Name: Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4, 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende a detectar la localización subcelular de proteínas mediante etiquetado con GFP y tinción con DAPI en Caenorhabditis elegans. Este protocolo rápido permite visualizar simultáneamente la translocación nuclear bajo estrés térmico.

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Las cepas de C. elegans utilizadas en este estudio se obtuvieron en el centro de genética de Caenorhabditis, que es apoyado por los institutos nacionales de salud - oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Este trabajo fue financiado por los NIH: 1R03AG048578-01 a Jun Liang, CUNY CCRG 1501 a Jun Liang y PSC-CUNY 66184-00 44 y 45 de 67248-00 a Jun Liang. Agradecemos a Cathy salvaje-Dunn para compartir amablemente su espacio de laboratorio. Todas las imágenes de fluorescencia se recolectaron en instalaciones centrales de Queens College. Agradecemos a William J. Rice por sus comentarios sobre el manuscrito.

1. las soluciones
<ol><li>
Planchas NGM
	<ol>
<li>En un matraz de Erlenmeyer de 2 L, añadir 3 g de NaCl, 17 g de agar, 2,5 g de peptona y 975 mL de dH2O. tapa la boca del matraz con papel de aluminio. Autoclave el matraz durante 50 minutos enfriar durante 20-30 minutos.</li>
		<li>Luego añadir soluciones estériles: 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de colesterol 5 mg/mL en etanol, 1 mL de 1 M MgSO4y 25 mL de tampón de 1 M KPO4 (pH 6.0). Remolino de las soluciones para mezclarlos bien.</li>
		<li>Utilizando un dosificador de líquido, dispensar la solución NGM a placas de Petri de 60 mm. Llenado completo de las placas de 2/3 de agar. Guárdelos en un recipiente hermético a 4 º C para uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tampón de4 de KPO de 1 M (pH 6.0)
	<ol>
<li>10,83 g de KH2PO4 y 3,56 g de K2HPO4 en dH2O se disuelven, luego ajuste el volumen total a 100 mL. Autoclave de la solución durante 15 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
M9
	<ol>
<li>Disolver 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl en dH2O, añadir 1 mL de 1 M MgSO4y ajuste el volumen total a 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI de 10 μg/mL
	<ol>
<li>Añadir 1 μl de 10 mg/mL DAPI en 999 μl de dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
alcohol al 95% (v/v)
	<ol>
<li>Mida 95 mL de alcohol al 100% y añada agua destilada para ajustar el volumen a 100 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
acetona al 30% (v/v)
	<ol>
<li>Añadir 30 mL de acetona a dH2O y ajuste el volumen total de 100 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. calor
<ol><li>Generar una matriz Extracromosómica con un constructo traslacional de target genes9,10. También puede obtener tales líneas de centro de genética de Caenorhabditis (CGC), que es un recurso público para la investigación de C. elegans , o de un laboratorio de investigación previamente publicada.</li>
	<li>Integrar las líneas extracromosómicas en el genoma al exponer los gusanos a 3.800 Rad γ-radiación9. A continuación, seleccione las líneas estable expresadas para que cada animal expresa una proteína del marcador como GFP o rodillo.</li>
	<li>Para eliminar las mutaciones generadas durante la radiación, outcross las líneas por lo menos 2 x. Utilice esta línea transgénica para detectar cambios de patrones de expresión de la proteína bajo estrés.</li>
	<li>Preparar platos para NGM gusano como se describe en el paso 1.1. Raya un clon OP50 y cultura la bacteria en caldo LB líquido durante la noche. Semilla de las planchas NGM con líquido OP50 cultivan e incuban las placas en una incubadora de 37 ° C durante la noche para crecer un césped de bacterias como fuente de alimento para los gusanos. Enfriar las placas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de su uso.</li>
	<li>Crecer la línea transgénica a 20 ° C sin hambre durante al menos 2 generaciones antes de la prueba de estrés de calor.</li>
	<li>Tomar a 8 a 10 jóvenes grávidas (útero llenado de huevos) que una nueva placa de gusano, luego deje que ellos ponen huevos por unos 3 a 5 h y retire a todos los adultos de las placas.</li>
