Name: In Vitro Diferenciación del Factor del Granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) de ratón-producción de linfocitos de T (THGM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a diferenciar células T H GM a partir de células T CD4+ naïve de ratón. Este protocolo genera más del 50% de células productoras de GM-CSF para estudiar enfermedades inflamatorias como la esclerosis múltiple.

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Este estudio fue apoyado por becas de la Universidad Nacional salud sistema de Singapur (Oct-12-2014 T1 y T1-2015 Sep-10).

Todos los ratones utilizados en el presente Protocolo en el fondo genético de C57BL/6 y alojados en condiciones libres de patógenos específicas en la Universidad Nacional de Singapur. Todos los experimentos se realizaron utilizando protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad Nacional de Singapur.
1. reactivos y preparación de Material
<ol><li>Preparar 500 mL de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 2% de suero bovino fetal (FBS) y ácido etilendiaminotetraacético de 1 mM (EDTA). Nota: Mantenga el buffer en el hielo a lo largo de todo el procedimiento para obtener resultados óptimos.</li>
	<li>Preparar 50 mL de medios RPMI completo con RPMI 1640, 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina. Utilizar medios RPMI completo que contiene β-mercaptoetanol de 50 μm para la diferenciación de la célula de THGM. Añadir β-mercaptoetanol en una campana de humos.</li>
	<li>Preparar 7,5 mL de una mezcla de anticuerpos anti-CD3e diluyendo valores anti-CD3e concentrado a 3 μg/mL en PBS. Capa de placas de 48 pocillos añadiendo 150 μL de la mezcla de anticuerpos a cada pocillo e incubar la placa a 37 ° C durante al menos 1 hora, o a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Esterilizar un par de tijeras y fórceps y mantenerlos en etanol al 70% entre las disecciones.</li>
</ol>2. preparación de esplenocitos murinos
<ol><li>Eutanasia el ratón (de 6 a 8 semanas) con un aprobado institucionalmente CO2 asfixia o dislocación cervical. Rocíe el ratón con etanol al 70% y montarlo en un bloque de poliestireno en su parte posterior. Transferir el ratón a un gabinete para proceder con las siguientes medidas de seguridad biológica.</li>
	<li>Mantener la piel usar un par de pinzas y cortar la piel por debajo de la caja torácica en el lado izquierdo de unos 4 cm, utilizando un par de tijeras. Abra el saco peritoneal para exponer el bazo y usar pinzas estériles para extraer el bazo.</li>
	<li>Coloque un colador celular de 70 μm en un tubo de 50 mL y Humedezca previamente con 2 mL de tampón. Coloque los bazos en el colador de la célula (2 – 3 bazos para filtro de una célula) y macerar con el extremo de un émbolo de la jeringa de 5 mL.</li>
	<li>Enjuague el filtro y el tubo varias veces con 1 – 2 mL de tampón de aislamiento celular hasta que todas las células se vuelcan en el tubo. Deseche el filtro de la celda y centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular con 5 mL de frío (4 ° C) amonio-cloruro-potasio (ACK) lisis buffer (150 m m de NH4Cl, 10 mM KHCO3, m a 0,1 m de Na2EDTA, pH 7.2-7.4) y mezclarlas suavemente por 2 minutos agregar 10 mL de medios RPMI completo para neutralizar el ACK tampón e inmediatamente centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante después de la centrifugación.</li>
</ol>3. aislamiento de T de CD4 + las células usando microesferas magnéticas CD4 y una columna de separación celular
<ol><li>Resuspender el precipitado de células en 5 mL de tampón de aislamiento celular. Filtrar la suspensión de células usando un filtro de separación previa (30 μm) en un nuevo tubo de 15mL para eliminar cualquier residuo.</li>
	<li>Tomar 10 μL de la suspensión de células y hacer una dilución de 10 x por agregar 90 μL de tampón. Tomar 10 μL de la suspensión diluida de células y mezclar con 10 μL de trypan azul para el recuento celular. Contar las células en un hemocitómetro para determinar el rendimiento de células viables.</li>
	<li>Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 90 μL de buffer por 107 células. Añada 10 μL de microesferas magnéticas de CD4 por 107 células. Incube las células durante 15 min a 4 ° C. Para obtener resultados óptimos, mezcle la suspensión de células suavemente cada 5 min durante la incubación.</li>
	<li>Mientras que las células están incubando, colocar una columna de separación en el soporte magnético. Humedezca previamente la columna con 2 mL de tampón.</li>
	<li>Al final de la incubación de células/grano, lavan las células con 5 mL de tampón y centrifugue a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 1 mL de tampón de carga la muestra en la columna de separación celular y dejarla fluir a través de. Utilice un tubo de centrífuga de 15 mL para recoger la fracción de células CD4. Añadir 1 mL de buffer para lavar el tanque antes de que sea seco. Repetir el lavado 2 x.</li>
	<li>Quitar la columna de la separación celular del soporte magnético y colocar en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL. Añadir 2 mL de tampón de aislamiento de la célula a la columna de la separación celular y aplique el émbolo con firmeza para obligar a las células de la columna.</li>
	<li>Centrifugar la fracción a 350 x g durante 5 min a 4 ° C para obtener las células CD4 +. Deseche el sobrenadante.</li>
</ol>4. purificación de las células T Naive de CD4 + (CD4+CD25–CD44loCD62LHola) por diferenciación celular clasificación y THGM activado por fluorescencia
