Name: Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprende a realizar abrasiones corneales en ratones usando rebabas oculares y solución de fluoresceína. Este método permite estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la cicatrización epitelial corneal.

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Nos gustaría agradecer a Kaisa Ikkala por su invaluable asistencia técnica y ayuda perspicaz cuando actualizándose en este método, así como más tarde durante la aplicación a nuestras preguntas de investigación central. También queremos agradecer al centro de animales de laboratorio y Anna Meller por su ayuda con la planificación de las directrices de la labor veterinaria.

Todos los experimentos son aprobados por la Junta Nacional experimento animal.
1. preparaciones
<ol><li>Preparar todas las soluciones y guardar en temperatura ambiente, salvo indicación en contrario. Siga las regulaciones de eliminación de residuos a disponer utilizada materiales y soluciones.</li>
	<li>Uso NMRI y ICR marginado las existencias, entre 4-12 semanas de edad y sexo. Si se utiliza la cepa C57BL/6, siga el método de preparación de ketamina-medetomidina en paso 1.3.2. Para otras medidas, siga las instrucciones descritas en 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>Preparar la medicina veterinaria fresco y a tiempo antes de iniciar la operación. Carprofeno se utilizará más adelante, así no es necesario preparar en este momento.<ol>
<li>0,375 mL de la mezcla para preparar una solución de medetomidina ketamina para la anestesia, (stock concentración 50 mg/mL) de ketamina (Ketaminol veterinario) con 0.25 mL (concentración de la madre 1 mg/mL) de medetomidina (Cepetor veterinario) y añadir 1,25 mL de estéril 0,9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (7.5 mg/kg y 1 mg/kg, medetomidina y ketamina).</li>
		<li>0,375 mL de la mezcla para preparar una solución más diluida de medetomidina ketamina para la anestesia en ratones C57BL/6, (stock concentración 50 mg/mL) de ketamina con 0.25 mL (concentración de la madre 1 mg/mL) de medetomidina y añadir 2,5 mL de estéril 0,9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (3.75 mg/kg y 0,5 mg/kg de medetomidina y ketamina). Nota: Este es un paso alternativo, sólo para adultos ratones C57BL/6.</li>
		<li>Para preparar buprenorfin analgesia, Añadir 0,1 mL (concentración madre 0,3 mg/mL) de buprenorfin a 1,9 mL de estéril 0,9% NaCl. Administrar 0,2 mL/20 g de peso del ratón (0,15 mg/kg).</li>
		<li>Para preparar atipamezole para descontinuar la anestesia, Añadir 0,1 mL (archivo de concentración 5 mg/mL) de atipamezole a 4,9 mL de 0.9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Para la analgesia durante la postanestesia usar carprofeno. Añadir 0,1 mL (archivo de concentración 50 mg/mL) de carprofeno a 4,9 mL de 0.9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (7.5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de tinción fluorescente<ol>
<li>Para la visualización de la abrasión bajo la luz azul cobalto (figura 1), utilice una solución fluorescente. Preparar una solución de fluoresceína 0.1% primera medición 10 mg de sal de fluoresceína con una escala fina y luego agregar a 10 mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
		<li>Proteger la solución de fluoresceína de la luz y agitar durante 5 minutos en un agitador. Nota: La solución de fluoresceína es sensible a la luz; mantener la solución de cubierta de la luz. Esta solución se puede conservar de + 4 ° C durante 2-3 días. Para el uso, es útil para la solución de fluoresceína en un gotero que se usa para las gotas. Utilice un filtro estéril al pasar la solución a la botella del cuentagotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpie la punta de fresa ocular antes y después de su uso; primero con el PBS y luego con el 70% EtOH. Si hace una abrasión a varios ratones durante la misma operación, siga los pasos de limpieza entre cada ratón.</li>
	<li>Poner la placa calentada en el (+ 37 ° C) y coloque una toalla de papel en él.</li>
</ol>2. corneal abrasión
PRECAUCIÓN: Use ropa protectora (bata, guantes) cuando manejo de ratones. Pesar el ratón para calcular el volumen del medicamento a administrar.
<ol><li>Utilice el método de scruffing una mano para manejar el ratón23. Administrar la mezcla de ketamina-medetomidina por vía intraperitoneal (i.p.) a la izquierda parte inferior del abdomen. Coloque el ratón en una jaula individual y esperar a dormirse. Esto normalmente toma menos de 5 minutos. Entonces, administrar buprenorfin primero y luego atipamezole mediante inyecciones i.p.. Utilice la misma técnica de manipulación. Nota: Una vez que se da la anestesia, el protocolo debe no ser pausado en cualquier momento.</li>
