Name: En Vivo Photolabeling de las células en el Colon para evaluar potencial migratorio de las células hematopoyéticas en ratones neonatales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende fotomarcado in vivo de células del colon en ratones neonatales para evaluar el potencial migratorio de células hematopoyéticas. Esta técnica permite rastrear patrones de tráfico celular hacia sitios extra-intestinales.

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Nitya Jain fue apoyada por un premio de transición de carrera de NIH/NIAID 1K22AI116661-01.

Animales todos los procedimientos fueron realizados con la aprobación de y de acuerdo con el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Hospital General de Massachusetts.
PRECAUCIÓN: Este protocolo implica el uso de un láser de clase 3b (LG3). LG3 gafas láser siempre deben utilizarse al utilizar este láser. Deben seguirse las directrices apropiadas de capacitación y seguridad para evitar el riesgo de lesiones.
1. diseño y montaje de láser
<ol><li>Conecte el diodo electroluminoso (LED) (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, fibra) para el controlador de LED vía el cable de conector M8 de 4 pines que viene conectado al LED. Con cuidado apriete el tornillo para fijar la conexión.</li>
	<li>Antes de conectar el cable de parche optogenetics al LED, sujete el conector de no apertura del LED a la luz para asegurarse de que están obstrucciones visibles. Golpe en el hoyo para eliminar obstrucciones e inserte el cable de parche optogenetics en la abertura.</li>
	<li>Conectar la cánula de fibra óptica a cable del remiendo optogenetics insertando la cánula en cada extremo de la funda del conector. Conecte el otro extremo de la funda del conector para el cable de interconexión.  Aplicar suficiente presión para asegurar la conexión pero tenga cuidado de no doblar o romper la fibra óptica en la cánula. Nota: La cánula de frágil de la fibra óptica está cubierta con el capuchón protector cada vez que el láser no está en uso.</li>
	<li>Configurar el controlador de LED al modo de onda continua (CW) con la perilla de ajuste continuo en 0 y el límite actual establecido a 1,2 A.</li>
</ol>2. Photoconversion de las células en el Colon
Nota: Ratones machos y hembras fueron expuestas a la intracolonic 405 nm luz 1-2 días después de su nacimiento y se sacrificaban antes de 1 semana de edad.
<ol><li>Fije un lugar obscuro con un acceso a una toma de corriente. Conecte el conductor del LED en la salida. Nota: Este procedimiento se realiza en la mínima luz blanca ya que una larga exposición de los ratones a la luz ambiental puede causar un photoconversion no deseado de las células. La luz roja se utiliza como una alternativa. PRECAUCIÓN: El siguiente paso implica el uso de un anestésico animal. La administración de la anestesia lleva a cabo en una campana de clase II o mediante otro sistema de depuración adecuado. La inhalación de la anestesia puede causar mareos, somnolencia o incluso pérdida del conocimiento.</li>
	<li>Anestesiar el ratón por la exposición a 4-5% de isoflurano en 100% O2 en una caja de inducción. Verificar la adecuada profundidad de la anestesia firmemente pellizcando una pata trasera (sin respuesta). Mantener anestesia mediante un cono de nariz en aproximadamente 2% de isoflurano. Evitar la exposición de controlador al isoflurano por uso de una adecuada campana o dispositivo de depuración anestésico.</li>
	<li>Coloque el ratón anestesiado para la exposición de intracolonic con 1 mano al pescuezo la parte posterior del ratón suavemente con el dedo índice y el pulgar. Poner el mouse al exponer el abdomen. Afloje la empuñadura si el ratón comienza a perder su color rosa o si su tasa de respiración comienza a disminuir. Asegure la cola del ratón entre el anillo y los pequeños dedos.</li>
	<li>Con la otra mano, retire la tapa protectora de la cánula. Manteniendo el eje longitudinal de la cánula paralela a la línea media del ratón, inserte suavemente la cánula de fibra óptica a través del ano en el colon para que todos los 5 mm de la fibra óptica están dentro del ratón. Nota: Este procedimiento se realiza lentamente y con cuidado de no perforar la pared colónica. Minutos moviendo y girando de la cánula del SIDA el adelanto en el colon.</li>
	<li>Ponga las gafas de seguridad y aumentar el láser actual hasta el valor máximo (completamente hacia la derecha). Mirando el abdomen traslúcido del ratón para confirmar la presencia de luz ultravioleta. Nota: Las gafas de seguridad de láser LG3 disminuyen considerablemente la visibilidad. Con un colega (usar equipo protector) ayudar a ponerse las gafas y encender el láser.</li>
	<li>Exponer los dos puntos a la luz del láser para un total de 2 minutos retirar la cánula de aproximadamente 1 mm cada 30 s para maximizar el área luminal expuesto a la luz. Al final de 2 minutos, apague el láser.</li>
	<li>Lentamente retire la cánula del ratón. Después de recuperarse de la anestesia en una jaula caliente vacía, devolver el ratón a la estructura de la casa.</li>
</ol>3. aislamiento de los linfocitos intestinales