<ol><li>Resuspender el precipitado de células CD4 + obtenido en 500 μl de tampón. Las células se mezclan con una mezcla de anticuerpos conjugados fluorescentes que contienen CD4-PerCp (2,8 μg/mL), CD44-APC (2.4 μg/mL), CD25-PE (2 μg/mL) y CD62L-FITC (10 μg/mL) (tabla 1). Incubar las células en hielo durante 20-30 minutos, mientras que la protección de la luz. Nota: Las concentraciones de anticuerpos fueron optimizadas previamente en el laboratorio. El número de anticuerpos aparece es para las células de los ratones de 1 – 2.</li>
	<li>Después de la incubación, las células con 5 mL de tampón de lavado y centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 500 μl de tampón. Filtro de las células utilizando una malla de nylon.</li>
	<li>Transfiera la suspensión a un tubo de FACS para la clasificación de la célula. Precapa los tubos con 500 μl de tampón FACS.</li>
	<li>Obtener un CD4+CD25–CD44loCD62LHola población (de ingenuo CD4+ T células) al ordenar de FACS. Puerta en CD4+CD25– primeras y luego seleccionadas CD44loCD62LHola células de esta población.</li>
	<li>Recoger el ingenuo CD4+ T fracciones de la célula en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células T CD4 + de ingenua a una concentración de 106 células/mL en medios RPMI completo que contiene 50 μm β-mercaptoetanol.</li>
	<li>Aspire los anticuerpos anti-CD3e utilizados para cubrir primero en la placa de 48 pozos. Células de semilla 0,25 millones (250 μL) en cada pocillo con IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 μg/mL) y anti-IFNγ (10 μg/mL) (tabla 1). Nota: Las concentraciones de citoquinas y anticuerpos fueron optimizadas previamente en el laboratorio para una diferenciación de la célula de THGM.</li>
	<li>Incube las células a 37 ° C con 5% CO2 durante 3 días. No cambie el medio durante la incubación.</li>
</ol>5. Análisis de las células de ratón THGM generadas In Vitro
<ol><li>Utilizando un microscopio, comprobar la diferenciación de la célula 3 d después de la diferenciación. Las células de la cosecha y centrifugue a 350 x g durante 5 min a 4 ° C. Lavar las células 2 x con medios RPMI completo. Nota: Las células diferenciadas son más grandes en tamaño que ingenuo de células T CD4 +.</li>
	<li>Resuspender las células en 1 mL de Medio RPMI completo. Tomar 10 μL de suspensión celular y se mezcla bien con 10 μL de trypan azul para determinar el número de células con un hemocitómetro. Se dividen las células diferenciadas en tres pociones restimulation y análisis. Nota: Tinción intracelular citoquinas y pruebas de ELISA requieren millones células de ≥0.5, y análisis de qPCR necesita ≥ 1 millón.</li>
	<li>
Para la tinción intracelular citoquinas, restimulate las células con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) y ionomycin (1 μg/mL) en presencia de un inhibidor del transporte de la proteína (1 μl/mL) por 4-6 h.
	<ol>
<li>Cosecha de las células y tinción con anticuerpos anti-CD4 (conjugado con PerCP, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100; o conjugado con FITC, 0,5 mg/mL dilución 1: 100) por 30 min.</li>
		<li>Fijar las células con 200 μL de tampón de fijación durante 20 a 60 minutos. Después de la fijación, se lavan las células 2 x con 1 mL de amortiguador de permeabilización.</li>
		<li>Realizar tinción intracelular con anticuerpos contra GM-CSF (conjugado con PE, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100), IL-17A (conjugado con FITC, 0,5 mg/mL, dilución 1: 100; APC-conjugated, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100), IL-4 (conjugado con APC, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100) y el IFNγ (conjugado con APC, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100; PE-conjugated, 0,2 mg/mL, dilución 1: 100) por 30 min en la oscuridad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para un análisis de qPCR de la expresión génica de citoquinas por células diferenciadas, activan las células con limite de placa anti-CD3e (3 μg/mL) (mismo la placa como se describe en el paso 1.3). A las 3 h después de la estimulación, cosechar las células para aislar el ARN total usando un reactivo de extracción fenol RNA para preparar cDNA para la qPCR. El programa utilizado para la qPCR y cartillas se enumeran en las tablas 2 y 3, respectivamente.</li>
	<li>Para el análisis de la secreción de la proteína de citoquinas por células diferenciadas, restimulate las células con limite de placa anti-CD3e (3 μg/mL) durante 24 h (mismo la placa como se describe en el paso 1.3). Cosechar el cultivo celular sobrenadante para IL-17 y GM-CSF ELISA determinar sus concentraciones.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+T+cells%3A+fates%2C+functions%2C+and+faults%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li>
<li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+immune+responses%3A+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).</li>
<li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Immunology+meets...Immunology%3A+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li>
<li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells%2C+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li>
<li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encephalitogenicity+of+T%28H%2917+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li>
<li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+Neuroinflammation%3A+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí hemos descrito un protocolo de una diferenciación de THGM en vitro de las células del ratón ingenuo CD4 +, seguido de un análisis de las células diferenciadas para validar el método. De nota, bazo y ganglios linfáticos puede utilizarse para ingenuo CD4 + células de T de purificación y la diferenciación de THGM. La expresión de citocina determinada por citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo mostró que alrededor del 55% de las células fueron inducidos a conve...