	<li>Antes de continuar, compruebe que la placa caliente es caliente. Coloque el ratón anestesiado en la placa de calefacción. El nivel de la anestesia es buena si está ausente el reflejo de la cola, pero el reflejo del dedo del pie está presente. Comprobar estos reflejos pellizcando la cola y cualquier dedo del pie con los dedos o pinzas. No use fuerza excesiva. Anestesia será durante 20-25 minutos.</li>
	<li>Para crear una abrasión, use las rebabas ocular limpia. Gire la base de las rebabas para activar la vibración que es imprescindible hacer la abrasión. Sentir la vibración en la mano, cuando la fresa está funcionando correctamente.<ol>
<li>Abrir un ojo a la vez manteniendo los párpados por separado con los dedos. Entonces firmemente tocar las rebabas a la córnea y mover el instrumento hacia adelante y hacia atrás así como hacia los lados en la superficie ocular. La vibración de la fresa realiza el cero; no presione, agitar o rasgar la córnea. En la córnea central, 20 movimientos en la superficie de abrasión son suficientes para inducir la herida. No levante las rebabas y tratar de permanecer en la región de la córnea para ser desgastado. Adquirir una abrasión de tamaño estándar se requieren varias rondas de práctica.</li>
	</ol>
 Nota: Se logra antes de abrasión Corneal asepsia utilizando betadine solución oftálmica.</li>
</ol>3. la proyección de imagen la abrasión
<ol><li>Se ilumina la región erosionada utilizando fluoresceína solución y luz de pluma azul cobalto (figura 1). La superficie ocular aparece descolorida en la luz ambiental. Después de la aplicación de fluoresceína, la región erosionada aparece en verde cuando se ilumina el ojo con el lápiz de luz.<ol>
<li>Si es necesario, abra los ojos desgastados semejantemente como en 2.3 y administrar una gota de solución de fluoresceína desde el frasco cuentagotas. Lave el ojo una vez con PBS o 0.9% NaCl para reducir el fondo de la fluoresceína. Use un gotero o una pipeta para el lavado. Aspirar el líquido, con una toallita suave y limpia las pestañas, si es necesario. El exceso de líquido se recoge generalmente la frontera nasal del ojo, cerca de la abertura del canal lagrimal. PRECAUCIÓN: Evite tocar la córnea al suplemento como abrasiones menores podrían ser inducidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tome fotos de la abrasión corneal.<ol>
<li>Para obtener imágenes similares durante cada sesión de imagen, herramientas accesorio constante para la luz de la pluma azul cobalto y la cámara (figura 2). Este protocolo proporciona una instalación fácil de repetir (figura 2).<ol>
<li>Para colocar la luz de la pluma y la cámara, utilice una lámpara de mesa con un brazo flexible y abrazadera y un brazo de cámara ajustable con una pinza, respectivamente. Atadura de cables el lápiz a la lámpara de mesa y la posición justo por encima de los ojos de ratón. Posicionamiento diferente la luz puede alterar la visualización de la abrasión. Una sugerencia para el posicionamiento de estas herramientas se describe en la figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilice la cámara SLR para tomar fotografías del ojo. Coloque el animal en una distancia deseada y la posición y el enfoque la cámara (1:12) en la luz de la habitación. Después de eso, cerca de todas las luces excepto la luz de la pluma azul cobalto. Nota: La manija ligera de pluma de la cinta hacia abajo o utilizar una banda elástica para mantener la luz en todo el tiempo durante la proyección de imagen. Esto podría ayudar si la imagen se vuelve borrosa. Es más fácil llevar a cabo la etapa de proyección de imagen con un colega.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. despertar después de abrasión Corneal
<ol><li>Administrar buprenorfin primero y luego atipamezole mediante inyecciones i.p.. Utilice la misma técnica de manipulación como en 2.1.</li>
	<li>Coloque una gota de ungüento de ojo ácido antibacteriano, fucidin (Isathal) a los ojos desgastados y no desgastado para hidratar y mantener la superficie ocular limpio de bacterias después de la anestesia.</li>
	<li>Como el ratón se despertará en 5-20 minutos en la placa de calefacción, observar el ratón durante el período de reactivación Post-anestésico. Cuando se convierte en móvil, coloque en una jaula individual. Nota: Si despertar lleva más tiempo, coloque el ratón en la jaula con una almohadilla caliente o colocar la jaula entera en el plato caliente y supervisar regularmente el ratón. Mientras que la anestesia desaparece, el ratón típicamente sacude y llega hacia arriba con el cuerpo anterior. Este comportamiento debe volver a la normalidad en 3-4 horas y luego se puede colocar el ratón a una jaula compartida.</li>