<ol><li>Preparar 1 L de tampón de la madeja sal equilibrada solución/becerro suero (HBSS/CS), 200 mL de tampón de la franja epitelial, 500 mL de medio de lavado y 200 mL de ácido etilendiaminotetracético (EDTA)-libre de los medios de lavado. Nota: Los volúmenes de reactivo se calculan un tamaño de muestra de 9.<ol>
<li>Hacer el tampón HBSS/CS (HBSS; 5% CS) mediante la adición de 50 mL de CS a 950 mL de HBSS. Guárdelo en hielo.</li>
		<li>Preparar la memoria intermedia de la franja epitelial [HBSS; 5% CS 1 mM Ditiotreitol (DTT), EDTA 5 mM; mM 15 4-(2-Hydroxyethyl) piperazina-1-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (HEPES) (pH 7.2-7.5)] añadiendo 10 mL de CS, 200 μL de TDT, 2 mL de EDTA de 0,5 M y 3 mL de tampón de HEPES de 1 M 1 M y 185 mL de HBSS. Colocar el buffer de la franja epitelial en un baño de agua de 37 ° C.</li>
		<li>Hacer los medios de lavado (HBSS; % 1 CS y 1 mM EDTA) añadiendo 5 mL de CS y 1 mL de EDTA de 0.5 M a 494 mL de HBSS. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar los medios de lavado libre de EDTA (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES) añadiendo 2 mL de CS y 3 mL de 1 M HEPES y 195 mL de HBSS. Almacenar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Hacer un tampón FACS [1 x de tampón fosfato salino (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] añadiendo 10 mL de CS y 490 mL de PBS. Guárdelo en hielo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparar el plato de la colección de tejido mediante la colocación de un filtro de célula 70 μm dentro de una placa de cultivo de 60 x 10 mm. Añadir 10 mL de tampón HBSS/CS (HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 y almacenados en hielo) al plato y coloque en el hielo.</li>
	<li>Eutanasia el ratón a través de una sobredosis de isoflurano inhalado mediante compactación adecuada de anestésico (una exposición de min aproximadamente 3 a > 4% de isoflurano en el aire o en el 100% O2). Después de la aparente cesación de la respiración y reflejo movimiento, verificar la ausencia de dolor profundo firmemente pellizcando una pata trasera (se recomienda usar pinzas). Asegúrese de que la eutanasia a través de una decapitación con un par de tijeras quirúrgicas o una nueva maquinilla de afeitar recta. Nota: La dislocación Cervical no se recomienda para este paso debido al tamaño y edad del animal. Estos métodos son consistentes con las pautas de AVMA de 2013 sobre la eutanasia y aprobaron por el IACUC MGH.</li>
	<li>La cosecha del colon con pinzas limpias y tijeras para abrir el abdomen. Reflejan los intestinos a 1 lado del abdomen del ratón para exponer los dos puntos. Quitar el colon entero por primera transecting lo apenas distal (hacia el ano) para el ciego. Luego, mientras agarra con firmeza el colon con pinzas, use tijeras para cortar a través de la uretra al recto. Corte del colon como cerca del ano como sea posible. Cosecha el bazo después de quitar los dos puntos (véase los pasos 4.1-4.2 más abajo). Nota: Mientras que el protocolo de photoconversion sólo objetivos de ~ 25% de puntos del recién nacido (5 mm de la cánula de fibra óptica), se cosecha todo el colon para ayudar en el aislamiento de células.</li>
	<li>Limpiar el colon mediante el uso de fórceps para empujar el contenido de los dos puntos y en una toalla de papel seca. Homogeneizar el tejido mediante el uso de hojas de afeitar para picar el colon en una goma en la cubierta de una placa de cultivo y luego transferir la pasta a la coladera del celular en la caja Petri.</li>
	<li>Agregar una barra de agitación magnética durante mucho tiempo de limpieza 8 mm a la coladera y coloque el plato en un plato agitador magnético de 9 posiciones. Ajustar la velocidad de la barra de agitación magnética a 800 rpm e incube las células durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el búfer y repetir el lavado con 10 mL de HBSS/CS (la HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 y almacenados en hielo). Deseche el búfer al final del lavado.</li>
	<li>Disociar las células epiteliales mediante la adición de 10 mL de tampón de la franja epitelial precalentado (la HBSS; 5% CS 1mM TDT, 5mM EDTA; buffer HEPES [pH 7.2-7.5] de 15mM que se hizo en el paso 3.1.2 y almacenado en un baño de agua de 37 ° C) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 30 min en un 3 7 ° C la incubadora. Al final de la incubación, transferir el búfer enriquecido en la fracción epitelial a un tubo limpio de 15 mL. Nota: El epitelio y las células asociadas (intestinales células epiteliales y los linfocitos epiteliales intestinales) son liberadas en el buffer, mientras que las células en el intacto propria de la lámina quedan en el colador de la célula durante este paso11.<ol>
<li>Centrifugar la fracción epitelial intestinal enriquecida (IELs) 700 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón FACS. Almacenar en el hielo para su uso en el paso 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave la fracción de lámina propia dentro de la coladera de la célula 2 x con HBSS/CS. Para ello, añadir 10 mL de solución de HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% que se hizo en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 5 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.</li>
