Name: Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprende a caracterizar la ruptura de membrana mediada por MLKL en necroptosis mediante microscopía de células vivas, microscopía electrónica de barrido y análisis de unión lipídica por RMN.

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<ol><li>Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development%2C+inflammation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development, inflammation and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).</li>
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<li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+secrets+of+fluorescent+proteins%3A+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586(2011).</li>
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<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
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Ofrecemos protocolos para técnicas que se combinaron implicado MLKL como el supuesto verdugo de ruptura de membrana plasmática24. Además de descifrar la red reguladora que regula MLKL-mediada de la necroptosis, estas técnicas se pueden utilizar independientemente para caracterizar otros sistemas biológicos adecuados. Prácticamente hablando, estas técnicas son herramientas de descubrimiento de medio a bajo rendimiento.
Habitualmente hemos utilizado proyección de imagen d...

Identificación de componentes genéticos de la necroptosis ha facilitado el uso de modelos animales para probar la implicación de la necroptosis en fisiología y enfermedad1,2,3,4,5. Nocaut de RIPK3 o MLKL en ratones tenía implicación mínima en desarrollo y adulto homeostasis sugiriendo que necroptosis no es esencial para la vida3,6. Por otra parte, algunas especies no contienen genes RIPK3 o MLKL, apoyando la función de no esenciales de la necroptosis en animales7,8. Por otro lado, desafiando los modelos animales knockout con diversas patologías inducidas en el laboratorio ha revelado un papel importante de la necroptosis en inflamación, la inmunidad innata y la infección viral9,10, 11 , 12.
Necroptosis puede activarse de varias maneras mediante señales a través de sensores de diferentes inmunidad innata, todos los cuales resultan en la activación de RIPK31,13,14. RIPK3 activa a su vez fosforila y activa MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. El más estudiado, y tal vez lo más complejo, conduciendo a la activación de RIPK3 implica la muerte del receptor la ligadura, que bifurca en base a la composición aguas abajo de los complejos de señalización o inducir apoptosis o necroptosis1. Necroptosis sobreviene cuando señalización mediante RIPK1 se favorece y da lugar a compromiso de RIPK319,20. Este resultado es fácilmente favorecido sobre inhibición farmacológica o genética supresión de caspasa 8, un inhibidor endógeno putativo de la necroptosis que mantiene necroptosis en Bahía. RIPK1 ata a y activa RIPK3. Otra manera de activar necroptosis es a través de receptores Toll-like TLR3/TLR4 señalización, que se activa y activa RIPK3 TIR-dominio-que contienen adaptador induce interferón-β (TRIF)21. Sin embargo, otra forma de morir por necroptosis es por activación del sensor de ADN DAI, que directamente se activa y activa RIPK322.
MLKL es una proteína citosólica compuesta por un dominio N-terminal hélice paquete (NB) y un dominio de pseudokinase C-terminal (psKD) Unidos por una abrazadera reguladora región3. En las células normales, MLKL se encuentra en el citosol donde se cree que en un complejo inactivo con RIPK314. Activación de la necroptosis desencadena la fosforilación RIPK3 de MLKL en el circuito de activación de la psKD y potencialmente otros sitios en la NB y soporte3,15,23. La fosforilación induce un cambio conformacional en MLKL que produce disociación de RIPK314. Cambios conformacionales mal entendidos suelte la abrazadera del psKD24. El soporte, que contiene 2 hélices, media Oligomerización de MLKL en un trímero putativo el C-terminal hélice25. La hélice N-terminal de la abrazadera inhibe el dominio NB, que es esencial para la permeabilización de la membrana24,26. En aislamiento, dominio NB es suficiente para inducir la permeabilización de la membrana plasmática y necroptosis16,24,27. La actividad de pro-necroptotic de nota fue reconstituida en fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en MLKL (mlkl- / - MEFs). NB es un dominio de unión a lípidos que compromete preferentemente el difosfato de fosfatidilinositol 4,5 de fosfolípidos (PIP2). Hemos propuesto un mecanismo paso a paso de activación de MLKL, donde Oligomerización de apoyo facilita el reclutamiento de MLKL a la membrana plasmática a través de las interacciones débiles de NB con el PIP2 grupo de cabeza polar24. En la membrana, el NB somete a exposición regulada de un sitio de unión de alta afinidad adicional PIP2, el que es enmascarado por la rodillera en MLKL inactivo. En general, las múltiples interacciones de NB con PIP2 desestabilizan la membrana del plasma a su ruptura, aunque no ha aclarado el mecanismo molecular de estos eventos.
Aquí ilustran métodos específicos utilizados para caracterizar la función de MLKL como verdugo de la necroptosis24. En particular, nos centramos en el más mínimo dominio MLKL, NB y ortesis (NBB), que está regulado por la inhibición de la rodillera y pueden activarse a través de la dimerización forzada para inducir necroptosis y ruptura de la membrana plasmática. Describimos nuestro sistema de expresión inducible con forzada dimerización de FKBP-mediada inducida por medicamentos para la proyección de imagen de células vivas y la microscopia electrónica de las células que experimentan necroptosis. Además, ilustramos nuestro análisis en vitro NMR de las interacciones de NBB con fosfatidilinositoles (PIPs).