	<li>Administrar carprofen i.p. para el ungüento de analgesia y el ojo en dos días consecutivos después de la abrasión, semejantemente como en los pasos 2.2. y 4.2.</li>
</ol>5. la proyección de imagen durante la cicatrización de heridas
<ol><li>En este protocolo, tiempo de uso puntos 18 h y 72 h después de la abrasión para observar el cierre de la herida.<ol>
<li>Imagen consecutiva, anestesiar los ratones como explicado en 2.2.</li>
		<li>Tomar fotografías como se explica en 3.</li>
		<li>Despertar de los animales con atipamezole i.p. y supervisar del periodo como se explica en 4.3. Nota: Si no continuar con el seguimiento, eutanasia el ratón después de 5.1.2. Eutanasia se describe en 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. córnea colección e inclusión en parafina
<ol><li>Después del último punto de tiempo, sacrificar el animal. Coloque el ratón en una cámara que puede estar llena de CO2. Llenan el aire de la cámara de CO2. Cuando el animal está inmóvil, dislocarse las vértebras cervicales tirando firmemente de la base de la cola y presionando la región del cuello al mismo tiempo. PRECAUCIÓN: Siempre seguir las directrices del cuerpo de protección de los animales locales.</li>
	<li>Recoger el globo ocular entero cortando una abertura en la piel al lado del ojo con las tijeras de disección. Colocar las tijeras en el globo ocular y cortar el nervio ocular para el globo ocular fuera de la órbita. Usar pinzas si el ojo no sale fácilmente.<ol>
<li>Hacer un agujero en la parte posterior del ojo, del lado de retina, con una aguja de 26G para permitir la libre penetración de soluciones dentro del ojo. Nota: No deje que el ojo se convierten en seco, en cambio, colocar en PBS hasta continuar con el protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger el globo ocular en un tubo de 2 mL con PBS. No hacer una pausa en el experimento en este momento.</li>
	<li>Quite la PBS y globos oculares en paraformaldehído al 4% (PFA) de + 4 ° C durante 4-5 horas.</li>
	<li>Mover el globo ocular fijo a una cinta de tejido para el proceso de tejido. Utilice un pañuelo de procesamiento de la máquina y el siguiente programa:<ol>
<li>Lavar con PBS.</li>
		<li>Incubar 2 x 45 min en etanol al 70% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar h 2 x 1 en 94% de etanol a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar 3 x 45 min en etanol absoluto a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h en xileno, a temperatura ambiente y xileno pasado a 37 ° C.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h en parafina a 60 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de proceso de tejido, incorporar el globo ocular en parafina líquida (+ 60 ° C) usando un bloque de inclusión de tejidos. Colocar el ojo dentro del bloque de modo que mira hacia los lados y el borde periférico es hacia arriba. Que el bloque de solidificar en un plato fresco de 5 a 10 minutos.</li>
</ol>7. parafina secciones de la córnea
<ol><li>Preparar el microtomo para el seccionamiento según instrucciones de la institución o del fabricante. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manipular la cuchilla de micrótomo sharp.</li>
	<li>Lugar un baño María con agua ultrapura a temperatura ambiente al lado del microtomo y otro con agua ultrapura calientan a 50 ° C.</li>
	<li>Hacer secciones de 5 μm espesor del globo ocular. Nota: La lente se rompe fácilmente durante el seccionamiento. Para evitar esto, limpie la superficie con un paño húmedo cada vez que se inicia una nueva fila de secciones de corte. Utilizar agua para humedecer el tejido.</li>
	<li>Ponga las secciones al lado de uno al otro en el baño de agua temperatura ambiente y luego moverlos a la bañera de agua caliente con la ayuda de un portaobjetos de vidrio. Se extienden las secciones en el baño de agua caliente hasta relajación todas las arrugas y el mate de las secciones se convierten.</li>
	<li>Secar los portaobjetos de vidrio con secciones durante la noche a + 37 ° C.</li>
	<li>Coloque las secciones de las diapositivas manteniendo el portaobjetos durante 1 minuto en un plato caliente en + 60 ° C. Después de esto, las secciones pueden ser directamente procesadas para la coloración de immunohistological métodos o almacenadas a + 4 ° C.</li>
</ol>