	<li>Lavar la muestra 2 x en medios de lavado. Añadir 10 mL de medio de lavado (HBSS; 1% CS y tampón de EDTA 1 mM que se hizo en el paso 3.1.3 y almacenado a temperatura ambiente) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 15 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.<ol>
<li>Después de usar los medios de lavado, tienda en el hielo para el uso en paso 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavar la muestra 2 x con HBSS CS añadir 10 mL de tampón HBSS/CS (HBSS; 5% CS almacenador intermediario en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 5 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.</li>
	<li>Incubar el tejido en tampón de lavado libre de EDTA. Añadir 10 mL de tampón de lavado libre de EDTA (HBSS; 1% CS y 15 mM de tampón HEPES con que fue hecha en el paso 3.1.4 y almacenado a temperatura ambiente) a la coladera de la célula e incubar la placa por 10 min a temperatura ambiente sin revolver. Deseche el búfer al final de este paso.</li>
	<li>Lavar la muestra 2 x con HBSS/CS y prepare la solución de enzima. Añadir 10 mL de HBSS/CS (HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) de búfer a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 10 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.<ol>
<li>Preparar la solución de enzima (EDTA libre lavado Tampón; 0,1 mg/mL DNasa I; colagenasa 167 mg/mL) durante el segundo período de lavado: Añadir 9 mg de DNasa I y 15 mg de liofilizado colagenasa a 90 mL de EDTA tapón de lavaje. Almacenar la solución a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Digerir la fracción de lámina propia contenida en el filtro de la célula para obtener linfocitos de lámina propia (LPLs). Añadir 10 mL de la solución de enzima (el EDTA libre tampón de lavado; 0,1 mg/mL DNasa I; 167 mg/mL de tampón de colagenasa en paso 3.12.1 y almacenados a temperatura ambiente) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 45 minutos en una incubadora de 37 ° C. Nota: LPLs se liberan en la solución después de la digestión enzimática.<ol>
<li>Recoger la solución de enzima que contiene las células y filtrar con un filtro nuevo de celular en un tubo cónico de 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Añadir 20 mL de medio de lavado fría (la HBSS; CS 1%, EDTA 1mM tampón hecho en paso 3.1.3 y almacenados en hielo en el paso 3.9.1) a las células de filtrado para bloquear la actividad de la colagenasa en la solución de enzima. Centrifugar el tubo a 700 x g durante 6 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene LPLs en 1 mL de tampón FACS.</li>
	<li>Combinar la IEL (del paso 3.7.1) y las fracciones de la LPL (del paso 3.14) y tinción con anticuerpos conjugados con fluorescente para el análisis de citometría de flujo (ver paso 5). Nota: IEL y LPL fracciones pueden ser manchados por separado si se desea información del compartimiento.</li>
</ol>4. aislamiento de linfocitos de bazo
<ol><li>Preparar el tubo de la colección agregando 500 μl de tampón FACS en un tubo de microcentrífuga. Almacenar en el hielo.</li>
	<li>Después de quitar los dos puntos (paso 3.4), cosecha del bazo entero y colocarlo en el tubo de la colección. Guarde el tejido en el hielo.</li>
	<li>Utilizando un homogenizador de tejido eléctrico, homogeneizar el bazo en un tubo de microcentrífuga durante aproximadamente 1 minuto centrifugar la muestra a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante.</li>
	<li>Realizar la lisis de glóbulos rojos por Resuspender la muestra de 500 μl de tampón de lisis (ACK) de amonio cloruro de potasio para iniciar la muerte celular por lisis osmótica. Permita que la muestra Incubar 1-2 min a temperatura ambiente y luego lo resuspender en 725 μl de tampón FACS.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 500 μl de tampón FACS y filtrar a través de un tamiz de 40 μm células en un tubo nuevo de microcentrífuga. Transferir toda la muestra a un tubo nuevo de microcentrífuga y tinción con anticuerpos conjugados con fluorescente para el análisis de citometría de flujo (ver paso 5).</li>
</ol>5. identificación de Dendra-r+ citometría de flujo utilizando las células
<ol><li>Centrifugar las muestras a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante IEL/LPL y del bazo.</li>
	<li>Resuspender el pellet en 100 μl de mezcla de la coloración del anticuerpo. Preparar el anticuerpo coloración mezcla añadiendo 1 μl de anticuerpo anti-CD45 conjugado fluorescente a 100 μl de tampón FACS por muestra. Nota: Es importante valorar los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo antes del experimento para determinar la concentración óptima donde se produce la saturación de enlace.</li>
	<li>Incubar las muestras durante 35 min en hielo (en un lugar obscuro).</li>
	<li>Resuspender las muestras en 300 μL de tampón FACS y centrifugar a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las muestras en 325 μl de tampón FACS. Analizar las muestras en un citómetro de flujo.</li>
</ol>

