fecha.
Cree una nueva muestra para tres tubos y especifique los anticuerpos utilizados en cada tubo en el diseño del experimento. Abra la configuración del citometro y seleccione la configuración de la aplicación para aplicar los valores obtenidos en la configuración mensual. Abra una nueva hoja de trabajo global y cree las gráficas de puntos adecuadas para trazar las células singletes, así como para las poblaciones de granulocitos, monocitos, explosiones y linfocitos.
Cree una nueva hoja de cálculo global para los controles de compensación. A continuación, adquiera 500.000 eventos de cada tubo, a una tasa de adquisición media, exportando los datos como archivos fcs 3.0, después de su validación técnica. Antes de iniciar un nuevo análisis, descargue los archivos cyt que contienen los datos normales de la médula ósea, para los linajes rojos neutrófilos, monocíticos y nucleados, y los archivos de análisis en formato inp.
A continuación, guarde los datos en el escritorio. Para guardar la maduración de los neutrófilos en la base de datos, abra primero el software Infinicyt y luego abra el archivo cyt correspondiente a los datos de maduración de neutrófilos. Dibuje la vía de maduración en el gráfico APS y guarde la vía de maduración del neutrófilo en la base de datos.
Abra el archivo fcs para la maduración del linaje de neutrófilos que debe analizarse. Cargue el archivo inp de maduración de neutrófilos desde la pestaña Perfiles. El análisis de este linaje se divide en tres pasos.
Comience con la selección de explosiones CD34 positivas y comprometidas con neutrófilos. Para ello, utilice una intersección de siete puertas, para permitir la selección de los eventos CD34 positivos, CD117 positivos, HLADR bajo, CD10 negativos, CD13 positivos, CD11 b negativos. Continúe el análisis con la selección de los precursores de neutrófilos negativos CD117 positivos CD117.
Continúe el análisis con la selección de células neutrófilas más maduras. A continuación, muestre el análisis de las células de linaje monocítico. Dibuje la vía de maduración en el gráfico APS.
Verifique que la flecha que indica la sensación de maduración está orientada desde células inmaduras, moncíticas, CD14 negativas, IREM2 negativas, a los monocitos maduros, CD14 positivo, IREM2 positivo. Guarde la vía de maduración para el linaje monocítico en la base de datos. Abra el archivo fcs para la maduración de linaje monocítico que debe analizarse.
Cargue el perfil para el análisis de linaje monocítico. Para identificar las celdas de linaje monocítico, utilice una intersección de cuatro puertas que permita la selección de CD64 positivo alto, CD117 positivo, CD117 negativo, eventos positivos HLADR. Asigne estos eventos a la pestaña monótica del árbol de jerarquía de población.
Abra el archivo cyt NRC que debe guardarse en la base de datos NRC. Dibuje la vía de maduración en el gráfico APS y guarde la vía de maduración de los glóbulos rojos nucleados a la base de datos. Abra el archivo fcs que debe analizarse.
Cargar desde los perfiles la plantilla de análisis para los glóbulos rojos nucleados. El análisis de este linaje se divide en dos pasos. Comenzando con la selección de las explosiones positivas de CD34, eritroide.
Aquí, utilice una intersección de siete puertas para permitir la selección de los eventos CD34 positivos, CD117 positivos, HLADR low, CD105 positivo, CD33 negativo, CD36 positivo, CD71 positivos. Asigne estos eventos a la pestaña NRC de la jerarquía de población. Retire la visibilidad de las explosiones comprometidas de eritroide positivo CD34.
Para identificar células eritroideas más maduras, utilice una intersección de cuatro puertas que permitan la discriminación de CD45 negativo y CD45 positivo bajo, bajo de dispersión lateral, CD36 positivo alto y CD71 positivo alto. Luego, retire las plaquetas bajas de dispersión de lado alto CD36 de los glóbulos rojos nucleados, y asigne esta población a la pestaña NRC. Para evaluar la maduración mieloide en el compartimento de la médula ósea, abra el archivo cyt correspondiente al linaje de interés del caso que debe evaluarse.
Mantenga visibles solo los eventos asignados a la pestaña del neutrófilo en el árbol de jerarquía de población. Dibuje la vía de maduración en el gráfico APS y cargue la base de datos correspondiente a la maduración del neutrófilo en la médula ósea normal y compare los datos. Si los datos son al menos parcialmente compatibles, el software creará un diagrama normalizado de diferencias de maduración, y una banda de parámetros, para visualizar las diferencias de maduración.
