Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

El enfoque del que vamos a hablar hoy se ha derivado para comparar las propiedades y las actividades funcionales de las células T derivadas de tejidos y de sangre periférica. La importancia del tema se ejemplifica por el hecho de que las células T de sangre periférica representan solo el 20% del total de células T en un cuerpo. Ser capaz de estudiar un pequeño número de células T derivadas de tejidos es muy esencial, y eso es exactamente lo que hemos logrado.

La principal ventaja de esta técnica es que requiere un menor número de células y menores volúmenes de reactivos que las técnicas tradicionales. Comience usando pinzas de polipropileno tipo tijera para sumergir los cubreobjetos de vidrio en una solución ácida de piraña recién preparada durante 25 a 30 minutos. Al final del lavado, enjuague los cubreobjetos siete veces en un volumen fresco de agua ultrapura para cada lavado.

A continuación, deja los cubreobjetos mojados a un lado para que el agua restante se deslice del vaso limpio. Cuando los cubreobjetos estén secos, alícuota dos microlitros de la mezcla final de liposomas precisamente en el centro de un canal deslizante autoadhesivo dentro de una campana de flujo estéril. Y alinee inmediata pero cuidadosamente un cubreobjetos limpio y seco con el portaobjetos para permitir que el cubreobjetos se baje suavemente sobre el lado adhesivo del portaobjetos.

Y use el anillo exterior de las pinzas tipo tijera de polipropileno para aplicar una presión suave al contacto periférico del cubreobjetos con el portaobjetos, asegurándose de que el portaobjetos esté firmemente unido al portaobjetos para evitar fugas. A continuación, dé la vuelta a la diapositiva y utilice un marcador permanente para dibujar cuatro puntos alrededor de la bicapa en el lado externo del conjunto de la diapositiva. Antes de la primera inyección, designe un puerto del canal como puerto de entrada y el otro como puerto de salida, manteniendo esta designación durante todo el experimento.

Para evitar la formación de burbujas, inserte el extremo de la punta de la pipeta directamente en el puerto de entrada hasta que sienta que el sello de goma del canal deslizante penetra con la punta. Llene lentamente el canal con 50 microlitros de tampón de ensayo tibio. Inyecte 200 microlitros de cloruro de níquel (II) en una solución de bloqueo de caseína en el puerto de entrada.

Y retire 50 microlitros del tampón del puerto de salida. Después de una incubación de 45 minutos, retire el exceso de solución de caseína del puerto de salida. Inyecte 100 microlitros de un ICAM-1 en solución de estreptavidina en el puerto de entrada para una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, retire el exceso de solución de proteínas del puerto de salida. Y lavar la bicapa dos veces con 100 microlitros de tampón de ensayo por lavado. A continuación, etiquete las bicapas con 100 microlitros de anticuerpo anti-CD3 conjugado con fluoro-4 durante 45 minutos a temperatura ambiente.

Seguido de dos lavados en 100 microlitros de tampón de ensayo por lavado, como se ha demostrado. Para obtener imágenes de las interacciones de la bicapa de células T, coloque el portaobjetos en la etapa calentada a 37 grados Celsius de un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Y ajuste la etapa usando las marcas de tinta para centrar la bicapa en el objetivo de 100 potencias.

Para obtener imágenes de liberación de gránulos, agregue fragmentos FAB del anticuerpo anti-CD107A conjugados con fluorescencia a la suspensión de células T CD4. Y vuelva a suspender las células marcadas en 50 microlitros de tampón de ensayo para inyectarlas en el puerto de entrada del canal de portaobjetos. A continuación, seleccione el número adecuado de campos experimentales y grabe imágenes de cada campo una vez por minuto durante 30 minutos después de la inyección.

En este experimento representativo, no se observaron diferencias entre las células T CD8 que formaron sinapsis inmunológicas clásicas en las bicapas lipídicas construidas en la celda de flujo o en el portaobjetos de flujo multicanal. Tras la interacción de la bicapa lipídica, las células T CD4 establecieron sinapsis inmunitarias maduras, pero liberan o no gránulos, liberan gránulos sin la formación de sinapsis maduras, o no forman sinapsis ni liberan gránulos. Cabe destacar que las células T CD4 derivadas de células mononucleares de sangre periférica pueden comenzar a liberar gránulos casi dos veces más rápido que las células CD4 derivadas de los ganglios linfáticos.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener una temperatura constante y pipetear lentamente para que no se formen burbujas. Además de nuestras capacidades para investigar una interfaz bicapa de células T, este enfoque también nos permitiría realizar una tinción intercelular de las células T que tocaron la bicapa. Lo que facilitaría significativamente una cantidad de información que se puede utilizar para describir células T particulares derivadas de tejido linfoide u otros tejidos.

No olvide que trabajar con la solución de piraña es extremadamente peligroso, y es crucial que use el EPP adecuado mientras intenta este procedimiento.