<ol><li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li>
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<li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50, 833-843 (2012).</li>
<li>Conway, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG5+regulates+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ATG5 regulates plasma cell differentiation.</a> Autophagy. 9, 528-537 (2013).</li>
<li>Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li>
<li>Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Adoptive+Transfer+of+Group+3+Gut+Innate+Lymphoid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).</li>
<li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La identificación y caracterización de células que interactúan con y son influenciados por la microbiota del colon son importantes y deben facilitar la comprensión de cómo información del microambiente de la mucosa se transmitió al resto del cuerpo. Un método para estudiar la migración de células de intestino requiere el aislamiento de las células asociadas con tripa, seguida de una transferencia adoptiva en ratones receptores para determinar sus patrones de tejido-autoguiado hacia el blanco y función12...

El tracto gastrointestinal de mamífero alberga cientos de especies de bacterias que existen en una relación simbiótica con el huésped1. Las células inmunes presentes en el medio local hacer una convivencia con estos microbios y establecen una barrera protectora contra invasiones de patógeno. Así, las interacciones bidireccionales entre las células inmunes y la microbiota son críticas para establecer una comunidad de comensal que educa el sistema inmunológico del host y establece el umbral de reactividad inmune a los patógenos. Cambios en la microbiana composición, o disbiosis, pueden perturban la homeostasis inmune y perturban circuitos regulatorios que frenen inflamaciones intestinales llevando a enfermedades inmune-mediadas tales como Diabetes tipo 1 y enfermedad inflamatoria intestinal2,3 .
El período inmediatamente después del nacimiento una única ventana del desarrollo durante el cual las comunidades microbianas intestinales comienzan a establecer al mismo tiempo el sistema inmune madura4. La microbiota postnatal no es estable, con cambios en la composición de la comunidad que ocurren naturalmente y con frecuencia5. Las células inmunes que interaccionan con la microbiota residen en dos localizaciones anatómicas distintas en el intestino - la lámina propia y el epitelio intestinal6. Numerosos tipos de células inmunes están presentes en el intestino, incluyendo los linfocitos (como células T, células B y células linfoides innatas) así como de las células mieloides (que incluyen macrófagos, monocitos y células dendríticas). Estas células, también conocido como células hematopoyéticas, realizan multitud de funciones que preservar la barrera intestinal y mantener la homeostasis.
Además de sus funciones de reguladoras en intestinal, las células inmunes de la mucosa también pueden llevar mensajes microbianos a los sitios extra intestinales regular inmunidad sistémica7,8,9. Esto es un área de creciente interés en la investigación y pone de relieve la necesidad de métodos identificar las células inmunes que migran fuera del tejido intestinal con el fin de sondear su función. El protocolo reportado aquí utiliza un modelo de ratón disponibles en el mercado donde una proteína fluorescente photoconvertible se explota a las células de etiqueta. Ubicuo, PhAMsuprimido ratones expresan una proteína verde fluorescente Dendra2 que esté irreversiblemente fluorescencia roja después de la activación por luz de ultravioleta (UV)10. Utilizando una cánula de fibra óptica para proporcionar luz de 405 nanómetro en el colon de ratones recién nacidos, demostramos que las células hematopoyéticas photoconverted, que originó adentro o tránsito por el colon pueden encontrarse en el bazo.

