Name: Múltiplex análisis farmacológico por la dilusión del isótopo HPLC-MS/MS de los antibióticos en enfermedades graves (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Aprenda a cuantificar antibióticos en suero mediante HPLC-MS/MS con dilución de isótopos para monitoreo terapéutico en unidades de cuidados intensivos. Este protocolo permite ajustar dosis según la susceptibilidad de patógenos en 30 minutos.

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Los autores agradecen a Dr. Schütze por su ayuda a establecer el método presentado y Dr. Zoller por el valioso aporte con respecto a la gama de calibración apropiada. Los autores reconocen también el personal técnico de las instalaciones de la espectrometría de masas.

Nota: Se recomienda para trabajar en una campana de humos al manipular disolventes orgánicos, como el metanol. Preparar todos los búferes y fases móviles en matraces aforados. Si no indique lo contrario, las soluciones se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta 1 mes después de la preparación.
1. preparación de los calibradores y las muestras de Control de calidad
Nota: Una hoja de análisis de datos correspondientes para la preparación de soluciones stock y spike se da en el Archivo suplementario. Por razones de trazabilidad, inserte el fabricante, número de catálogo y mucho número de cada antibiótico en las columnas correspondientes. Disolver todos los antibióticos en una cámara frigorífica a 4 ° C y mantener el tiempo de trabajo tan corto como sea posible.
<ol><li>Preparar 100 mL de metanol al 25% en agua: rellenar previamente un matraz aforado de 100 mL con 25 mL de metanol absoluto y completar hasta 100 mL con agua destilada.</li>
	<li>Preparar 10 mL de ácido acético de 200 mM en agua: rellenar previamente un matraz aforado de 10 mL con 9 mL de agua de calidad HPLC, agregar 115 μl de ácido acético glacial (99.5% de pureza, 17,4 M) y agregar agua destilada hasta 10 mL.</li>
	<li>Preparar 25 mL de metanol al 25% en agua con ácido acético al 20 mM: rellenar previamente un matraz aforado de 25 mL con 2,5 mL de la solución de ácido acético acuoso 200 mM, añadir 6,25 mL de metanol absoluto y llenar el matraz de 25 mL con agua destilada.</li>
	<li>Utilice una balanza de precisión para pesar la cantidad adecuada de antibióticos en tubos cónicos de 15 mL como se describe en el Archivo suplementario en el peso inicialde la columna.</li>
	<li>Preparar las soluciones madre de las fluoroquinolonas, ciprofloxacino y moxifloxacina en el 25% metanol-agua, incluidas 20 mM acético ácido. Para ello, agregue el volumen correspondiente a las cantidades ponderadas como se describe en el Archivo suplementario en la columna "volumen final". Disolver rápidamente los antibióticos de fluoroquinolona en un baño de ultrasonido por 2 min y todo con un vórtex intenso.</li>
	<li>Preparar soluciones de cefepima, linezolid, meropenem y piperacilina en el 25% de metanol-agua. Para ello, agregue el volumen correspondiente a las cantidades ponderadas como se describe en el Archivo adicional en el volumen final de la columna y disolver rápidamente los antibióticos con un vórtex intenso. Meropenem se disuelven como la última sustancia.</li>
	<li>Combinar las soluciones stock de los antibióticos como se describe en la tabla de volumen correspondiente de solución madre en el Archivo suplementario para rendimiento de espiga-soluciones concentradas diez veces.</li>
	<li>Punto nueve volúmenes de suero libre de drogas con un volumen de las soluciones de punto concentrada diez veces para obtener los calibradores de suero 0 – 7 y los controles de calidad (QC) un-D. Por ejemplo, Añadir 0,5 mL de solución de punto a 4,5 mL de suero en un tubo de polipropileno de 10 mL e incubar durante 15 min en el almacenamiento en frío a 4 ° C en un mezclador de rodillos a 50 rpm.</li>
	<li>Utilizar una pipeta repetitiva para generar 100 alícuotas de μl de los calibradores y QCs en tubos de polipropileno de 1.5 mL.</li>
	<li>Almacenar los calibradores, controles de calidad y soluciones antibióticas a-80 ° C hasta por seis meses.</li>
	<li>Para cada antibiótico, también preparar una solución limpia que contiene 1.000 mg/L de un antibiótico único. Diluir la solución correspondiente con un diluyente apropiado (por ejemplo, para ciprofloxacin, use 25% metanol-agua 20 mM acético). Nota: Las soluciones de antibióticas aseadas son necesarias para la afinación de instrumento sólo.</li>
</ol>2. preparación de la mezcla de estándares internos
Nota: Los estándares internos son contrapartes marcada con isótopo de los analitos de interés que se añaden a una muestra durante la limpieza de la muestra. Como las normas internas tienen casi idénticas propiedades físico-químicas en general a sus homólogos sin etiqueta, compensan los efectos de la matriz de una muestra determinada.