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<li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL%2F6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital%2C+ketamine+and+nitrous+oxide%2C+but+not+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li>
<li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K14+%2B+Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li>
<li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786(2012).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP9+cleavage+of+the+%CE%B24+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions%3A+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hería los métodos son herramientas populares para estudiar diferentes aspectos de la homeostasis de la córnea y patologías. El modelo de abrasión ofrece un método bien-controlado para hacer frente a problemas relevantes en Oftalmología. Sin embargo, ciertos puntos críticos en el protocolo son destacar. En particular, los detalles descritos en relación con la medicina veterinaria, herida curativa línea de tiempo y resultado están optimizados para el uso con cepas NMRI y ICR exogámica, pero pueden variar entre cepas de rat...

Las capas epiteliales de numerosos órganos están expuestas a lesiones. Sin embargo, también contienen la capacidad de compensar la pérdida de tejido por medio de la cicatrización de heridas. La córnea ofrece un excelente modelo para estudiar la cicatrización de heridas. Forma la superficie externa del ojo y proporciona una capa protectora para la delicada maquinaria ocular. Así, la córnea funciona como una barrera física frente a patógenos y la pérdida de agua. Se compone de tres capas; epitelio, estroma y endotelio. El epitelio de la córnea es la capa más externa de la córnea. Las células epiteliales mantienen la función barrera de la córnea adhiriéndose estrictamente entre sí mediante uniones estrechas1,2,3. Membrana córnea acelular de la basal, la membrana de Bowman, separa el epitelio del estroma extensa, que contiene keratocytes refractaria. En el estroma, las células endoteliales canal de nutrientes, agua y oxígeno a la capa superior.
Abrasiones corneales son muy comunes en la clínica4. Lesiones en la córnea son diversas, pero en gran parte son causadas por pequeñas partículas como polvo o arena, arañazos u otros objetos extraños. El protocolo aquí había descrito pretende reproducir un tipo clínico de abrasión epitelial corneal. De esta manera, este protocolo proporciona un método controlable y seminal para los médicos y científicos corneales aplicar en sus estudios. Hemos realizado un ensayo de reparación en vivo lesiones en la córnea murina por causar lesiones en el tejido con una fresa rasgunõs ocular, el Algerbrush II. Aquí apuntamos la abrasión sólo al epitelio corneal central y dejar las otras partes del órgano sin daño. Así, el protocolo es ideal para el estudio de la célula epitelial corneal dinámica o la membrana basal durante re-epithelialization, célula de la migración, proliferación y diferenciación en vivo5. Recientemente, este modelo se utilizó para analizar la dinámica de la célula progenitora en la córnea murina, así como para conocer la capacidad de las células epiteliales corneales diferenciadas en el restablecimiento del nicho de células madre corneales después de lesión6,7. Después de la abrasión, la córnea vuelve a su normal transparencia y resistencia a la tracción. Curiosamente, un estudio en vitro indicó que re-epithelialization ocurre sin creciente de la célula proliferación8. Este protocolo describe la línea de tiempo de curación sin interrupciones en la córnea de ratón. Así, el método es aplicable para probar el efecto de las drogas en patrones y la velocidad de cicatrización.
La córnea se ha utilizado extensivamente para estudios de heridas. Sin embargo, muchos estudios han dependido de otros modelos de la lesión. Un modelo bien establecido de lesión corneal es la quemadura alcalina que se realiza mediante la aplicación de hidróxido de sodio (NaOH) con o sin papel de filtro sobre la superficie corneal9. Exposición alcalina produce una lesión grande y difusa que no sólo afecta el epitelio corneal, sino también la conjuntiva y el tejido conectador9,10. Soluciones alcalinas fuertes han demostrado inducir neovascularización9, opacificación y úlceras corneales. Las células inflamatorias invaden el estroma normalmente dentro de las 6 h y permanecen allí hasta las 24 h11. Por lo tanto, alcalino es un método recomendable en estudios relacionados con la activación stromal. Otro tipo de daño químico puede ser infligida por aplicar dimetilsulfóxido (DMSO) en la córnea9,10. Otros modelos de lesiones comúnmente usados incluyen heridas incisionales que penetran a través de las heridas de tejido conectador y keratectomy, que se limitan a la parte superior del tejido conectador14,15. Estos métodos también son útiles para responder a preguntas sobre cicatrización estromal. Lesiones diferentes modelos tienen sus ventajas y desventajas. Abrasión o desbridamiento, del epitelio corneal se desarrolló inicialmente utilizando bisturís rasgunõs o cuchillas en vivo ex córneas16. Este método ha sido más tarde usado en vivo en el ratón, rata y conejo17,18,19,20,21,22. Con las rebabas del ocular (figura 1), quitamos sólo una región seleccionada del epitelio, dejando el resto del epitelio afectado. Esta manera, es posible orientar precisamente la supresión epitelial a diferentes partes de la córnea. Además, el tamaño de la abrasión puede ser evaluado con la tinción de fluoresceína. Además, aquí seguimos cierre de abrasión durante el período de cicatrización.
Este método presenta varias ventajas, i) incluyendo la localización exacta del sitio de la abrasión, que no es posible con lesión química, ii) la abrasión es rápida de realizar, y iii) es no invasivo. Adjunto, describimos el método utilizando el ratón NMRI exogámica como modelo, sin embargo esto podría aplicarse a la amplia gama de modelos genéticos del ratón, así como a la rata y el conejo, que son modelos comunes utilizados para estudiar la interrupción córnea humana.

