Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de la pseudoquinasa, de linaje mixto, similar al dominio de la quinasa, o MLKL, en la necroptosis, como la translocación de la membrana y la permeabilización en la unión de lípidos. La principal ventaja de estas técnicas es que implican directamente a MLKL como el ejecutor de la ruptura de la membrana plasmática en la necroptosis. Las imágenes de células vivas han revolucionado el campo de la investigación de la muerte celular, especialmente para la necroptosis mediada por MLKL.

La resonancia magnética nuclear es una técnica poderosa para monitorear la unión de lípidos a proteínas, como se demostró aquí para MLKL. Comience por sembrar cinco veces 10 al cuarto MLKL fibroblastos embrionarios de ratón knockout o MEFs que expresan el dominio ejecutor de MLKL fusionado a un casete de oligomerización y Venus en un mililitro de DMEM suplementado en placas de 24 pocillos para su incubación nocturna en una incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, trate las células con doxiciclina durante 12 horas para inducir la expresión del transgén, seguido de la adición de DMEM estándar suplementado con dimeriizador de proteínas de unión a FK506 y colorante fluorescente verde impermeable a la membrana para inducir la necroptosis.

Para controlar la muerte celular, coloque la placa en una unidad de imagen adecuada alojada en una incubadora de cultivo de tejidos de mamíferos y abra el software del sistema de imágenes. Seleccione la pestaña Programar próximos escaneos y seleccione la bandeja, el recipiente, los tipos de escaneo y el patrón de escaneo en la pestaña Diseño físico. Seleccione fluorescencia rápida en la pestaña Propiedades y haga clic en la ventana Línea de tiempo y el número total de puntos de tiempo y frecuencia de adquisición para agregar el tiempo de escaneo.

A continuación, haga clic en Aplicar para iniciar la adquisición de la imagen. Para cuantificar la necroptosis, seleccione el panel Tareas y coloque el cursor del ratón sobre el fondo de varias imágenes para establecer el nuevo análisis de recuento de objetos con un umbral de segmentación fijo por encima del nivel de fondo. A continuación, seleccione Vista previa para examinar los objetos fluorescentes de la imagen actual y refinar los niveles de umbral según sea necesario.

Se puede realizar una selección cuidadosa del umbral observando múltiples pozos en la placa y utilizando la función de vista previa en el software. Solo tenga en cuenta que debe usar la misma configuración de umbral para todos los pozos de la placa. Para integrar los recuentos de fluorescencia verde, en la pestaña Iniciar nuevo análisis, seleccione el intervalo de tiempo y los pocillos que se van a analizar e introduzca el nombre del trabajo de análisis.

A continuación, haga clic en Aceptar y haga doble clic en el nombre del trabajo para exportar los datos para un análisis adicional en un programa de software de gráficos adecuado. Para la unión lipídica de la MLKL por espectroscopia de resonancia magnética nuclear o RMN, utilice jeringas herméticas para alícuota de un miligramo por mililitro de los fosfolípidos de interés en viales de vidrio limpios para series individuales de titulación de RMN y coloque los viales bajo una corriente gaseosa de argón o nitrógeno durante cinco a 30 minutos. La dosificación de lípidos de disolventes volátiles como el cloroformo o el metanol debe realizarse rápidamente a partir de existencias mantenidas en hielo seco para minimizar las inconsistencias en las concentraciones de lípidos entre las muestras debidas a la evaporación del disolvente.

Al final del período de evaporación, use pinzas grandes para colocar los viales en el fondo de un matraz Buchner. Selle el matraz con un tapón de goma y conecte un tubo de plástico conectado a una línea de vacío para evacuar el contenido del vial bajo un vacío suave durante la noche para eliminar cualquier residuo orgánico. A la mañana siguiente, añadir tampón de RMN suplementado con detergente a la concentración experimental adecuada a cada vial de vidrio con una película lipídica y sonicar el vial en un baño de agua durante un máximo de 30 minutos, deteniendo la sonicación cada 10 minutos para comprobar la solubilización de la película lipídica.

Al final de la sonicación, deje que los viales se enfríen durante 15 minutos y realice una dilución en serie de las micelas de lípidos-detergente en tampón de RMN positivo para detergente, sonicando las mezclas 1:1 para la serie de concentraciones deseada. Prepare muestras de RMN de control y referencia de proteínas y aditivos en tampones de RMN detergentes negativos y detergentes positivos, respectivamente, añadiendo proteínas y aditivos a cada dilución de lípidos en tampones detergentes positivos. A continuación, transfiera el volumen adecuado de muestras a tubos de RMN de tamaño adecuado y cargue las muestras en el instrumento de RMN.

necroptosis completa de los MEFs knock-out de MLKL puede observarse en el plazo de una hora tras la oligomerización mediada por dímeros de las células preincubadas con doxiciclina que expresan el transgén fusionado. Esta necroptosis cinética rápida apoya el papel de MLKL como el ejecutor putativo de la ruptura de la membrana plasmática, lo que resulta en la producción de Venus puncta asociado a la membrana plasmática dentro de uno o dos minutos después del tratamiento con el dímero y la codificación de Venus de la periferia celular y el redondeo celular gradual dentro de dos a tres minutos. Bajo la necroptosis rápida, las células cambian de morfología de su forma alargada normal a redondeada e hinchada dentro de los cinco minutos posteriores a la oligomerización, parcialmente rotas a los 10 minutos y ampliamente desmanteladas con citosol desaparecido a los 20 minutos.

Los experimentos de unión de lípidos in vitro monitoreados por espectroscopia de RMN revelan cambios estructurales importantes en la proteína del dominio ejecutor de MLKL al unirse a los lípidos para desplazar la región del corsé inhibitorio de la conformación N-helicoidal cerrada a la conformación abierta e intrínsecamente desordenada, así como información por residuo en las mezclas de ambos conformadores. También se pueden monitorizar los porcentajes de conformadores cerrados y abiertos en una muestra determinada, lo que proporciona pruebas de apoyo a la interacción del dominio ejecutor de MLKL con los fosfolípidos y sugiere una relación directa entre MLKL y la membrana plasmática. Por lo tanto, al intentar cuantificar la muerte celular mediante este procedimiento, es importante saber y recordar que el tinte de unión al ADN tiene un umbral de fluorescencia más alto que la proteína de fluorescencia que normalmente codifica genéticamente.

Por esta razón, se pueden utilizar en paralelo. También hay que tener en cuenta que los lípidos micelares son sensibles a la temperatura y, por lo tanto, puede ser necesario optimizar la temperatura de la muestra de RMN. Por lo tanto, siguiendo este procedimiento, se podrían utilizar otras técnicas como la microscopía de reflexión interna total y la electromicroscopía para abordar la rapidez con la que se produce la ruptura celular en las células que se someten a necroptosis y dónde se localiza la ruptura en la membrana plasmática.

Además, se puede realizar termoforesis a microescala para validar ortogonalmente la unión de MLKL a los lípidos micelares. Las técnicas descritas en este video allanaron el camino para que los investigadores en el campo de la necroptosis exploraran el papel de MLKL como ejecutor de la ruptura de la membrana plasmática. No olvide que trabajar con cloroformo puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y trabajar en un área bien ventilada al realizar este procedimiento.