<ol><li>Preparar 10 mL de metanol al 50% en agua añadiendo 5 mL de metanol absoluto a un matraz de 10 mL agitar y completar a 10 mL con agua destilada.</li>
	<li>Preparar 10 mL de metanol 50% en agua, incluyendo el ácido acético 20 mM. Para ello, añada 1 mL de ácido acético de 200 mM a un matraz de 10 mL, agregar 5 mL de metanol absoluto y completar hasta 10 mL con agua destilada.</li>
	<li>Generar soluciones de estándares internos (si) con 1.000 mg/L en los frascos de proporcionado por el fabricante. Disolver el cefepime -13C12D3 sulfato en agua destilada, meropenem-D6, linezolid-D3y piperacilina-D5 en una solución de metanol-agua 50%. Ciprofloxacina-D8 en 50% de metanol-agua con 20 mM acetato y moxifloxacina clorhidrato -13C1D3 en agua destilada con acetato de 20 mM se disuelven.</li>
	<li>Combinar las soluciones stock es en un tubo de polipropileno de 1.5 mL para producir una mezcla estándar interna concentrada por cinco veces. Añadir 10 μl de cefepime -13C12D3, 10 μl de meropenem-D6, 1 μl de ciprofloxacina-D8, 2 μl de moxifloxacina clorhidrato -13C1D3, 2 μl de linezolid-D 3y 10 μl de piperacilina-D5 a 965 μl de metanol-agua de 25%.</li>
	<li>Almacenar las soluciones stock estándar internas y la quíntuple mezcla concentrada es a-80 ° C.</li>
</ol>3. paciente almacenamiento
Nota: Asegúrese de que el suero se obtiene tan rápido como sea posible y que se mantenga la cadena de frío de las muestras congeladas.
<ol><li>Recoger la sangre en los tubos de suero.</li>
	<li>Deje que el coágulo de sangre de 20-30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Separar el suero de la sangre por centrifugación a 2.000 x g por 10 min.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un tubo limpio de polipropileno.</li>
	<li>Almacenar el suero hasta seis meses a-80 ° C hasta que se ensayaron. También puede almacenar las muestras hasta 3 días a-20 ° C.</li>
</ol>4. preparación tampón para cromatografía
<ol><li>Para preparar 1 M formiato de amonio en agua, disolver 6,306 g de formiato de amonio en 100 mL de agua de calidad HPLC utilizando un matraz de 100 mL batido. Almacenar la solución hasta 1 mes a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar el móvil un [formiato de amonio 10 mM en ácido fórmico-agua (99.9:0.1 v/v)] de la fase. Rellenar previamente un matraz aforado de 1.000 mL con 500 mL de agua de calidad HPLC, añadir 1 mL de ácido fórmico y 10 mL de la solución de formiato de amonio de 1 M y completar hasta 1.000 mL con agua de calidad HPLC. Fase móvil A la transferencia a un frasco de vidrio limpio y conectar al sistema de HPLC. Fase móvil de la tienda hasta 2 semanas a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar la fase móvil metanol absoluto B. transferencia grado HPLC en un frasco de vidrio limpio y conectar al sistema de HPLC.</li>
	<li>Utilizar metanol absoluto como disolvente de lavado de la aguja y conecte el tubo correspondiente a la botella de vidrio que contiene la fase móvil B.</li>
	<li>Generar el sello y purgación solvente de ácido fórmico de metanol-agua (7:92.9:0.1, v/v/v). Rellenar previamente un matraz aforado de 1.000 mL con 500 mL de agua destilada, agregar 70 mL de metanol absoluto, 1 mL de ácido fórmico y añadir agua destilada a 1000 mL. Transferir el solvente a un frasco de vidrio limpio y conectar con el sistema HPLC. Nota: Varios sistemas de muestreadores utilizan un fuerte y un solvente de lavado de aguja débil. En tal caso, preparar las soluciones de lavado según las recomendaciones del fabricante. Por ejemplo, el lavado fuerte con alcohol metanol-agua-isopropylic (70:20:10, v/v/v) y los débiles lavar con agua-metanol (95: 5, v/v).</li>
</ol>5. instrumento Tuning
Nota: Este paso se realiza para el establecimiento del método en un espectrómetro de masas específico.