De células T CD4 + helper (TH) son componentes esenciales del sistema inmune, teniendo papeles cruciales en la defensa del huésped frente a patógenos microbianos, en la vigilancia del cáncer y autoinmunidad1,2,3. Sobre la activación de células T del receptor (TCR), ingenuo de células T CD4 + se pueden distinguir en TH1, TH2, TH , reglamentarios o de 17 células de T (Treg) bajo la influencia de citocinas diferentes ambientes2,4, 5. recientemente, un nuevo subconjunto de células TH , que principalmente produce el GM-CSF, se identificó y nombró THGM6. La diferenciación de las células THGM es conducida por IL-7 a través de la activación de un transductor de señal y activador de la transcripción 5 (STAT5). Estas células expresan una gran cantidad de GM-CSF al mismo tiempo que una baja expresión de otros TH-célula citocinas firma como IFNγ y la IL-176. GM-CSF fue encontrado para desempeñar un papel crítico en el desarrollo de CD4 + neuroinflamación mediada por células T7,8. En comparación con las células autorreactivas T expresa IFNγ o con IL-17, GM-CSF-expresar T células transferido a tipo salvaje ratones (WT) causadas un inicio anterior de la enfermedad y mayor severidad de la enfermedad. Además, Csf2- / - células de T no pudieron inducir la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) después siendo transferido eventualmente a los destinatarios de la WT, mientras que las células T carente de IFNγ, IL-17A o retenido la capacidad de mediar EAE7. Por otra parte, un bloqueo de GM-CSF con anticuerpos neutralizantes mejoró EAE de severidad de la enfermedad8. Además, una deficiencia de STAT5 en células T en ratones resultó en una menor generación de THGM y, por tanto, en una resistencia de los ratones a EAE desarrollo6. Estos resultados subrayan la importancia de las células de T de GM-CSF-expresandoH en enfermedad autoinmune capensis. Por lo tanto, establecer un método para distinguir las células de T de GM-CSF-expresandoH de células T CD4 + de ingenuo sería importante en el estudio de la patogenia autoinmune neuroinflamación y la respuesta inmune mediada por células T. Sin embargo, un protocolo eficientemente genera células THGM de murino ingenuo que CD4 + no ha sido establecida.
Aquí presentamos un método que distingue las células de THGM murinas de células T CD4 + de ingenuo. Este protocolo describe el procedimiento entero, incluyendo la extracción del bazo de ratón, la preparación de una suspensión unicelular, la selección positiva de CD4, la célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación y la célula de TH diferenciación y análisis. Las T helper células diferenciadas, son analizadas por citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo para determinar la expresión de citocinas a nivel unicelular, de una PCR cuantitativa en tiempo real para determinar la expresión de citoquinas a nivel de mRNA, y por ELISA para evaluar la expresión de citoquinas a nivel de la proteína. Este método puede ser aplicado a los estudios de Biología de la célula de THGM bajo varias condiciones, tales como EAE, donde GM-CSF juega un papel importante en la patogenesia.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr>FBS <td>Capricornio</td><td>Inactivado por Calor</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>1ª Base</td><td>BUF-2040-10</td><td>Diluido a 1x PBS en agua estéril</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>1ª Base</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón</td> <td>ACKBiolegend</td><td>420301</td><td>diluido en agua estéril</td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>SPL Life Sciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>CD4 microperlas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>LS columna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>soporte magnético</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL Centrífuga</td><td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células Sony SY3200</td><td>Clasificador</td><td></td>de <td>células Sony SY3200</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónico de 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga cónico de 15 mL</td><td>Tubo</td><td></td> Greiner Bio-One 188271 <td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE conjugado anti-ratón CD25 (IL-2Ra, p55)</td><td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano/ratón CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento mejorada de Neubauer</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Trypan Blue Solution</td><td>GE healthcare Life Sciences</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>microscopio</td><td>Nikon Nikon</td><td>Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Purified&nbsp; anti-ratón CD3e&nbsp; anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>Hámster purificado anti-ratón CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Rata purificada&nbsp; anti-ratón IFN&gamma; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ratón IL-4 purificado</td><td>Biolegend</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante IL-7 de ratón</td><td>R& Sistema D</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta humano recombinante</td><td>R& Sistema D</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug inhibidor del transporte de proteínas</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>Fijación intracelular& Juego de tampones de permeabilización</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-ratón IL-17A Biolegend</td><td></td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-ratón IFN-gamma</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR master mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>ratón GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL-17A ELISA sin salida</td><td>invitrogen</td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro diferenciación del factor del granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (gm-csf) de ratón-producción de linfocitos de t (thgm)