	<li>Para sincronizar los gusanos, que los huevos se incuban y crecen las larvas de aproximadamente 48 h para el cuarto estadio larvario (L4). Examinar su vulva estructura una media luna para identificar la etapa (figura 1, flecha) L4 del11.</li>
	<li>Coloque las placas de gusano con las larvas L4 en una incubadora a 35 ° C por 2 – 5 h para alcanzar la tensión de calor. Coloque un termómetro en la incubadora para medir con precisión la temperatura.</li>
</ol>3. tinción DAPI
<ol><li>
Fijación de etanol
	<ol>
<li>Añadir 10 μl del buffer M9 en el centro de un portaobjetos de vidrio.</li>
		<li>Recoger los gusanos dio una sacudida eléctrica el calor de paso 2.8 y ponerlos en el buffer M9 en el portaobjetos de cristal.<ol>
<li>Por otra parte, lavar la placa con la M9, centrifugar a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Añadir los gusanos a lo portaobjetos de vidrio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilice un pañuelo de papel suave para drenar el exceso de líquido. Ver este paso con un microscopio de disección.</li>
		<li>Añadir 10 μl de alcohol 95% en los gusanos y déjelos secar al aire. Ver el proceso con un microscopio de disección y no permita que los animales se seca demasiado. Inmediatamente después de que el etanol se ha evaporado de los animales, proceder al siguiente paso. Nota: Etanol se evapora muy rápidamente.</li>
		<li>Repita el paso 3.1.4 dos veces para que los gusanos son fijos. Nota: Es normal que los animales parecen más oscuros y torcidos.</li>
		<li>Añadir 10 μl de DAPI (10 μg/mL) a los gusanos. Inmediatamente cubrir con un cubreobjetos y sellar la diapositiva con esmalte transparente de uñas de gel.</li>
		<li>Ve los animales después de alrededor de 10 min en un microscopio de fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fijación de la acetona (un enfoque alternativo)
	<ol>
<li>Lave la placa de calor-dio una sacudida eléctrica de paso 2.8 con M9, centrifugar a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet con 1 mL de dH2O recoger el diábolo y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 400 μL de acetona al 30% para centrifugar a 15 minutos a 1.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Use 500 μl de dH2O para lavar los animales 2 x. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 200 μL de DAPI (10 μg/mL), o 4 x la cantidad de volumen de los gusanos total, en el tubo por 15 min.</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g durante 1 min y descartar el sobrenadante. Lavar el precipitado 2 x con 500 μl de dH2O. colocar las lombrices sobre portaobjetos de vidrio, cubrir con cubre-objetos, sellar la diapositiva con esmalte transparente de uñas gel y observar los animales bajo un microscopio de fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. microscopio imágenes
<ol><li>Encienda la fuente de luz UV y un microscopio de fluorescencia. Encienda la computadora conectada al microscopio.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos en el microscopio de fluorescencia. Utilice un objetivo de baja potencia (10 X) para localizar los gusanos, aumentar el poder de magnificación de 400 X y enfocarse en el espécimen.</li>
	<li>Abra el software provisto con el microscopio. Haga clic en "Adquisición" en el menú; Haga clic en "Cámara" y seleccione la cámara conectada al microscopio; Esto permite que la cámara seleccionada para comunicarse con el software. Nota: Diferentes microscopios pueden variar en funcionamiento.</li>
	<li>En el mismo "adquisición", haga clic en "Adquisición Multidimensional". Esto abre una nueva ventana de navegación "Adquisición Multidimensional". Haga clic en el botón de "Multicanal", y aparecerán todos los canales disponibles.</li>
	<li>Elegir azul, verde y DIC (contraste diferencial de interferencia) para observar a la muestra. En la ventana de navegación "Adquisición Multidimensional", deja el "Azul DAPI", "Verde-GFP" y "Gris-DIC", "Nomarski" canales Haga clic en otros canales, tales como "Rojo-rodamina" y "campo blanco brillante", para cerrarlas.</li>