<table><tbody><tr><td><Diodo emisor de luz (LED)>láser fuerte</></td> fuerteTHORLABS M405FP1 ATENCIÓN: este es un láser de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Clase 3b. Se deben usar gafas de seguridad cuando se usa el láser. Emite una longitud de onda de 405 nm con una corriente de 1400 mA. Está acoplado a la fibra. Acepta conector SMA. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>Controlador LED</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Impulsa una corriente constante de 1200 mA a través del láser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Cable de conexión optogenético</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>Cable de 1 m de longitud con conector SMA. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Cánula de fibra óptica</td><td>Lentes dóricas&nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>Cánula de 5 mm de largo con un diámetro exterior de 500 &micro; m y un diámetro interior de 480 &micro;m. El valor de NA es 0,5. La férula es de circonio, de 1,25 mm de diámetro exterior. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Suministra 15 V con una corriente de 2,4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>Gafas de seguridad láser LG3&nbsp;</td><td>Lentes THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange con 47% de transmisión de luz visible https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>luz roja&nbsp;</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>74327-10 Lámpara de</td><td>15 W https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td><fuerte>Aislamiento de células intestinales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>PRECAUCIÓN: la inhalación de este anestésico puede causar mareos, somnolencia o incluso pérdida del conocimiento. Este anestésico debe usarse en una campana de Clase II. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg libre https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Becerro</td><td>Hyclone AZM 197696</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0,5 M de concentración https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td></td><td>10197777001 ATENCIÓN: nocivo si se ingiere y provoca irritación de la piel. Concentración de 1 M https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Concentración de 1 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>filtro de células de 70 micras</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Barra agitadora micromagnética</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Enjuague con etanol al 70% después de cada uso. Enjuague varias veces con agua destilada antes de cada uso. La barra mide 8 mm de largo con forma octogonal. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Placa de agitación magnética</td><td>Agitadores de laboratorio Corning 440826</td><td></td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Colagenasa</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 Pipeta</td><td>auxiliar Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL pipeta serológica</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>Pipeta serológica de 25 mL</td><td>Falcon</td><td></td><td>357515 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>tubo de centrífuga cónico de 15</td><td>mL Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>tubo de centrífuga cónico de 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>339653 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td><Suspensión >unicelular fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Contiene 1,5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Homogeneizador de tejidos&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Requiere 2 pilas AA. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Consejos para homogeneizadores&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic, puntas de 0,5 mL https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>tampón de lisado ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>filtro de células de 40 micras</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-ratón CD45&nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clon 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Vivo/Muerto</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962<fuerte>Otro</fuerte></td>Maquinilla de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>afeitar cuchillas</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Uso para decapitación. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

en vivo photolabeling de las células en el colon para evaluar potencial migratorio de las células hematopoyéticas en ratones neonatales

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Comunidades bacterianas entéricas se establecen temprano en la vida e influyen en la función y desarrollo de las células inmunes. La microbiota neonatal es susceptible a numerosas influencias externas, incluyendo el uso de antibióticos y dieta, que afecta la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Trastornos como enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) se caracterizan por una afluencia masiva de las células inmunes a los intestinos. Sin embargo, las células inmunológicas condicionadas por la microbiota además pueden emigrar fuera de los intestinos para influir en las respuestas inmunitarias en sitios extraintestinales. Por lo tanto, es necesario identificar y caracterizar las células que lleven mensajes microbianos de los intestinos a sitios distales. Aquí, describimos un método para células de etiqueta en el colon de ratones recién nacidos en vivo que permite su identificación en sitios extra intestinales después de la migración.