<table><tbody><tr><td>Ratón NMRI</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td>uso estéril</td></tr><tr><td>Medetomidina</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>Nombre de mercado: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Nombre comercial: Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior 3015248 Nombre</td><td></td><td>comercial: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>Nombre de mercado: Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>Nombre de mercado: Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% ungüento ocular ácido fucidina</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>Nombre de mercado: Isathal</td></tr><tr><td>Sal de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> salina tamponada con fosfato <td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii rebaba ocular ( Punta de 0,5 mm)</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo azul cobalto</td><td>SP Services</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>Cámara réflex digital</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>Brazo de cámara ajustable y abrazadera</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>Altura 28 cm Lámpara</td></tr> de <tr><td>mesa con brazo flexible y abrazadera</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toallita suave</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr>Cámara <td></td><td></td><td></td><td>de CO2</td></tr> Juego de <tr><td>herramientas de disección</td><td>Herramientas</td><td></td><td></td></tr> de ciencia <tr><td>fina Jeringas Beckton</td><td>Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Tubo Eppendorf</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>Casete de tisú</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de procesamiento de tisú ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Cera de parafina</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>Molde de inclusión de tejidos 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua para el corte</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua para el corte</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de micrótomo</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Corredera de vidrio</td><td>Th.Geyer GmbH & Co.</td><td>7.695.019</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas ocular como un modelo de córnea

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

La córnea murina ofrece un excelente modelo para estudiar la cicatrización de heridas. La córnea es la capa más externa del ojo y es la primera defensa a la lesión. De hecho, el tipo más común de lesión de ojo encontrado en clínica es una abrasión corneal. Aquí, utilizamos un ocular burr para inducir una abrasión, resultando en la eliminación del epitelio corneal en vivo sobre ratones anestesiados. Este método permite la interrupción epitelial específica y reproducible, dejando otras áreas intactas. Además, describimos la visualización del epitelio erosionada con tinción de fluoresceína y proporcionar consejos concretos sobre cómo visualizar la córnea erosionada. Luego, seguimos la línea de tiempo de cicatrización 0, 18 y 72 h después de la abrasión, hasta que la herida es re-epithelialized. El modelo de abrasión epitelial de la lesión corneal es ideal para los estudios sobre proliferación de células epiteliales, la migración y la reepitelización de las capas corneales. Sin embargo, este método no es óptimo para estudiar la activación estroma durante la cicatrización de heridas, porque las rebabas del ocular no penetran a las capas de células estromales. Este método también es adecuado para aplicaciones clínicas, por ejemplo, pre-clínica prueba de eficacia de la droga.

Este protocolo describe un modelo para infligir una lesión de abrasión en la córnea de ratón y sugiere cómo seguir y visualizar el proceso de curación después de la abrasión. Recientemente, se empleó este método para estudiar el papel de células progenitoras epiteliales corneales durante6de cicatrización. El uso de herramientas establecidas es la clave para un experimento exitoso de la abrasión. Nosotros y otros, hemos utilizado las rebabas ocular Algerbrush II (<s...

