Medida sensible de la mitofagia por reportero fluorescente flujo Cytometry usando el pH-dependiente mt-Keima

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una técnica sensible para medir la actividad de la mitofagia celular mediante citometría de flujo. Aquí demostramos que este método se utilizó con éxito para evaluar el aumento dramático en la mitofagia de las células HeLa, después del tratamiento con CCCP, un desacoplador mitocondrial. Esta técnica permite medir la actividad de los mitófagos de forma muy rápida y sencilla.

La principal ventaja de esta técnica es que se puede medir con sensibilidad la actividad de los mitófagos en células vivas sin necesidad de tinción adicional. Por lo tanto, esta técnica podrá, en última instancia, ayudar a comprender el mecanismo y el papel fisiológico de los mitófagos. Jee-Hyun Um y Young Yeon Kim de mi laboratorio demostrarán el procedimiento.

Comience este procedimiento preparando el mt-Keima, un lentivirus Keima dirigido a las mitocondrias. La primera siembra HEK293T células en una placa de cultivo recubierta de poli-L-lisina y las cultiva a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos durante un día. Al día siguiente, transfecte las células HEK293T con ADN lentiviral mt-Keima y empaqueta la DNasa utilizando un reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Después de ocho horas de transfección, retire el medio de transfección y agregue ocho mililitros de medio fresco. Recoja los medios que contienen partículas virales 48 horas después y elimine los desechos celulares mediante centrifugación. A continuación, filtre los medios que contienen virus con un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros.

Coloque las células HeLa-Parkin en una placa de cultivo de 60 milímetros un día antes de cosechar el lentivirus mt-Keima y cultive las células con cuatro mililitros de medio de crecimiento durante un día a 37 grados Celsius en una incubadora. Al día siguiente, retire el medio de crecimiento, agregue un milímetro de medio de virus mt-Keima, agregue dos mililitros adicionales de medio de crecimiento que contenga 3 microlitros de solución madre de polibreno e incube las células durante un día en una incubadora de CO2. A las 24 horas después de la infección, retire el medio viral, lave las células dos veces con PBS y agregue cuatro mililitros de medio de crecimiento.

Para eliminar las células no infectadas, trate las células durante dos días con dos microgramos por microlitro de puromicina. Prepare medios frescos que contengan 10 CCCP micromolares. Retire el medio cultivado y agregue cuatro mililitros de medio de crecimiento fresco que contenga CCCP.

Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2 durante seis horas. Retire el medio de crecimiento y lave las células una vez con PBS. Separar las células mediante tratamiento con solución de tripsina EDTA.

Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspenderlas en un mililitro de PBS. Transfiera las células en un tubo FACS y colóquelas en hielo. Para la citometría de flujo, encienda el citómetro de flujo e inicie el software de análisis.

Genere un nuevo experimento y seleccione BV605 para el láser violeta y PE-CF594 para el láser amarillo-verde en la ventana de parámetros. En primer lugar, se ejecutó una muestra de control de células no infectadas con el lentivirus mt-Keima. En el gráfico de dispersión directa frente a dispersión lateral, dibuje una puerta, usando el icono de polígono, alrededor de las celdas vivas y elimine las celdas muertas y los restos de celda.

A continuación, ejecute células HeLa-Parkin infectadas con el lentivirus mt-Keima. En el diagrama de puntos de BV605 frente a la dispersión lateral, ajuste el voltaje para que las células HeLa-Parkin que expresan mt-Keima se distingan claramente de las células de control que no expresan mt-Keima. A continuación, en el diagrama de puntos de PE-CF594 frente a la dispersión lateral, ajuste el voltaje para que las células HeLa-Parkin que expresan mt-Keima se distingan claramente de las células de control.

A continuación, en el diagrama de puntos de BV605 frente a PE-CF594, seleccione la población de células mt-Keima positiva dibujando una puerta con el icono de polígono. A continuación, cree otro diagrama de puntos de BV605 frente a PE-CF594 que muestre solo las celdas compuertas de mt-Keima. En este diagrama de puntos, dibuje una puerta alrededor de las células mt-Keima positivas sin tratar.

Esta puerta se conoce como la puerta baja. A continuación, dibuja otra puerta que contenga la región por encima de la puerta baja. Esta puerta se conoce como la puerta alta porque contiene células con alta actividad mitofágica.

A continuación, seleccione el menú Mostrar jerarquía de población. El valor Porcentaje de padre representa el porcentaje de células en la puerta alta entre la población mt-Keima positiva. Ahora ejecute cada muestra y registre al menos 10 000 eventos en la puerta de parada mt-Keima.

El análisis por citometría de flujo de células HeLa no tratadas que expresaban mt-Keima mostró un nivel bajo de mitofagia. El tratamiento con CCCP indujo un aumento dramático de las células mitofágicas en la puerta superior. El porcentaje de células mitofágicas aumentó más de 10 veces a las seis horas después del tratamiento con CCCP.

Este aumento de la mitofagia por el tratamiento con CCCP se abolió por completo mediante el tratamiento conjunto con bafilomicicina A. Una vez que las células que expresan mito-Keima están listas, la medición de mitófagos mediante citometría de flujo se puede realizar en una hora si se prepara adecuadamente. Para un análisis preciso de mitófagos por citometría de flujo, es importante configurar las compuertas alta y baja correctas. A la hora de analizar nuevos tipos de células es necesario utilizar células conocidas, como las células HeLa, como control.

Además, es importante recordar que el mitófago debe estar completamente confirmado por características adicionales, como una disminución de la proteína mitocondrial y una reducción del ADN mitocondrial. Esta técnica se puede aplicar a una amplia variedad de tipos de células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar mitófagos por citometría de flujo.