Una plataforma de Microphysiologic de grasa humana: intercala tejido adiposo blanco

Este método innovador nos permite, por primera vez, mantener la grasa viva y saludable ex vivo durante varias semanas consecutivas para el estudio de la biología adiposa. La principal ventaja de esta técnica es que el tejido permanece estable durante ocho semanas en el cultivo mientras se recapitula el microambiente adiposo, incluidas las células de soporte del estroma adiposo nativo circundante. Comience sembrando ASC a una confluencia de aproximadamente el 80% en las placas de cultivo de tejidos.

Por cada pocillo de SWAT deseado, siembre un pocillo de cultivo de tejidos convencional y un pocillo del tamaño correspondiente en una placa de plástico de cultivo de tejidos recubierta de PNIPAAm. Mantenga el ASC en medio de cultivo completo a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante seis a ocho días, cambiando el medio cada dos días. Veinticuatro horas antes de la siembra SWAT, envuelva el borde del disco de émbolo de cada émbolo para el aparato de siembra SWAT al menos dos veces con cinta de laboratorio para evitar fugas de la solución de gelatina.

En una cabina de bioseguridad desinfectada con etanol, rocíe un estante de tubos cónicos de 15 mililitros que contenga tubos cónicos vacíos y sin tapar de 15 mililitros, así como cada émbolo envuelto en cinta con etanol al 70%, colocando cada émbolo en un tubo vacío a medida que se desinfecta. Rocíe arandelas metálicas de aproximadamente 6,3 gramos y colóquelas en la rejilla junto con un par de pinzas con gancho. A continuación, cierre la hoja del armario y encienda la luz ultravioleta para facilitar el secado nocturno y la esterilización de los materiales del aparato de siembra.

Cuando las células alcancen el 100% de confluencia y demuestren un patrón estriado, agregue 0,75 gramos de gelatina en polvo a 10 mililitros de HBSS. Y equilibrar el pH de la solución con 100 microlitros de hidróxido de sodio. Agregue la gelatina a un baño de agua a 75 grados centígrados y agite el tubo vigorosamente cada cinco minutos hasta que el polvo se disuelva en solución.

Cuele la solución homogénea de gelatina a través de un filtro de jeringa y aplique la gelatina a los émbolos. Los bordes pegados de los émbolos servirán como molde mientras la gelatina se solidifica. Cuando la gelatina se haya solidificado, desenvuelva la cinta y use las pinzas en forma de gancho para quitar la gelatina del borde exterior del émbolo, teniendo cuidado de que la gelatina restante en el centro del émbolo esté completamente nivelada, para maximizar el contacto con la lámina de ASC.

Una vez que se haya eliminado la gelatina de todos los émbolos, aplique suavemente cada émbolo a una placa ASC recubierta de PNIPAAm usando las arandelas de metal para pesar los émbolos. Después de una incubación de 1,5 horas a temperatura ambiente, transfiera las placas a un baño de agua helada durante otras 1,5 horas para completar la disociación de la lámina celular de la superficie de la placa recubierta PNIPAAm. A continuación, limpie la parte inferior de las placas recubiertas PNIPAAm para eliminar el agua no estéril.

Una vez recibido el tejido adiposo humano, agregue el medio de cultivo celular frío a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por cultivo para sembrar. Y lavar grandes segmentos del tejido adiposo tres veces con PBS estéril, eliminando la mayor cantidad posible de PBS entre lavados. Después del último lavado, use fórceps y una navaja de afeitar estéril para picar el tejido en trozos grandes, eliminando la mayor cantidad posible de vasculatura y fascia hasta que la solución adquiera una consistencia líquida espesa con la menor cantidad posible de segmentos individuales visibles de tejido adiposo blanco.

Una vez que se haya alcanzado la consistencia adecuada del tejido, utilice una punta de micropipeta P1000 modificada para transferir el volumen adecuado de tejido picado a cada tubo de 1,5 mililitros previamente preparado y mezcle brevemente el tejido picado con el medio dentro de los tubos. A continuación, reemplace el medio en cada cultivo de ASC con un volumen de solución de tejido adiposo blanco y transfiera suavemente los émbolos de gelatina a la mezcla de tejido adiposo blanco en las placas ASC base. Examine las monocapas en las placas recubiertas PNIPAAm bajo un microscopio para confirmar el desprendimiento celular y mueva las placas a la superficie de un bloque de calor de 37 a 40 grados Celsius en la cabina de bioseguridad.

Luego agregue dos a tres mililitros de medio de cultivo calentado para incubar las células y facilitar el derretimiento de la gelatina. Después de 30 minutos, retire suavemente los émbolos de la superficie de la placa, cubra los cultivos con las tapas de placas adecuadas y coloque las placas en la incubadora de cultivos celulares. Cuando la gelatina se haya licuado completamente, aspire y reemplace el medio de cultivo celular con el volumen adecuado de medio M199 libre de rojo de fenol suplementado con insulina, dexametasona y antibióticos.

A lo largo de 7,5 semanas de cultivo, los grupos SWAT permanecen asegurados en su lugar en la monocapa y solo se observan ligeros cambios morfológicos en los adipocitos individuales. La tinción clara de rojo Nilo de grupos de adipocitos uniloculares a las dos semanas de cultivo demuestra que las células son de hecho adipocitos con membranas intactas, en lugar de artefactos, quistes o adipocitos muertos. La tinción con yoduro de propidio en cultivos SWAT de 53 días de edad y la tinción con Oil Red O en cultivos SWAT de 51 días de edad confirman que los adipocitos mantienen la viabilidad incluso en puntos temporales avanzados.

La inmunocitoquímica demuestra la expresión y localización apropiada esperada de proteínas y marcadores de adipocitos maduros dentro del SWAT y la PCR cuantitativa indica la expresión de genes clave de adipocitos a nivel transcripcional. La evaluación de la función endocrina de la albahaca indica la secreción de leptina de albahaca de los cultivos SWAT detectada por ELISA, y también se puede inducir la liberación de glicerol en respuesta a la estimulación química. El xenotrasplante de adipocitos cultivados con SWAT revela depósitos de grasa claramente visibles y fácilmente recuperables 10 días después del trasplante que tiñen los marcadores de adipocitos humanos, pero no los de ratón.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en unas cinco horas si se realiza correctamente. Es importante recordar que hay que procesar el tejido primario rápidamente para minimizar la muerte celular. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR cuantitativa en tiempo real, la inmunotinción o los ensayos funcionales para responder preguntas adicionales sobre cómo responden los adipocitos a diversos fármacos o toxinas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la cultura SWAT como una plataforma estable y confiable para su investigación adiposa. No olvide que trabajar con tejido humano primario puede ser peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones como usar el EPP adecuado y manipular el tejido bajo cabinas de bioseguridad mientras se realiza este procedimiento.