<table><tbody><tr><td>Clonación y generación de líneas celulares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188 plásmido</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>transactivador Tet-On</td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon et al., 2014</td></tr><tr><td>Clorhidrato de blasticidina S</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td><Cuantificación > muerte celular fuerte y microscopía de células vivas</Doxiciclina fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Clontech 631311</td><td>CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B/B Homodimeriizador AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Verde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N Cloruro de amonio Cambridge</td><td>Isotope Laboratories</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>DTT deuterado</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-D-Maltopirranósido</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (cerebro, cerdo) (sal de amonio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearolel-sn-glicero-3-fosfoinositol (sal de amonio) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositol) (sal de amonio) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>Specialized Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR o ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>Imágenes de microscopía de células vivas</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp;</td><td>Microscopio electrónico</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>Análisis de imágenes</td></tr><tr><td>FEI MAPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.fei.com/software/maps/</td> <td>EM análisis</td></tr><tr><td>TopSpin v3.2</td><td>Bruker BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td><td>Recopilación de datos de RMN</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&nbsp;</td><td>Análisis de datos de RMN</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Intelligent Imaging Innovations)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>Microscopía confocal</td></tr></tbody></table>

caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado mlkl en necroptosis

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis es una vía de muerte celular programada desencadenada por la activación de los receptores interactúan quinasa 3 (RIPK3), que fosforila y activa la pseudokinase quinasa-como dominio de linaje mixto, MLKL, ruptura o permeabilizar la membrana plasmática . Necroptosis es un inflamatorio asociado a múltiples patologías, incluyendo autoinmunidad, enfermedades infecciosas y cardiovasculares, derrame cerebral, neurodegeneración y cáncer. Aquí, describimos protocolos que pueden utilizarse para caracterizar MLKL como el verdugo de la ruptura de la membrana plasmática de la necroptosis. Visualizamos el proceso de la necroptosis en las células usando proyección de imagen de células vivas con microscopía de fluorescencia confocal y convencionales y en células fijas usando microscopia electrónica, que reveló a la redistribución de MLKL desde el citosol al plasma membrana antes de la inducción de grandes agujeros en la membrana plasmática. Presentamos en vitro el análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) con lípidos para identificar supuestos moduladores de la necroptosis MLKL mediada. Basado en este método, identificamos cuantitativas preferencias de unión a lípidos y fosfatidil-inositol fosfatos (PIPs) como crítico aglutinantes de MLKL que se requieren para targeting de membrana plasmática y permeabilización en necroptosis.