	<li>
En primer lugar, medir el tiempo de exposición para cada canal:
	<ol>
<li>Haga clic en el canal "Azul DAPI" para seleccionarla y luego haga clic en "Medida" para tomar una imagen en vivo en el canal DAPI con el tiempo de exposición automática. Aparecerá una nueva ventana con una imagen en vivo.</li>
		<li>En el lado izquierdo de la ventana de la imagen en directo, ajustar manualmente el tiempo de exposición si es necesario para que la imagen deseada.</li>
		<li>Por último, haga clic en "OK" en la ventana de la imagen en directo. Esto establece el tiempo de exposición en el canal DAPI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita el paso 4.6 para los otros canales "Verde-GFP" y "Gris-DIC", "Nomarski", para establecer los tiempos de exposición para los canales.</li>
	<li>En la ventana de navegación "Adquisición Multidimensional", haga clic en "Start" para recoger automáticamente 3 imágenes en los 3 distintos canales en orden (véase arriba) con tiempos de exposición específicos como conjunto.</li>
	<li>Para guardar el archivo, vaya al menú principal, haga clic en "File" luego en "Guardar como". Entrada de nombre de archivo y el nombre de carpeta. Guarde el archivo como el formato de archivo predeterminado para preservar la información detallada de la proyección de imagen para futuras referencias.</li>
	<li>
Para exportar archivos en otros formatos:
	<ol>
<li>Vaya a "Archivo" y haga clic en "Exportar". Se abrirá una ventana de configuración de exportación.</li>
		<li>Establecer nombre de archivo y carpeta. Consulte "Crear una carpeta de proyecto" para mejor organiza los datos. El software también permite al usuario especificar 4 otras opciones: "Generar combinado imágenes", "Usar color para imágenes de canal", "Nombres de canales de uso" y "Sólo para la imagen combinada".</li>
		<li>Elija un tipo de archivo deseado en el menú desplegable, como "TIF", "BMP", "PSD", o "JPG" y otros tipos. Haga clic en "Start" exportar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor%2FDAF-16%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release%2C+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1%2FFas+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li>
<li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins%3A+a+20-year+stock-take%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li>
<li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+%28Placozoa%29%2C+an+animal+lacking+neurons+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905(2018).</li>
<li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+%28ROS%2FRNS%29+during+hypersensitive+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li>
<li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043678">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li>
<li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308(2017).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li>
<li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer%3A+surprising+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li>
<li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li>
<li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene%2C+CLIC4%2C+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378(2012).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li>
<li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li>
<li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929(2014).</li>
<li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li>
<li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li>
<li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1%2FBECN1%2FBeclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li>
<li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+environment%2C+DAF-7%2FTGFbeta+signaling+and+LAG-2%2FDSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li>
<li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+helicase+HIM-6%2FBLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li>
<li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li>
<li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