Un cable de fibra óptica fue utilizado para entregar luz de 405 nanómetro en los dos puntos de los 2 días de edad PhAMsuprimido ratones. En experimentos anteriores, una exposición de s 30 determinó dar una photoconversion máxima de células de colon con la citotoxicidad mínima (figura 1A). Por lo tanto, alternativamente 30 exposiciones de s de los diferentes segmentos del colon se llevaron a cabo como se describe en el protocolo. De...

El protocolo descrito aquí utiliza un enfoque photolabeling en ratones recién nacidos para identificar específicamente las células inmunes que emigran desde el colon a sitios extraintestinales. Esta estrategia será útil para estudiar las interacciones host microbioma en primeros años de vida.

En Vivo Photolabeling de las células en el Colon para evaluar potencial migratorio de las células hematopoyéticas en ratones neonatales

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología mucosal sobre las interacciones entre el microbioma inmune del huésped neonatal y la mucosa, como por ejemplo si las células transportan mensajes microbianos, y en caso afirmativo, cuáles son esas células. La principal ventaja de esta técnica es que marca de forma no específica e irreversible las células residentes en el colon de ratones lactantes, lo que nos permite determinar sus patrones de migración hacia sitios extraintestinales. Para armar el láser, conecte el diodo emisor de luz, o LED, al controlador del LED mediante el cable conector M8 de cuatro pines del LED y apriete cuidadosamente el tornillo para asegurar la conexión.Sostenga la abertura del conector del LED frente a la luz para asegurarse de que no haya obstrucciones visibles. Inserte el cable de conexión de optogenética en la abertura. Inserte la cánula en cualquiera de los extremos del manguito del conector.Luego, conecte el otro extremo del conector del manguito al extremo del cable de conexión, uniendo la cánula de fibra óptica al cable de conexión de fibra óptica. Utilice el botón de ajuste continuo para configurar el controlador

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En este artículo se describe un método para el etiquetado de la piel embrionaria y los vasos sanguíneos del timo.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

El citomegalovirus (HCMV) La infección humana de los recién nacidos representa una causa importante de retraso mental, pero los eventos moleculares que conducen a la patogénesis inducida por virus son aún poco conocidos. Para investigar la dinámica de la infección en el cerebro, adaptamos todo...

El uso de<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes para controlar la progresión de la infección por citomegalovirus Experimental del ratón en neonatos

Se describe un protocolo general para el seguimiento de las células in vivo mediante resonancia magnética en un modelo de ratón con ex vivo las células marcadas. Un protocolo típico para el etiquetado de células, el procesamiento de adquisición de imágenes y la cuantificación se incluye.

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Los mecanismos que regulan la motilidad intersticial de las células T CD4 efectoras en sitios de inflamación son relativamente desconocidos. Se presenta un enfoque no invasivo para visualizar y manipular en las células T CD4 in vitro -primed en la dermis para los oídos inflamados, lo que permite el estudio del comportamiento dinámico de estas células in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.

Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

La migración de neutrófilos se basa en la remodelación rápida y continua de la membrana plasmática en respuesta al quimioatrayente y sus interacciones con el microambiente extracelular. En este trabajo se describe un procedimiento basado en Microscopía Subcelular Intravital para investigar la dinámica de la remodelación de la membrana en neutrófilos inyectados en el oído de ratones anestesiados.

Obtención de imágenes de la migración de neutrófilos en la piel del ratón para investigar la remodelación de la membrana subcelular en condiciones fisiológicas

Aprende fotomarcado in vivo de células del colon en ratones neonatales para evaluar el potencial migratorio de células hematopoyéticas. Esta técnica permite rastrear patrones de tráfico celular hacia sitios extra-intestinales.

En Vivo Photolabeling de las células en el Colon para evaluar potencial migratorio de las células hematopoyéticas en ratones neonatales (Video) | JoVE Journal

En Vivo Photolabeling de las células en el Colon para evaluar potencial migratorio de las células hematopoyéticas en ratones neonatales

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