Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans
30 de julio de 2018
Este protocolo muestra cómo realizar el seguimiento un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor usando una fluorescencia verde (GFP) fusion proteína como marcador y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. El protocolo de tinción de DAPI es rápido y conserva las señales de localización subcelular de GFP y proteína.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de C. elegans, como la biología celular. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida y eficiente para obtener señales de tinción nuclear, GFP y cambios en la localización subcelular simultáneamente. Para empezar, genere una matriz extracromosómica alineada con una construcción traslacional de genes diana.
Alternativamente, obtenga dichas líneas del Centro Genético de Caenorhabditis, que es un recurso público para la investigación de C. elegans. O bien, de un laboratorio de investigación previamente publicado. Después de exponer los gusanos a la radiación gamma para integrar las líneas extracromosómicas en el genoma, seleccione las líneas expresadas de manera estable para que cada animal exprese una proteína marcadora como una GFP o un rodillo.
Para eliminar las mutaciones generadas durante la radiación, cruce las líneas al menos dos veces. Utilice la línea transgénica resultante para detectar cambios en el patrón de expresión de proteínas bajo estrés. A continuación, después de preparar las placas de gusano NGM de acuerdo con el protocolo de texto, raye un clon OP50 y cultive las bacterias en caldo LB líquido durante la noche.
Siembre las placas NGM con cultivo líquido OP50 e incube las placas en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche para cultivar césped bacteriano como fuente de alimento para los gusanos. Enfríe las placas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de usarlas. Cultivar la línea transgénica a 20 grados Celsius sin inanición, durante al menos dos generaciones antes del ensayo de estrés por calor.
Escoja de ocho a diez adultos jóvenes y grávidos para una nueva placa de gusano. Luego déjelos poner huevos durante unas tres a cinco horas y retire todos los adultos de los platos. Para sincronizar los gusanos, deje que los huevos eclosionen y crezcan las larvas durante aproximadamente 48 horas hasta la cuarta etapa larvaria o L4.
Eso se puede identificar por la vulva, que es una estructura en forma de media luna. A continuación, estrese por calor a los gusanos incubando las placas con las larvas L4 a 35 grados centígrados durante dos a cinco horas. Incluya un termómetro en una incubadora para medir con precisión la temperatura.
Pipetea 10 microlitros de M9 en el centro de un portaobjetos de vidrio. A continuación, recoge los gusanos con choque térmico y transfiérelos a la gota de tampón. Alternativamente, use M9 para lavar los gusanos del plato.
A continuación, centrifugar la muestra a 1000 veces la gravedad a temperatura ambiente durante un minuto. Deseche el sobrenadante, luego agregue los gusanos al portaobjetos de vidrio. Bajo un microscopio de disección, use un pañuelo blando para drenar el exceso de líquido.
Luego, mientras aún está bajo el microscopio, agregue 10 microlitros de alcohol al 95% sobre los gusanos y continúe observándolos. Inmediatamente después de que el etanol se seque, repita la adición de etanol dos veces más. Es fundamental para el proceso de evaporación del etanol de los animales bajo el microscopio de disección.
Una vez que el etanol se desprenda de los animales, proceda inmediatamente al siguiente paso. Agregue 10 microlitros de DAPI a los gusanos. Aplique inmediatamente un cubreobjetos y selle el portaobjetos con gel de esmalte de uñas transparente.
Después de dejar que el esmalte de uñas se asiente durante aproximadamente 10 minutos, observe a los animales bajo un microscopio de fluorescencia. Para fijar animales con acetona, use M9 para lavar la placa de choque térmico y centrifugar la muestra a 1000 veces la gravedad a temperatura ambiente durante un minuto. Deseche el sobrenadante y use un mililitro de agua destilada para lavar el pellet.
Después de retirar el sobrenadante, añadir 400 microlitros de acetona al 30% e incubar la muestra durante 15 minutos. Luego centrifuga el tubo a 1000 veces la gravedad a temperatura ambiente durante un minuto. Después de desechar el sobrenadante, use 500 microlitros de agua destilada para lavar a los animales dos veces.
Agregue 200 microlitros de DAPI al pellet, o cuatro veces la cantidad del volumen total de lombrices al tubo, e incube la muestra durante 15 minutos. Centrifugar la muestra y desechar el sobrenadante. A continuación, utilice 500 microlitros de agua destilada para lavar el pellet dos veces antes de montarlo y obtener imágenes como antes.