<ol><li>Diluir el analito aseado 1.000 mg/L y soluciones estándar interno 1:10 o 1: 100 en una mezcla de la fase móvil A y B (50: 50, v/v), dependiendo de la intensidad de señal de detector. Sintonizar el espectrómetro de masas con la función autotune o hacer un ajuste manual para los siguientes iones de padre a hija transiciones14: cefepime (481.0 &gt; 167.0/395.7), cefepime -13C12D3 (485.1 &gt; 167,1 / 400.0), meropenem (384.1 &gt; 114.0/141.0), meropenem-D6 (390.1 &gt; 114.0/147.2), ciprofloxacina (332.0 &gt; 231.0/245.0), ciprofloxacina-D8 (340.1 &gt; 235.1/249.3), moxifloxacina (402.0 &gt; 261.0/383.9), moxifloxacina-13 C1D3 (406.1 &gt; 265.1/388.0), linezolid (338.0 &gt; 235.0/296.0), linezolid-D3 (341.1 &gt; 235.1/297.1), piperacilina (518.0 &gt; 143.0/358.9) y piperacilina-D5 (523.1 &gt; 142.8/364.1).</li>
	<li>Para instrumentos con autotuning, utilice la función autotune para ajustar automáticamente el voltaje y la configuración de la entrada de MS a través de los detectores.</li>
	<li>Para instrumentos con sintonización manual, ajustar los parámetros (por ejemplo, voltaje de choque y energía de la colisión) hasta el óptimo (generalmente el máximo) intensidad de la señal se obtiene en el detector para cada ion de padre e hija. Por ejemplo, una mezcla t del enchufe, entregar la fase móvil A y B (50: 50, v/v) a 0,5 mL/min e infundir continuamente el estándar de antibiótico o interno aseado con un caudal de 0,1 mL/min.</li>
</ol>6. configuración HPLC-MS/MS
Nota: Cuenta del espectrómetro de masas, HPLC sistema (incluyendo el inyector automático) y el software correspondiente dependen del fabricante. Adaptar los parámetros del espectrómetro de masas y el procedimiento de lavado según las recomendaciones del fabricante.
<ol><li>Almacenar los parámetros de espectrómetro de masas en un correspondiente 'MS tune archivo '. Uso de ionización por electrospray en modo positivo (ESI +) para todos los analitos. Adaptar la configuración de fuente de iones para el instrumento utilizado (por ejemplo, una tensión capilar de 1.5 kV, una temperatura de fuente de 120 ° C, una temperatura de 400 ° C de desolvation, un desolvation gas caudal 600 L/h, un voltaje de RF lente de 0.1 V y un tiempo de permanencia de 80 ms).</li>
	<li>Especificar el analito y estándares internos ajustar parámetros (por ejemplo, la tensión capilar, energía de la colisión) en un 'MS archivo de '.</li>
	<li>Establecer las condiciones de muestreadores como sigue en la 'archivo de entrada ': la temperatura de la muestra a 10 ° C con un límite de ± 5 ° C; la secuencia de lavado en x 1 purga-lavado-purga con 600 μl de purga reemplazo de volumen.</li>
	<li>En la mencionada 'archivo de entrada ', establecer el caudal de 0,4 o 0,5 mL/min, el tiempo de ejecución a 4 minutos, el límite superior de presión de 345 bar y la temperatura de la columna a 30 ° C con un límite de ± 5 ° C. Agregue el nombre solvente de fases móviles A y B y les B/93% al 7%, respectivamente.</li>
	<li>Programa el gradiente cromatográfico en el 'archivo de entrada ' como sigue: 0.00 – 0.10 min con fase móvil de 7% B/93% A, 0,11 – 0,60 min con fase móvil 65% B/35% A, 0,61 – 2.10 min con la fase móvil 95% B/5% A, 2.11 – 4.00 min con fase móvil de 7% B/93% A. Nota: Calcular el volumen de la columna extra, el volumen de retención para la plataforma instrumental y los factores de retención del analito según lo descrito en la USP &lt; 621 &gt; cromatografía pauta16.</li>
</ol>7. muestra medición Master File
Nota: Con el 'ejemplo de archivo de medición principal ', se especifican las muestras de pacientes, el análisis de HPLC-MS/MS se inicia y se realiza la evaluación de datos. Se generan dos archivos de plantilla separados, incluyendo un par de control de baja y alta calidad; una plantilla incluye control de calidad par A y C, el otro un par de control de calidad B y D.