Este artículo presenta un método rápido y eficiente para verificar cambios subcelular de proteínas desde el citoplasma al núcleo. La expresión de la proteína fue demostrada por la fusión de GFP, mientras que la estructura del núcleo se verificó por DAPI tinción (figura 3). Desde proteínas de C. elegans inmunotinción es desafiante, más localizaciones subcelulares proteína de C. elegans se caracterizan por etiquetado con proteínas marcadoras como GFP, Laz, mCherry y otros<sup...

Un cambio de la localización subcelular de la proteína es un mecanismo común en respuesta a señales internas o externas como el estrés por calor, hambre, estrés oxidativo, apoptosis, fosforilación de proteínas y otros. Por ejemplo, estrés por calor induce un miembro FOXO DAF-16 translocación nuclear1,2y la proteína del BCL-2 pro-apoptótica que BID se transloca a la mitocondria a muerte recibe señalización3,4. Varias técnicas están disponibles para detectar estos cambios. Una combinación de western blot y aislar bioquímicamente estructuras subcelulares (p. ej., mitocondrias o el núcleo) bien podría alcanzar la meta de3. Sin embargo, requiere un anticuerpo específico contra la proteína de interés. Por lo tanto, un anticuerpo bien establecido se convierte en la clave del éxito. Un enfoque alternativo es rotular diferentes estructuras subcelulares u organelos con diversos marcadores como la proteína de fluorescencia verde (GFP), proteína de la fluorescencia roja (RFP), proteína de fluorescencia amarilla (YFP) y mCherry, y mientras tanto la proteína de la etiqueta interés con otros marcadores. Entonces, los observa bajo un microscopio confocal para localizar los objetivos5,6. Isótopos radiactivos son una alternativa para el etiquetado de las proteínas de la blanco y entonces detectar su localización subcelular7. Sin embargo, este método requiere una formación adecuada y el manejo de desechos radiactivos. En circunstancias como la falta de un anticuerpo específico, la ausencia de un marcador adecuado o el scarceness de equipos como el microscopio confocal, un enfoque alternativo debe ser considerado. Para identificar un desplazamiento nuclear de la proteína, es atractivo solamente etiquetar las proteínas de la blanco con un marcador y para teñir los núcleos con el reactivo químico 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ya que esto sólo requiere un microscopio de fluorescencia regular.
C. elegans de la inmunomarcación con anticuerpos es difícil debido a la baja permeabilidad de la cáscara de huevo o de la cutícula colagenosa que rodea el animal. Mientras tanto, ya que las proteínas de C. elegans son significativamente divergentes de sus ortólogos vertebrados, algunas compañías comerciales proporcionan C. elegans con productos específicos. Es difícil para un pequeño laboratorio generar anticuerpos C. elegans por sí mismos. Los investigadores en la comunidad suelen ser etiquetadas proteínas como marcadores para demostrar una expresión de localización o gen de la proteína. Este artículo utiliza EXL-1::GFP como un ejemplo a seguir un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor8. Una traslación integrado exl-1::gfp en el genoma de animales se utiliza para expresar estable el gen con la fusión de gfp . La investigación demostró que exl-1 se expresa en intestino, músculo de la pared del cuerpo y otras estructuras subcelulares8. Este protocolo muestra cómo sincronizar los gusanos para el cuarto lugar larvario (L4), realice una calor estrés experimento y conducta tinción DAPI, etanol de la fijación, fijación de acetona y la proyección de imagen en un microscopio de fluorescencia regular.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td>, <td>tanto Hoechst 33258 como Hoechst 33342 también funcionan bien,</td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td>, OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Kim Wipe</td>, <td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td>, tejido blando</td></tr>, <tr><td>Zeiss&nbsp; </td><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>AX10 Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Software de microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td> Cámara <td>digital</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel</td><td></td><td></td><td></td>de esmalte de uñas transparente</tr><tr><td>60 mm placas de Petri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de</td><td></td><td></td><td></td>vidrio</tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de vidrio 1-20 y micro; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20-200 y micro; L pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200-1000 y micro; pipeta</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>1-200 y micro; L puntas</td><td></td><td></td><td></td>de pipeta</tr><tr><td>200-1000 y micro; Puntas</td><td></td><td></td><td></td>de pipeta en L</tr>, <tr><td>tubos de</td><td></td><td></td><td></td>microcentrífuga de 1,5 mL</tr>, <tr><td>púa helicoidal</td><td></td><td></td><td></td> de alambre de platino</tr></tbody></table>

detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-diamidino-2-phenylindole coloración en caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

En este protocolo, una proteína de fusión de fluorescencia verde (GFP) de proteína y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción se utilizan para el seguimiento de los cambios de localización subcelular de proteínas; en particular, una translocación nuclear bajo un calor estrés condición. Las proteínas reaccionan señales correspondientemente a internos y externas. Un mecanismo común es cambiar su localización subcelular. Este artículo describe un protocolo para el seguimiento de localización de la proteína que no requieren un anticuerpo etiquetado radiactivo y un microscopio confocal. En este artículo, GFP se utiliza para etiquetar la proteína diana EXL-1 de C. elegans, un miembro de la familia de proteínas (Predescargado) cloruro canal intracelular, incluyendo CLIC4 mamíferos. Una línea transgénica de traslación integrado exl-1::gfp (con un promotor y una secuencia del gen completo) fue creada por transformación y γ-radiación y estable expresa el gene y gfp. Recientes investigaciones demostraron que al estrés por calor, el estrés oxidativo no, EXL-1::GFP se acumula en el núcleo. Superposición de la señal GFP con la estructura de los núcleos y el DAPI señales confirma los cambios de la localización subcelular de EXL-1 bajo estrés. Este protocolo presenta dos métodos de fijación diferentes para tinción DAPI: fijación fijación del etanol y acetona. El protocolo de tinción DAPI presentado en este artículo es rápido y eficiente y conserva la señal GFP y los cambios de localización subcelular de la proteína. Este método sólo requiere un microscopio de epifluorescencia con un filtro DAPI, Nomarski y un filtro FITC. Es conveniente para un ambiente pequeño laboratorio, investigación de estudiante de pregrado, investigación de estudiante de secundaria y aulas de biotecnología.