Para comparar la maduración de los monocitos en el compartimento de la médula ósea, para un nuevo caso con datos de médulas óseas normales, incluso en la base de datos de monocitos, abra el archivo cyt correspondiente al linaje celular monocítico. Mantenga visibles solo los eventos asignados a la pestaña monocitos en el árbol de jerarquía de poblaciones y dibuje la ruta de maduración en el gráfico APS. Cargue la base de datos correspondiente a la maduración de los monocitos en las médulas óseas normales y compare los datos.
Para comparar la maduración de los glóbulos rojos nucleados en el compartimento de la médula ósea, para un nuevo caso, con los datos de las médulas óseas normales, incluidos en la base de datos NRC, abra el archivo cyt correspondiente al linaje del NRC. Mantenga visibles solo los eventos asignados a la ficha NRC en el árbol de jerarquía de población. Y dibuje la vía de maduración en el gráfico APS.
Cargue la base de datos correspondiente a la maduración NRC en las médulas óseas normales y compare los datos. A continuación, para visualizar la importancia de las diferencias entre el nuevo archivo y los datos incluidos en la base de datos, haga clic en diferencias de maduración normalizadas y haga zoom. Recuerde que los métodos que utilizan los algoritmos de clasificación jerárquica en el análisis de datos citométricos de flujo son altamente subjetivos e inherentemente inexactos, porque no cuentan para la superposición de la población de celdas.
La evaluación de nuevos casos de citopenia, sospechoso de ser MDS contra las bases de datos de maduración normal mieloide, permite la identificación de antígenos de maduración anormalmente expresados de linajes de neutrófilos, monocitos y NRC, incluso en casos sin anomalías citológicas o citogénicas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar adquirir los datos citométricos de flujo, de manera estandarizada, para realizar la configuración mensual del citometro, controles diarios, pipetear rigurosamente el anticuerpo antes de su uso y respetar los tiempos de tinción. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la brújula para comparar el grupo de casos diferentes y para responder a preguntas adicionales, como cuál es la huella typic final para un grupo determinado de casos.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores interesados en explorar patrones de maduración de células mieloides, en casos de hematopoyesis clonal de potencial indeterminado para identificar los cambios tipicos finales relacionados confiablemente relacionados con el proceso displásico. Tenga en cuenta que la actualización de la base de datos con un mayor número de datos de donantes sanos puede mejorar la solidez del análisis.
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Visión general
Este artículo discute el uso de la citometrìa de flujo multiparamétrica (CFM) para mejorar el proceso de diagnóstico de los síndromes mielodisplásicos (SMD). Destaca la importancia de la especificidad y sensibilidad en el análisis de CFM para aplicaciones clínicas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Hematología
- Enfermedades mieloides
- Técnicas de diagnóstico
Antecedentes
- El diagnóstico de SMD es desafiante sin criterios morfológicos.
- La citogenética no informativa complica el proceso de diagnóstico.
- La CFM puede potencialmente refinar el proceso de diagnóstico de SMD.
- La reproducibilidad de los datos entre operadores es crucial.
Propósito del estudio
- Evaluar la efectividad de la CFM en el diagnóstico de enfermedades mieloides.
- Identificar los parámetros más discriminatorios para la mielodisplasia.
- Reducir la subjetividad en el análisis e interpretación.
Métodos utilizados
- Mezclar muestras de células primarias con tampón de lavado.
- Realizar centrifugaciones para la preparación de muestras.
- Cuantificar diferencias de las poblaciones celulares mieloides normales.
- Demostrar el procedimiento por un becario postdoctoral.
Principales resultados
- La CFM proporciona información sobre las diferencias en las poblaciones de células mieloides.
- La técnica reduce la subjetividad del investigador.
- Permite la cuantificación de parámetros discriminatorios.
- Se enfatiza la reproducibilidad de los datos para la utilidad clínica.
Conclusiones
- La CFM puede mejorar la precisión diagnóstica para los SMD.
- La especificidad y sensibilidad son vitales para la aplicación clínica.
- Se necesita más validación para un uso clínico generalizado.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