Este protocolo describe un método para causar una abrasión en la superficie ocular del ratón y seguir la herida en proceso de curación después de eso. El protocolo aprovecha de una ocular rebabas a eliminar parcialmente el epitelio de superficie del ojo en ratones anestesiados.

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con los mecanismos celulares y moleculares involucrados durante la cicatrización de la herida corneal. Una ventaja de esta técnica es que refleja las situaciones en la sala de emergencias en caso de inserción corneal, es decir, abrasión o rasguño en la superficie del ojo. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando estudiaba las células progenitoras epiteliales de la córnea y su comportamiento en una situación que desafía el mantenimiento homeostático de la córnea.La demostración visual de este método es fundamental, ya que realizar la abrasión corneal es difícil y requiere práctica. En primer lugar, prepare una solución de Florecine al 0,1% para visualizar la abrasión bajo la luz azul cobalto midiendo 10 miligramos de sal de Florecine con una escala fina. A continuación, añada la sal a 10 mililitros de solución salina tamponada Fosfate.Proteja la solución de Florecine de la luz y agite durante cinco minutos. Filtre la solución estéril en un frasco con gotero y protéjala de la luz. La solución de Florecine se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante dos o tres días.Limpie la punta de la fresa

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Aquí se describe el establecimiento de un modelo de cirugía de catarata simulada ex vivo clínicamente relevante que se puede utilizar para investigar los mecanismos de la respuesta a la lesión de los tejidos epiteliales dentro de su microambiente nativo.

Establecimiento de un punto de vista clínico relevante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Catarata Mock Modelo de Cirugía en Investigando epitelial reparación de heridas en un microambiente Nativo

Un protocolo para un ex vivo modelo de cultura órgano córneo es útil para estudios de cicatrización se describe. Este sistema modelo puede utilizarse para evaluar los efectos de agentes para promover la curación regenerativa o toxicidad de la droga en un ambiente organizado de multicelular 3D.

Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo de cicatrización de heridas corneales es altamente reproducible y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de enfermedades.

Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales

Aquí, se desarrollan modelos animales basados en ratones y conejos para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal para detectar nuevas terapias y el mecanismo subyacente.

Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

Este artículo describe un nuevo modelo animal desarrollado para estudiar la anatomía e histología de la córnea y sus procesos de curación. Este nuevo modelo animal utiliza el jerbo mongol, que tiene una córnea con muchas similitudes con la córnea humana.

Los jerbos mongoles como modelo animal de curación de heridas

El presente protocolo demuestra los diferentes pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. Las córneas regeneradoras o completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida.

Investigando la regeneración de tejidos sin cicatrices en córneas embrionarias de pollitos heridos

Este protocolo se centra en dañar la superficie ocular del pez cebra a través de la abrasión para evaluar el posterior cierre de la herida a nivel celular. Este enfoque explota una rebaba ocular para eliminar parcialmente el epitelio corneal y utiliza microscopía electrónica de barrido para rastrear los cambios en la morfología celular durante el cierre de la herida.

Cicatrización de heridas corneales de pez cebra: de la abrasión al análisis de imágenes de cierre de heridas

Aquí, proponemos tres métodos diferentes para dañar las fibras sensoriales que inervan la córnea. Estos métodos facilitan el estudio de la regeneración axonal en ratones. Estos tres métodos, adaptables a otros modelos animales, son ideales para el estudio de la fisiología de la inervación corneal y la regeneración.

Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

Desarrollamos un modelo de rata de inflamación corneal severa a través de legrado de epitelio corneal combinado con suturas corneales. El estudio evaluó los patrones de inflamación de la córnea, la proliferación epitelial y los cambios en las células madre limbales en condiciones inflamatorias.

Establecimiento de un modelo de inflamación corneal severa en ratas basado en legrado del epitelio corneal combinado con suturas corneales

El cultivo de órganos ex vivo de córnea porcina y la cicatrización de heridas epiteliales proporcionan un medio económico, ético, reproducible y cuantitativo para probar la toxicidad ocular de los productos químicos. También ayudan a dilucidar los mecanismos subyacentes a la regulación de la epitelización y la reparación de tejidos, y a evaluar terapias para el tratamiento de la queratopatía diabética y el retraso en la cicatrización de heridas.

Evaluación de la toxicidad terapéutica y química mediante el cultivo de órganos de córneas porcinas y la cicatrización de heridas epiteliales

Aprende a realizar abrasiones corneales en ratones usando rebabas oculares y solución de fluoresceína. Este método permite estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la cicatrización epitelial corneal.

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

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