Cloruro canal intracelular proteínas (CLIC) son proteínas multifuncionales que están muy conservadas entre especies12. Muchas investigaciones se muestran que Predescargado regula el estrés celular, autofagia, apoptosis, carcinogénesis, angiogénesis y la respuesta inmune innata de macrófagos en el sistema mamífero13,14,15,16 ,<...

Este protocolo muestra cómo realizar el seguimiento un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor usando una fluorescencia verde (GFP) fusion proteína como marcador y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. El protocolo de tinción de DAPI es rápido y conserva las señales de localización subcelular de GFP y proteína.

Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de C. elegans, como la biología celular. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida y eficiente para obtener señales de tinción nuclear, GFP y cambios en la localización subcelular simultáneamente. Para empezar, genere una matriz extracromosómica alineada con una construcción traslacional de genes diana.Alternativamente, obtenga dichas líneas del Centro Genético de Caenorhabditis, que es un recurso público para la investigación de C. elegans. O bien, de un laboratorio de investigación previamente publicado. Después de exponer los gusanos a la radiación gamma para integrar las líneas extracromosómicas en el genoma, seleccione las líneas expresadas de manera estable para que cada animal exprese una proteína marcadora como una GFP o un rodillo.Para eliminar las mutaciones generadas durante la radiación, cruce las líneas al menos dos veces. Utilice la línea transgénica resultante para detectar cambios en el patrón de expresión de proteínas bajo estrés. A continuación, después de preparar las placas de gusano NGM de acuerdo con el protocolo de texto, raye un clon OP50 y cultive las bacterias en caldo LB líquido durante la noche.Siembre las placas NGM con cultivo líquido OP50 e incube las placas en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche para cultivar césped bacteriano como fuente de alimento para los gusanos. Enfríe las placas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de usarlas. Cultivar la línea transgénica a 20 grados Celsius sin inanición, durante al menos dos generaciones antes del ensayo de estrés por calor.Escoja de ocho a diez adultos jóvenes y grávidos para una nueva placa de gusano. Luego déjelos poner huevos durante unas tres a cinco horas y retire todos los adultos de los platos. Para sincronizar los gusanos, deje que los huevos eclosionen y crezcan las larvas durante aproximadamente 48 horas hasta la cuarta etapa larvaria o L4.Eso se puede identificar por la vulva, que es una estructura en forma de media luna. A continuación, estrese por calor a los gusanos incubando las placas con las larvas L4 a 35 grados centígrados durante dos a cinco horas. Incluya un termómetro en una incubadora para medir con precisión la temperatura.Pipetea 10 microlitros de M9 en el centro de un portaobjetos de vidrio. A continuación, recoge los gusanos con choque térmico y transfiérelos a la gota de tampón. Alternativamente, use M9 para lavar los gusanos del plato.A continuación, centrifugar la muestra a 1000 veces la gravedad a temperatura ambiente durante un minuto. Deseche el sobrenadante, luego agregue los gusanos al portaobjetos de vidrio. Bajo un microscopio de disección, use un pañuelo blando para drenar el exceso de líquido.Luego, mientras aún está bajo el microscopio, agregue 10 microlitros de alcohol al 95% sobre los gusanos y continúe observándolos. Inmediatamente después de que el etanol se seque, repita la adición de etanol dos veces más. Es fundamental para el proceso de evaporación del etanol de los animales bajo el microscopio de disección.Una vez que el etanol se desprenda de los animales, proceda inmediatamente al siguiente paso. Agregue 10 microlitros de DAPI a los gusanos. Aplique inmediatamente un cubreobjetos y selle el portaobjetos con gel de esmalte de uñas transparente.Después de dejar que el esmalte de uñas se asiente durante aproximadamente 10 minutos, observe a los animales bajo un microscopio de fluorescencia. Para fijar animales con acetona, use M9 para lavar la placa de choque térmico y centrifugar la muestra a 1000 veces la gravedad a temperatura ambiente durante un minuto. Deseche el sobrenadante