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

El factor del granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF)-producción de la célula de T helper (THGM) es un subconjunto de células helper T nuevamente identificado que predominantemente segrega GM-CSF sin producir interferón (IFN) γ o interleukin (IL) -17 y se encuentra a juega un papel esencial en la neuroinflamación autoinmune. Un método de aislamiento de ingenuo de células T CD4 + de una suspensión unicelular de esplenocitos y generación de células THGM de las células T CD4 + de ingenuo sería una técnica útil en el estudio de la inmunidad mediada por células T y enfermedades autoinmunes. Aquí describimos un método que distingue las de células T CD4 + ingenuo de ratón en células THGM promovidas por IL-7. El resultado de la diferenciación fue evaluado mediante el análisis de la expresión de citoquinas utilizando diferentes técnicas, entre ellas citoquinas intracelulares tinción combinada con citometría de flujo, una reacción en cadena en tiempo real cuantitativa de la polimerasa (PCR), y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Utilizando el protocolo de diferenciación de THGM tal como se describe aquí, alrededor del 55% de las células expresan GM-CSF con una mínima expresión de IFNα o IL-17. La expresión predominante de GM-CSF de las células THGM más fue confirmada por el análisis de la expresión del GM-CSF, IFNα y IL-17 en los niveles de mRNA y proteína. Así, este método puede utilizarse para diferenciar ingenuo de células T CD4 + t cells GMH en vitro, que serán útiles en el estudio de la biología de la célula de THGM.