Para realizar imágenes, encienda la fuente de luz UV y el microscopio de fluorescencia. A continuación, encienda el ordenador conectado al microscopio. Cargue el portaobjetos en el microscopio de fluorescencia.
Use una lente de objetivo 10X para localizar los gusanos. A continuación, aumente la potencia de aumento a 400X y concéntrese en la muestra. A continuación, abra el software suministrado con el microscopio.
Haga clic en Adquisición, luego haga clic en Cámara y seleccione la cámara conectada al microscopio. En la misma Adquisición, haga clic en Adquisición multidimensional. Se abrirá una nueva ventana de navegación de Adquisición multidimensional.
Haga clic en el botón multicanal y aparecerán todos los canales disponibles. Elija azul, verde y DIC para observar el espécimen. En la ventana de navegación Adquisición multidimensional, deje activados los canales DAPI azul, GFP verde y DIC gris, y haga clic con el botón derecho en otros canales, como Rhodamine rojo y Brightfield blanco, para cerrarlos.
Para medir el tiempo de exposición para cada canal, haga clic con el botón izquierdo en el canal DAPI azul para seleccionarlo y haga clic en medir" para tomar una imagen en vivo con un tiempo de exposición automatizado. En el lado izquierdo de la ventana de imagen en vivo, ajuste manualmente el tiempo de exposición si lo desea, luego haga clic en Aceptar. Configure los tiempos de exposición para los canales GFP y DIC de manera similar. En la ventana de navegación de Adquisición Multidimensional, haga clic en "Inicio"para recopilar automáticamente tres imágenes en los tres canales diferentes, en orden, con los tiempos de exposición establecidos.
Para guardar el archivo, en el menú principal, haga clic en Archivo, Guardar como.Ingrese el nombre del archivo y la carpeta. Guarde el archivo como el formato de archivo predeterminado para conservar la información detallada de la imagen para futuras referencias. Para exportar el archivo en otros formatos, en Archivo, haga clic en Exportar.
Establezca el nombre del archivo y la carpeta. Marque Crear una carpeta de proyecto"para organizar mejor los datos. Después de elegir el tipo de archivo deseado en el menú desplegable, haga clic en Inicio"para exportar.
Hay dos proteínas homólogas del canal intracelular de cloruro en C. elegans, exl-1 y exc-4. Un estudio reciente demostró que exl-1 regula el manejo del estrés animal. Aquí, se integró una construcción traslacional de exl-1 GFP en un genoma animal y se crearon líneas transgénicas, que expresan de manera estable el fluorescente verde exl-1.
Bajo estrés térmico, exl-1 GFP se acumula en el núcleo de la región intestinal a medida que una fuerte señal de GFP se superpone con el núcleo. Para confirmar la localización subcelular de exl-1, se llevó a cabo la tinción con DAPI tanto en animales fijados con etanol como en acetona. Ambos métodos muestran núcleos claros en el cuerpo del animal y las señales superpuestas de GFP y DAPI confirman que exl-1 GFP efectivamente se acumuló en los núcleos de la región intestinal.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una fijación rápida para preservar la señal GFP y la translocación nuclear de proteínas bajo estrés en C. elegans.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo demuestra cómo rastrear la translocación nuclear de una proteína bajo estrés térmico utilizando una proteína de fusión GFP como marcador y la tinción con DAPI. El método es rápido y eficiente, lo que permite la observación simultánea de los cambios en la tinción nuclear y en la localización subcelular.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Neurociencia
- Genética
Antecedentes
- Comprender la localización proteica es fundamental en biología celular.
- El estrés por calor puede afectar la translocación y localización de proteínas.
- Las proteínas de fusión GFP son marcadores valiosos para rastrear proteínas.
- La tinción con DAPI proporciona un método para visualizar núcleos.
Objetivo del estudio
- Seguir la translocación nuclear de proteínas bajo estrés térmico.
- Utilizar GFP como marcador para la localización de proteínas.
- Mostrar un protocolo rápido para tinción con DAPI.
Métodos Utilizados
- Generación de matrices extracromosómicas con construccos de traducción.
- Exposición de C.elegans a radiación gamma para la integración.
- Selección de líneas con expresión estable mediante proteínas marcadoras.
- Observación simultánea de la localización nuclear y subcelular.
Resultados principales
- Seguimiento exitoso de la translocación nuclear bajo estrés térmico.
- Visualización eficiente de la tinción con GFP y DAPI.
- Se demostró la eficacia del protocolo en C.elegans.