y use un mililitro de agua destilada para lavar el pellet.Después de retirar el sobrenadante, añadir 400 microlitros de acetona al 30% e incubar la muestra durante 15 minutos. Luego centrifuga el tubo a 1000 veces la gravedad a temperatura ambiente durante un minuto. Después de desechar el sobrenadante, use 500 microlitros de agua destilada para lavar a los animales dos veces.Agregue 200 microlitros de DAPI al pellet, o cuatro veces la cantidad del volumen total de lombrices al tubo, e incube la muestra durante 15 minutos. Centrifugar la muestra y desechar el sobrenadante. A continuación, utilice 500 microlitros de agua destilada para lavar el pellet dos veces antes de montarlo y obtener imágenes como antes.Para realizar imágenes, encienda la fuente de luz UV y el microscopio de fluorescencia. A continuación, encienda el ordenador conectado al microscopio. Cargue el portaobjetos en el microscopio de fluorescencia.Use una lente de objetivo 10X para localizar los gusanos. A continuación, aumente la potencia de aumento a 400X y concéntrese en la muestra. A continuación, abra el software suministrado con el microscopio.Haga clic en Adquisición, luego haga clic en Cámara y seleccione la cámara conectada al microscopio. En la misma Adquisición, haga clic en Adquisición multidimensional. Se abrirá una nueva ventana de navegación de Adquisición multidimensional.Haga clic en el botón multicanal y aparecerán todos los canales disponibles. Elija azul, verde y DIC para observar el espécimen. En la ventana de navegación Adquisición multidimensional, deje activados los canales DAPI azul, GFP verde y DIC gris, y haga clic con el botón derecho en otros canales, como Rhodamine rojo y Brightfield blanco, para cerrarlos.Para medir el tiempo de exposición para cada canal, haga clic con el botón izquierdo en el canal DAPI azul para seleccionarlo y haga clic en medir" para tomar una imagen en vivo con un tiempo de exposición automatizado. En el lado izquierdo de la ventana de imagen en vivo, ajuste manualmente el tiempo de exposición si lo desea, luego haga clic en Aceptar. Configure los tiempos de exposición para los canales GFP y DIC de manera similar. En la ventana de navegación de Adquisición Multidimensional, haga clic en "Inicio"para recopilar automáticamente tres imágenes en los tres canales diferentes, en orden, con los tiempos de exposición establecidos.Para guardar el archivo, en el menú principal, haga clic en Archivo, Guardar como.Ingrese el nombre del archivo y la carpeta. Guarde el archivo como el formato de archivo predeterminado para conservar la información detallada de la imagen para futuras referencias. Para exportar el archivo en otros formatos, en Archivo, haga clic en Exportar.Establezca el nombre del archivo y la carpeta. Marque Crear una carpeta de proyecto"para organizar mejor los datos. Después de elegir el tipo de archivo deseado en el menú desplegable, haga clic en Inicio"para exportar.Hay dos proteínas homólogas del canal intracelular de cloruro en C. elegans, exl-1 y exc-4. Un estudio reciente demostró que exl-1 regula el manejo del estrés animal. Aquí, se integró una construcción traslacional de exl-1 GFP en un genoma animal y se crearon líneas transgénicas, que expresan de manera estable el fluorescente verde exl-1.Bajo estrés térmico, exl-1 GFP se acumula en el núcleo de la región intestinal a medida que una fuerte señal de GFP se superpone con el núcleo. Para confirmar la localización subcelular de exl-1, se llevó a cabo la tinción con DAPI tanto en animales fijados con etanol como en acetona. Ambos métodos muestran núcleos claros en el cuerpo del animal y las señales superpuestas de GFP y DAPI confirman que exl-1 GFP efectivamente se acumuló en los núcleos de la región intestinal.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una fijación rápida para preservar la señal GFP y la translocación nuclear de proteínas bajo estrés en C. elegans.

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Investigación

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Biology

Biología

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Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4, 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal

Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans

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