Visualizar la ejecución de la necroptosis regulado en células vivas ha sido posible a través de la expresión inducible de una mínima construcción MLKL truncada, NBB140-2xFV-Venus. Esta construcción mantiene la capacidad de inducir la permeabilización de la membrana plasmática y se activa a través de Oligomerización Dim-inducida de la cassette FKBP (2xFV). Observar y cuantificar necroptosis por microscopía de células vivas imágenes, monitoreo cinéticamente (cada 5 min) la absorc...

Divulgamos los métodos para la caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en necroptosis incluyendo proyección de imagen de la microscopia convencional y confocal de células vivas, análisis de microscopia electrónica y enlace de lípidos basada en NMR.

Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de la pseudoquinasa, de linaje mixto, similar al dominio de la quinasa, o MLKL, en la necroptosis, como la translocación de la membrana y la permeabilización en la unión de lípidos. La principal ventaja de estas técnicas es que implican directamente a MLKL como el ejecutor de la ruptura de la membrana plasmática en la necroptosis. Las imágenes de células vivas han revolucionado el campo de la investigación de la muerte celular, especialmente para la necroptosis mediada por MLKL.La resonancia magnética nuclear es una técnica poderosa para monitorear la unión de lípidos a proteínas, como se demostró aquí para MLKL. Comience por sembrar cinco veces 10 al cuarto MLKL fibroblastos embrionarios de ratón knockout o MEFs que expresan el dominio ejecutor de MLKL fusionado a un casete de oligomerización y Venus en un mililitro de DMEM suplementado en placas de 24 pocillos para su incubación nocturna en una incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, trate las células con doxiciclina durante 12 horas para inducir la expresión del transgén, seguido de la adición de DMEM estándar suplementado con dimeriizador de pr

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de eventos de señalización intracelular inducidos en células viables por interacción física con células muertas o moribundas adyacentes. El protocolo se centra en los eventos de señalización inducidos por el reconocimiento de las células muertas mediado por receptores, en contraposición a su captación fagocítica o liberación de mediadores solubles.

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Aquí utilizamos electroforesis en agarosa semi desnaturalización bidimensional para confirmar la presencia de fibras de amiloide como de tamaño heterogéneo y excluir la posibilidad de que la heterogeneidad de tamaño es debido a la disociación de las fibras amiloides en el gel proceso en ejecución.

Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como

Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.

Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos

La amplificación de la señal de tiramida durante la tinción inmunofluorescente permite la detección sensible de RIPK3 y MLKL fosforilados durante la necroptosis inducida por ZBP1 después de la infección por HSV-1.

Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas

Este protocolo se basa en la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-AAD para detectar la muerte celular, utilizando toda la célula y empleando microscopía electrónica de barrido para observar la morfología de la membrana celular.

Muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y su validación

Este protocolo describe un método de imágenes de células vivas para monitorear la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis, utilizando sondas fluorescentes que detectan cambios en la integridad y acidificación de la membrana lisosomal.

Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

Se describe la forma de medir cerca de la membrana y la dinámica global de calcio intracelular en los astrocitos cultivados usando la reflexión total interna y microscopía de epifluorescencia.

Cerca de la medición de la membrana plasmática y Global Dynamics calcio intracelular en los astrocitos

Endocitosis regulado regula los niveles de expresión de la superficie celular de la mayoría de las proteínas de la membrana. Aquí se utilizan los reactivos reducible, la membrana impermeant biotinilación para medir la tasa de endocitosis del transportador de dopamina (DAT), una proteína de membrana politópica. El método facilita un método directo para medir la tasa de endocitosis de la mayoría de las proteínas de la membrana plasmática.

Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Aprende a caracterizar la ruptura de membrana mediada por MLKL en necroptosis mediante microscopía de células vivas, microscopía electrónica de barrido y análisis de unión lipídica por RMN.

Caracterización de la ruptura de la membrana plasmática mediado MLKL en Necroptosis

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