Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes
24 de agosto de 2018
Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.
En el campo de C. elegans, este método puede ayudar a responder preguntas clave que requieren la producción de grandes poblaciones de nematodos y muestras utilizando cultivo en placa. Las principales ventajas de este protocolo son su fácil establecimiento y su facilidad de descripción, incluidas las trampas y las aplicaciones. Después de obtener una población sincronizada de nematodos, agregue aproximadamente un mililitro de tampón M nine a las placas y distribuya cuidadosamente el tampón balanceando las placas.
Después de esto, recoja los nematodos en un tubo de 15 mililitros. Ahora, invierta el tubo y use un microscopio para evaluar la densidad de los nematodos. Ajuste la densidad de la suspensión según sea necesario y continúe evaluándola bajo el microscopio.
Aplique 150 microlitros de la suspensión directamente sobre las placas con puntas de pipeta modificadas. Para asegurar una distribución uniforme de nematodos entre las placas, invierta el tubo de suspensión a intervalos regulares. En primer lugar, lavar los nematodos con una punta de pipeta modificada con aproximadamente 500 microlitros de tampón M nine.
Usando el mismo tampón, continúe separando los nematodos hasta que la mayoría de los animales se recolecten en suspensión. A continuación, tome los nematodos con una punta de pipeta modificada y transfiéralos a una placa con OP50. Las puntas de pipeta modificadas disminuyen el esfuerzo cortante y el daño a los nematodos debido a un diámetro mayor.
Luego, deje que el plato se seque. Antes de recolectar muestras, prepare nitrógeno líquido para congelar los nematodos recolectados. A continuación, coloque el tampón M nine en hielo.
Aplique un mililitro de tampón M nine a cada plato y revuelva suavemente para lavar cada plato. Luego, tome el volumen del tampón M nine y transfiéralo a nuevos tubos de 15 mililitros. Centrifugar el tubo brevemente a 800 veces g, antes de eliminar la mayor parte del tampón M nine.
A continuación, lave las muestras tres veces con 10 mililitros de tampón M nine para eliminar las bacterias. Con una pipeta de vidrio, transfiera cada pellet a un tubo vacío de 1,5 mililitros. Utilice la pipeta de vidrio para extraer un mililitro de tampón M nine del segundo tubo de 1,5 mililitros, para enjuagar los nematodos de la pared de la pipeta.
Luego, lave los nematodos restantes de los tubos de 15 mililitros y transfiéralos a los tubos de muestra. A continuación, centrifugar los tubos de muestra a 19.000 veces g durante un minuto y eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante. Luego, selle cada tubo con una película de parafina y congélelos en nitrógeno líquido inmediatamente.
Guarde los tubos a menos 80 grados centígrados hasta la preparación del lisado. Agregue los mismos volúmenes de perlas de óxido de circonio de 0,5 milímetros y el doble del volumen de tampón de lisado con cóctel de inhibidores de proteinasa a cada muestra congelada. A continuación, coloque los tubos en un homogeneizador durante un minuto a velocidad nueve.
Centrifugar las muestras durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y 19.000 veces g. Finalmente, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo en hielo y guárdelo a menos 80 grados Celsius para futuros experimentos. En este protocolo, se cultivaron grandes cantidades de C. elegans para su aplicación en la investigación de la diabetes.
El número de nematodos recolectados se correlacionó con el rendimiento de proteína del lisado, lo que demuestra que se puede lograr un aislamiento cuantitativo de proteínas reproducible utilizando este protocolo. Aquí se muestran los análisis de espectrometría de masas del metabolito reactivo metilglioxal y los productos finales de glicación avanzada formados por la exposición al metilglioxal. Se compararon los nematodos tratados con glucosa y los controles.
La transferencia de nematodos a través de una pipeta puede crear tensión de cizallamiento, lo que puede dañar a los nematodos. Los niveles de estrés oxidativo en nematodos pipeteados y nematodos transferidos con un alambre metálico no difirieron utilizando este protocolo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el western blot, con el fin de responder preguntas adicionales en proteómica.
Este protocolo también facilita experimentos que relacionan múltiples parámetros con la misma población.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Este enfoque facilita la producción de poblaciones y muestras grandes de nematodos, mejorando la comparabilidad de los resultados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Microbiología
Antecedentes
- Caenorhabditis elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado.