Ingenua de células T CD4 + aisladas de dos ratones C57BL/6 machos de 8 semanas de edad se dividieron en tres porciones. Una porción de las células fue distinguida en las células de THGM siguiendo el protocolo descrito. Otra porción fue cultivado bajo una condición de THGM en presencia de anticuerpos anti-IL-4 (10 μg/mL) para probar la influencia de un bloqueo de la IL-4 en la diferenciación de THGM. La última parte fue cultivada bajo una condición de difer...

Aquí, presentamos un protocolo para distinguir murino granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T (THGM) linfocitos de células T CD4 + de ingenuo, incluyendo el aislamiento de las células CD4 + T de ingenuo, diferenciación de THGM, y Análisis de las células THGM diferenciadas. Este método puede ser aplicado a los estudios de la regulación y función de las células THGM.

In Vitro Diferenciación del Factor del Granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) de ratón-producción de linfocitos de T (THGM)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células T CD4, como qué subconjunto de células T auxiliares es la principal fuente de GM-CSF en la patogénesis de enfermedades inflamatorias como la esclerosis múltiple. La principal ventaja de esta técnica es que genera más del 50% de células T que expresan GM-CSF a partir de células T CD4 ingenuas con pocas o ninguna célula de expresión gamma OI17 que interfiera, lo que proporciona una fuente celular esencial para la investigación de la regresión y la función de THGM, un nuevo subconjunto de células T colaboradoras. La demostración del procedimiento estará a cargo de Yi Lu, un estudiante graduado de mi laboratorio.Comience usando fórceps para levantar la piel sobre el abdomen de un ratón de seis a ocho semanas de edad y haga una incisión de aproximadamente cuatro centímetros por debajo de la caja torácica en el lado izquierdo del animal. Abra el saco peritoneal para exponer el bazo y use pinzas estériles para transferir el bazo a un filtro de 70 micrómetros previamente humedecido con dos mililitros de tampón de aislamiento celular. Cuando se hayan recolectado dos o tres bazos, use el extremo de una jeringa de cinco mililitros para macerar el tejido del bazo y enjuague el colador varias veces con uno o dos mililitros de tampón de aislamiento celular hasta que todas las células se hayan enjuagado en el tubo.Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio de cuatro grados centígrados. Después de dos minutos de mezcla suave, detenga la lisis con 10 mililitros de medio RPMI completo e inmediatamente centrifugue las celdas. Para aislar las células T CD4 positivas, vuelva a suspender la peleta de glóbulos blancos en cinco mililitros de tampón de aislamiento celular y filtre la suspensión celular a través de un colador de 30 micrómetros en un nuevo tubo de 15 mililitros para eliminar cualquier residuo.Después de contar, vuelva a suspender las células a una vez 10 a la séptima celdas por 90 microlitros de concentración de tampón y agregue 10 microlitros de perlas magnéticas conjugadas anti-CD4 por una vez 10 a la séptima celda para una incubación de 15 minutos a cuatro grados Celsius con mezcla cada cinco minutos. Mientras las células se incuban, coloque una columna de separación en un soporte magnético y humedezca previamente la columna con dos mililitros de tampón. Luego, lave las células con cinco mililitros de tampón y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón.Cargue la muestra en la columna y recoja la fracción negativa CD4 en un tubo cónico de 15 mililitros. Cuando todas las células hayan pasado a través de la columna, lave el depósito tres veces con un mililitro de tampón por lavado antes de que se seque. Después del último lavado, transfiera la columna a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y sumerja la columna con dos mililitros de tampón de aislamiento celular para expulsar la fracción de cordón positiva.A continuación, recoja las células CD4 positivas por centrifugación. Para la clasificación celular activada por fluorescencia de las células T vírgenes, vuelva a suspender el gránulo de células CD4 positivas clasificado por perlas en 500 microlitros de tampón y mezcle las células con un cóctel de anticuerpos conjugados con fluorescencia adecuado. Después de 20 a 30 minutos sobre hielo protegido de la luz, lavar las células en cinco mililitros de tampón fresco y volver a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón fresco.Filtre las células a través de una malla de nailon y transfiera las células a un tubo FACS prerrecubierto con 500 microlitros de tampón. Puerta para seleccionar las poblaciones de células altas con ligandos CD4 positivos, CD25 negativos y CD44 con ligando CD62 bajo. A continuación, clasifique las fracciones de linfocitos T altos del ligando CD42 