In Situ Medición y correlación de la densidad celular y emisión de luz de bacterias bioluminiscentes

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioluminiscencia. Por ejemplo, encontrar las condiciones óptimas de crecimiento para la máxima intensidad lumínica de las bacterias bioluminiscentes y determinar el mecanismo regulador. La principal ventaja de esta técnica es la fácil configuración, que se puede utilizar para varias cepas y organismos, así como las posibilidades de ajuste simples y rápidas.

Seguir este método puede proporcionar información sobre las características del operón lux. También se puede aplicar a otros sistemas, como bacterianos, ambientales, sistemas de informes o sensores. Para empezar, prepare un cultivo nocturno inoculando 100 mililitros de medio LB con kanamicina, con células de E. coli BL21 transformadas en operones lux a partir de caldo de glicerol, o directamente de una placa de transformación.

Incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 120 RPM durante la noche. Al día siguiente, inocule 800 mililitros de medio de kanamicina LB con 8 mililitros del cultivo durante la noche. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados, y 120 RPM en un agitador de incubadora, hasta que la densidad celular alcance un OD600 de 0,6 a 0,8.

Reducir la temperatura de incubación a 28 grados centígrados e inducir la expresión de proteínas añadiendo 0,1 milimolares de IPTG. Luego observa las células hasta que comiencen a brillar. Después de preparar los medios de acuerdo con el protocolo de texto, esférese las cepas bioluminiscentes bacterianas en placas de agar medio de agua de mar artificial e incube a 24 a 30 grados centígrados durante la noche.

Prepare un cultivo durante la noche inoculando 100 mililitros de medio de agua de mar artificial con una sola colonia de la placa. Luego incube el cultivo a 24 a 30 grados Celsius y 120 RPM durante la noche. Al día siguiente, inocule 800 mililitros de medio de agua de mar artificial con 8 mililitros de cultivo durante la noche.

Incubar las células bacterianas a 24 a 30 grados centígrados y 120 RPM y observar las células hasta que comiencen a brillar. Raye la cepa bacteriana bioluminiscente deseada, o la cepa de E. coli modificada en una placa de agar, e incube el cultivo a 28 grados centígrados durante la noche. Inocular 3 mililitros de medio con una sola colonia de la placa de la noche a la mañana, e incubar las células a 28 grados centígrados y 180 RPM durante aproximadamente una o dos horas.

Mida la densidad celular de una dilución de uno a diez del cultivo líquido a 650 nanómetros. A continuación, calcule la proporción y el volumen de un mililitro de cultivo con un OD650 de 0,05. Pipetear el volumen calculado de cultivo y medio en una placa de pared negra de 24 pozos con fondo de vidrio.

Para asegurarse de que el vector pET28a que contiene todo el operón lux no se pierda, y que se exprese en la cepa de E. coli modificada, agregue un microlitro de kanamicina y un microlitro de IPTG a las muestras. Luego coloque una tapa en la placa, para evitar la evaporación durante las mediciones. Por último, utilice un lector de placas configurado a 28 grados centígrados y un script que se encuentra en el protocolo de texto, para tomar medidas de absorbancia y bioluminiscencia cada 10 minutos, con agitación entre los puntos de datos.

Esta figura compara las mediciones de OD650 de las células BL21 de E. coli, las células BL21 que contienen un vector pET28a vacío y las células BL21 que contienen un vector pET28a con el inserto de operón lux-rib, pero sin inducción. Las tres mediciones de referencia para la emisión de luz muestran una curva de crecimiento sigmoidal con fases de crecimiento rezagado, exponencial y estacionario, pero sin emisión de luz, excepto para la última muestra, que muestra emisión de luz después de 300 minutos, debido a la fuga del promotor T7. Aquí, se compararon las curvas de crecimiento y las intensidades de luz del operón lux expresado en E. coli, y la cepa bacteriana bioluminiscente, photobacterium mandapamensis 27561, a 28 grados Celsius en LB, o medio de agua de mar artificial.

La cepa modificada de E. coli y P. mandapamensis crecen en medio de agua de mar artificial, así como en medio LB, y ambas muestran emisión de luz. Pero en medio LB, P.Mandapamensis no emite luz en absoluto. Sorprendentemente, la cepa de E. coli modificada muestra una intensidad de luz máxima más alta que las bacterias bioluminiscentes.

En este experimento, se midió la expresión génica del operón lux-rib basado en E. coli durante 24 horas para analizar su longevidad. La emisión de luz duró 19 horas y media, mucho más que las cepas bacterianas, donde se observó una disminución gradual, lo que resultó en una emisión de luz muy baja después de 10 horas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioluminiscencia exploraran operones lux en organismos modelo, como E. Coli.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo trabajar con bacterias bioluminiscentes.