- Proporcionó información sobre la dinámica de localización proteica.
Conclusiones
- El protocolo es una herramienta valiosa para estudiar la dinámica de proteínas.
- Los métodos rápidos y eficientes mejoran la investigación en biología celular.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a otras condiciones de estrés.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite un seguimiento rápido y sin anticuerpos de los cambios en la localización subcelular de proteínas en respuesta al estrés, lo que apoya la validación temprana de dianas en flujos de trabajo de descubrimiento. Al combinar la etiqueta GFP con la tinción nuclear con DAPI, proporciona una confirmación cuantitativa y visual de eventos de translocación, como la acumulación nuclear bajo estrés térmico, que puede orientar la reducción de riesgos mecanicistas de hipótesis terapéuticas. La compatibilidad del método con microscopios de fluorescencia estándar lo hace accesible para la preparación de cribados de alto rendimiento y su uso por equipos multidisciplinarios en entornos de I+D biofarmacéutica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la observación directa de la translocación de proteínas inducida por estrés, lo que apoya la validación funcional de dianas y el análisis de vías.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de anticuerpos o etiquetas radiactivas, reduciendo el tiempo y costo del desarrollo del ensayo.
- Valor predictivo: Confirma los cambios en la localización subcelular que podrían indicar el mecanismo de acción o la modulación de la respuesta al estrés.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Preparación del ensayo: Genera líneas transgénicas estables que expresan proteínas marcadas con GFP para plataformas de cribado consistentes y reproducibles.
- Salida cuantitativa: Permite la medición simultánea de la señal de GFP y la tinción nuclear con DAPI para análisis de co-localización.
- Escalabilidad: Compatible con microscopía de fluorescencia estándar, lo que permite su adaptación a formatos de múltiples pocillos para cribado de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Rastrea la localización de EXL-1, una proteína de la familia CLIC con homólogos en mamíferos (por ejemplo, CLIC4), lo que apoya la evaluación traslacional del objetivo.
- Reducción mecanicista de riesgos: Confirma la translocación nuclear bajo estrés térmico, pero no bajo estrés oxidativo, ayudando a definir el comportamiento específico del objetivo según la condición.
- Continuidad preclínica: Proporciona un sistema reutilizable para evaluar la dinámica proteica en distintas condiciones de estrés antes de la validación in vivo.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este método se enmarca dentro del continuo de descubrimiento que va desde la comprobación de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos iniciales, especialmente para proteínas que responden al estrés. Permite tomar decisiones tempranas de continuar o descartar un enfoque, validando la interacción con la diana y la dinámica subcelular antes de realizar campañas de cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Prueba hipótesis terapéuticas mediante la visualización de cambios en la localización proteica bajo condiciones definidas de estrés.
- Tamizaje: Prepara sistemas celulares validados para el tamizaje de bibliotecas de compuestos con lecturas integradas de localización.
- Análisis: Genera datos de co-localización (superposición GFP/DAPI) como salida cuantitativa para evaluar los efectos de compuestos en el tráfico proteico.
- Investigación Traducional: Relaciona hallazgos en C. elegans con sistemas de mamíferos mediante proteínas CLIC conservadas, apoyando la validación cruzada de especies de dianas terapéuticas.
- Reutilización Empresarial: Establece una tubería modular y reutilizable para rastrear la dinámica subcelular de cualquier proteína marcada con GFP bajo estrés o exposición a compuestos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al proporcionar evidencia visual directa de la translocación de proteínas en contextos de células vivas.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de fijación e imagen entre distintos equipos, mejorando la reproducibilidad y reduciendo la variabilidad.
- Valor estratégico: Acelera los plazos de validación de dianas, permitiendo una triage más rápida del portafolio y reduciendo la inversión en dianas falsas positivas.
- Impacto en el portafolio: Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la confirmación del comportamiento de la diana en modelos de estrés relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de C. elegans, generación de líneas transgénicas y microscopía de fluorescencia.
- Depende del acceso a un microscopio de fluorescencia con filtros para FITC y DAPI y óptica Nomarski.
- Necesita la estandarización del tiempo de fijación (etanol/acetona) y tinción para preservar la señal de GFP y garantizar una marcación nuclear consistente con DAPI.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir la optimización de la fuerza del promotor, la eficiencia de marcado y los paradigmas de estrés.
- Limitación práctica: es más adecuado para proteínas con translocación detectable; puede no resolver eventos rápidos o transitorios de transporte sin imágenes en vivo.