- El cultivo en placas ofrece ventajas frente al cultivo líquido.
- Comprender la dinámica de poblaciones de nematodos es fundamental para diversas aplicaciones de investigación.
- Este método aborda preguntas clave en el campo de C. elegans.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo confiable para el cultivo de C.elegans en medios sólidos.
- Permitir la producción de poblaciones sincronizadas de nematodos.
- Facilitar experimentos que requieren tamaños de muestra grandes.
Métodos Utilizados
- Sincronización de poblaciones de nematodos.
- Aplicación del tampón M nueve a placas.
- Evaluación microscópica de la densidad de nematodos.
- Ajuste de la densidad de la suspensión según sea necesario.
Resultados principales
- Establecimiento exitoso de cultivos de nematodos a gran escala.
- Mejora en la comparabilidad de los resultados obtenidos mediante cultivo en placas.
- Identificación de posibles dificultades en el protocolo.
- Aplicaciones en diversos contextos de investigación.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona un método robusto para el cultivo de C.elegans.
- Mejora la capacidad de realizar experimentos a gran escala.
- El método es sencillo y reproducible.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El cultivo a gran escala de C. elegans permite el aislamiento cuantitativo y reproducible de proteínas para el descubrimiento de biomarcadores relacionados con la diabetes, apoyando la validación de dianas en complicaciones neurodegenerativas. Este método proporciona un protocolo escalable y con mínimo estrés por cizalladura para el análisis proteómico de AGEs y ERO, directamente aplicable a la reducción mecanicista de riesgos en la fase inicial del descubrimiento de fármacos. Al facilitar la preparación sincronizada de poblaciones bajo condiciones controladas, mejora la confianza predictiva en modelos preclínicos de la patología diabética.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas que relacionan la exposición a la glucosa con la formación de AGE y ERO en modelos neuronales.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas mediante la correlación reproducible del rendimiento proteico con el número de nematodos.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al proporcionar datos proteómicos cuantitativos para la identificación de compuestos prometedores en las vías de complicaciones diabéticas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Preparación para ensayos: Prepara sistemas biológicos validados para aplicaciones posteriores de inmunotransferencia y espectrometría de masas.
- Reproducibilidad: Estandariza la preparación de muestras para minimizar el impacto fisiológico y garantizar resultados proteómicos consistentes.
- Escalabilidad: Permite la integración de múltiples análisis bajo condiciones de cultivo idénticas, compatible con cribado de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Apoya el estudio de complicaciones diabéticas mediante modelos de C. elegans que exhiben acumulación de AGE y ROS independientemente de factores de confusión vasculares.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al permitir una preparación consistente de muestras en diferentes condiciones experimentales.
- Avance ajustado al riesgo: Proporciona lisados confiables para el análisis de biomarcadores, reduciendo los falsos positivos en la priorización de objetivos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se sitúa dentro del continuo de descubrimiento, desde la comprobación de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, apoyando específicamente la investigación sobre neurodegeneración relacionada con la diabetes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre alteraciones metabólicas en la diabetes mediante análisis cuantitativo de proteínas y metabolitos.
- Tamizaje: Proporciona muestras listas para ensayos con densidad estandarizada y mínimo estrés cortante para una evaluación fiable de compuestos.
- Análisis: Permite la medición por espectrometría de masas de metilglioxal y AGEs, proporcionando lecturas cuantitativas para la comparación de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento de fenotipos neuronales con la continuidad preclínica mediante flujos de trabajo proteómicos consistentes.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el cultivo a gran escala de nematodos en múltiples estudios relacionados con la diabetes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista en los modelos de complicaciones diabéticas.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad en los flujos de trabajo proteómicos, minimizando la variabilidad en la preparación de lisados.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance mediante datos confiables de biomarcadores, reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas de los programas contra la diabetes.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en datos reproducibles de modulación de AGE y ERO.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo y técnicas de sincronización de C. elegans.
- Necesita acceso a centrífugas, homogenizadores y nitrógeno líquido para el procesamiento de muestras.
- Exige estandarización entre equipos en la evaluación de la densidad de suspensión y en los protocolos de lavado.
- Incluye consideraciones de adaptación al transferir entre placas con diferentes condiciones experimentales.
- Comprende limitaciones prácticas relacionadas con la mitigación del estrés por cizallamiento durante los pasos de pipeteo, abordadas mediante puntas modificadas.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