CD4 positivo CD44 negativo y CD44 bajo en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros y granule las células T CD4 positivas vírgenes aisladas por centrifugación.Para la diferenciación de células T auxiliares del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos o GM-CSF, vuelva a suspender las células T clasificadas a una concentración de 10 a la sexta célula por mililitro en un medio RPMI completo que contenga 50 micromolares beta-mercaptoetanol y aspire el anticuerpo épsilon anti-CD3 de cada pocillo de una placa de 48 pocillos prerrevestida. A continuación, siembre 2,5 veces 10 a la quinta celda en cada pocillo junto con IL7, anti-CD28 y anti-IFN gamma e incube las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante tres días. En el tercer día de cultivo, use un microscopio para verificar la diferenciación celular y recolectar las células para la centrifugación.Vuelva a suspender el pellet en medio RPMI completo fresco durante dos lavados, resuspendiendo las células en un mililitro de medio completo fresco después del segundo lavado para contar. Divida las células en tres volúmenes iguales y vuelva a estimular la primera alícuota de células con PMA e ionomicina en presencia de un inhibidor del transporte de proteínas durante cuatro a seis horas. Al final de la estimulación, recoja las células para teñirlas con el anticuerpo anti-CD4.Después de 30 minutos, fije las células con 200 microlitros de tampón de fijación durante 20 a 60 minutos, seguido de dos lavados en un mililitro de tampón de permeabilización por lavado. A continuación, tiñe la expresión de citocinas intracelulares durante 30 minutos en la oscuridad. Para el análisis cuantitativo de PCR de la expresión génica de citocinas celulares diferenciadas, active las células con épsilon anti-CD3 unido a placas durante tres horas.A continuación, utilice un reactivo de extracción de ARN de fenol para aislar el ARN total y permitir la preparación del ADNc para la PCR cuantitativa. Para evaluar la secreción de proteínas citocinas por las células diferenciadas, se reestimularon las células con épsilon anti-CD3 unido a placas durante 24 horas y se analizaron los sobrenadantes de cultivo para IL17 y GM-CSF mediante ELISA. Alrededor del 55% de las células cultivadas en condiciones de diferenciación de células T auxiliares GM-CSF expresaron GM-CSF, mientras que solo alrededor del 2% de las células diferenciadas en condiciones de T colaborador 17 expresaron esta citocina.En comparación con las condiciones de diferenciación de T helper 17 que dan lugar a la producción de IL17 por aproximadamente el 8% de las células, las condiciones de diferenciación de las células T auxiliares GM-CSF indujeron la expresión de IL17 en solo aproximadamente el 1% de las células. En particular, solo una fracción de las células expresa IFN gamma o IL4 en cualquiera de las condiciones de cultivo. Las células diferenciadas T auxiliares de GM-CSF muestran una expresión significativamente mayor de ARNm de CSF2, pero una expresión mucho menor de IL17 en comparación con las células T auxiliares 17.Esto se correlaciona con la expresión de la proteína GM-CSF observada en los sobrenadantes de cultivo de las células T-helper GM-CSF y T-helper 17, con tres veces la concentración de la citocina detectada en los cultivos de células T-helper GM-CSF y sin IL17 medible en absoluto. Las células T helper GM-CSF también exhiben una expresión ligeramente menor de Rorc, una mayor expresión de Stat5 y una expresión ligeramente menor de Stat3 que las células T-helper 17, lo que indica que, aunque la diferenciación de las células T helper GM-CSF e IL17 está gobernada por diferentes factores transcripcionales, pueden compartir algunas características comunes. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar todos los pasos en la cabina de seguridad biológica para mantener las células y los reactivos estériles.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis del transcriptoma, para responder a preguntas adicionales, como ¿cuáles son los genes importantes expresados por las células THGM? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología exploraran cómo el GM-CSF derivado de células T contribuye a la inflamación en roedores. No olvide que trabajar con beta-mercaptoetanol y reactivos de extracción de ARN puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de campanas extractoras mientras se usan estos reactivos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra el cebado de monocitos primarios en macrófagos. Los monocitos humanos primarios pueden aislarse y diferenciarse a un fenotipo proinflamatorio similar a M1 utilizando el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) o a un fenotipo antiinflamatorio similar a M2 utilizando el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).

Cultivo in vitro y diferenciación de monocitos primarios en macrófagos

Este video describe un método in vitro para generar macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs). La generación de macrófagos a partir de iPSCs ocurre en tres etapas: (i) agregación de iPSCs en suspensión para formar cuerpos embrioides tridimensionales (EBs) que se diferencian en células mesodérmicas, (ii) formación de células precursoras de macrófagos a partir de las EBs diferenciadas, y (iii) diferenciación de las células precursoras de macrófagos en macrófagos...

Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en macrófagos

Este video demuestra la diferenciación in vitro del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos o de las células T auxiliares productoras de GM-CSF (THGM). Las células T vírgenes aisladas se estimulan para su diferenciación en THGM, lo que se confirma mediante la detección de una alta producción intracelular de GM-CSF y una baja expresión de otras citocinas específicas de las células T auxiliares.

Una técnica in vitro para diferenciar las células T auxiliares productoras de GM-CSF de las células T vírgenes

Las células madre embrionarias de ratón pueden diferenciarse a células T in vitro utilizando el sistema de cocultivo OP9-DL1. El éxito en este procedimiento requiere una atención cuidadosa al mantenimiento del reactivo/célula y a los pasos sensibles de la técnica clave. Aquí discutimos estos parámetros críticos y proporcionamos un protocolo detallado para fomentar la adopción de esta tecnología.

Derivación de células T In Vitro De células madre embrionarias de ratón

Las células de médula ósea cultivadas con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) generan un cultivo heterogéneo que contiene macrófagos y células dendríticas (CD). Este método destaca el uso de la unión de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar los macrófagos de los DC en el cultivo de GM-CSF. Los macrófagos de este cultivo tienen muchas similitudes con los macrófagos alveolares.

Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Se presenta un protocolo para el cultivo celular de macrófagos derivados de monocitos humanos diferenciados por el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El protocolo utiliza la criopreservación de monocitos junto con su diferenciación masiva en macrófagos. Luego, los macrófagos cosechados se pueden sembrar en pozos de cultivo a las densidades celulares requeridas para llevar a cabo experimentos.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

Aquí se presentan protocolos detallados para el cultivo de la línea de célula 32D/G-CSF-R precursor mieloide murinas, realizar infecciones virales y llevar a cabo ensayos de proliferación y diferenciación. Esta línea celular es conveniente para el estudio de desarrollo de las células mieloides y el papel de los genes de interés en el crecimiento de las células mieloides y diferenciación neutrofílica.

Proliferación y diferenciación de precursores mieloides murinas 32D/G-CFS-R las células

En este artículo, nos proporcionan que un protocolo detallado para la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en médula ósea murina derivados de macrófagos y células dendríticas. El método se basa en la transducción de la médula ósea progenitores con retrovirales construcciones seguidas de diferenciación en macrófagos y dendríticas de las células en vitro.

Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos

Este estudio describe un método para aislar vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factores estimulantes de colonias de macrófagos de granulocitos inmunoestimulantes a partir de células madre embrionarias.

Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias

Este protocolo describe la robusta generación de macrófagos a partir de células madre pluripotentes inducidas por el hombre, y métodos para su posterior caracterización. La expresión del marcador de superficie celular, la expresión génica y los ensayos funcionales se utilizan para evaluar el fenotipo y la función de estos macrófagos derivados de iPSC.

Producción y caracterización de macrófagos humanos a partir de células madre pluripotentes

Aprende a diferenciar células T H GM a partir de células T CD4+ naïve de ratón. Este protocolo genera más del 50% de células productoras de GM-CSF para estudiar enfermedades inflamatorias como la esclerosis múltiple.

In Vitro Diferenciación del Factor del Granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) de ratón-producción de linfocitos de T (THGM) (Video) | JoVE Journal

In Vitro Diferenciación del Factor del Granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) de ratón-producción de linfocitos de T (T_HGM)

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