<ol><li>Crear una nueva 'ejemplo medición principal de archivo '. Seleccione la mencionada 'MS tune archivo ', 'MS archivo de 'y 'archivo de entrada' (sección 6), en cada línea de muestra y se especifica el volumen de inyección con 15 μl.</li>
	<li>En orden ascendente, añadir el "texto de ejemplo" para calibradores 0 – 7 y control de calidad (QC) par aire acondicionado o control de calidad par B/D.</li>
	<li>Especificar el tipo de muestra. Seleccione el tipo de muestra "estándar" para los calibradores y "Control de calidad" para los pares de control de calidad.</li>
	<li>Especificar la concentración de cada sustancia antibiótica para los correspondientes calibradores y controles de calidad (ver la hoja de cálculo, concentración [μg/mL] Cal 7 – Cal 0, control de calidad del aire/acondicionado o B/D,).</li>
	<li>Programa de la 'método de evaluación de datos '. Utilizar las transiciones que fueron optimizadas en el instrumento de ajuste (artículo 5). Coincidir con cada antibiótico con el correspondiente marcado con el isótopo estándar (e.g., meropenem - meropenem-D6).</li>
</ol>8. limpieza y análisis de HPLC-MS/MS de la muestra
Nota: Por cada lote de muestras, un control de calidad vinculado con una concentración de antibiótica alta y baja (aire acondicionado de control de calidad o control de calidad B/D) es procesado y analizado. Entre diversas hornadas, las muestras pareadas de control de calidad se utilizan en una secuencia alternativa (p. ej., el día 1, seleccione el 'muestra medición maestra de archivos ' incluyendo control de calidad par aire acond., en el día 2, seleccionar el par de control de calidad incluyendo una B/D. El procesamiento de las muestras de suero se ilustra en la figura 1.
<ol><li>Preparar el agente de precipitación 10% metil -tert-éter butílico en metanol (10:90, v/v) (p. ej., matraz aforado de prellenado a 25 mL con 2,5 mL de metil -tert-éter butílico y completar a 25 mL con metanol absoluto).</li>
	<li>Coloque la fase reversa C8 en la cámara de la columna. Conecte el HPLC y el espectrómetro de masas en la dirección del flujo.</li>
	<li>Generar la lista de muestra. Abrir el correspondiente 'muestra medición maestra de archivos ' plantilla y agregar las muestras de pacientes para procesar a la lista. Generar grupos de hasta 20 muestras de pacientes y flanco con el par de control de calidad correspondiente.</li>
	<li>Mojado-prime el sistema HPLC utilizando el 'archivo de entrada ' software de control: la función de "primer mojado" a 50% fase móvil B A/50% y mojado-prime por 2 min con un flujo de 1 mL/min.</li>
	<li>Actualizar la jeringa. Para ello, ejecutar 6 trazos de 600 μL en el software de control.</li>
	<li>Equilibrar la columna de fase reversa C8. El software, activar el flujo de la 'archivo de entrada ' y lavarlo con 7% móvil fase B/93% A un mínimo de 5 minutos, utilizando una tasa de flujo de 0,5 mL/min Verifique la temperatura de la columna de 30 ° C.</li>
	<li>Descongelar las muestras de pacientes, una alícuota de calibradores 0 – 7 y un par de control de calidad (A / B o C/D).</li>
	<li>Con una pipeta repetitiva, añada 25 μl de la mezcla estándar interna al calibrador μl 100, muestra del control de calidad o suero del paciente en un tubo de polipropileno de 1.5 mL y agitar el tubo durante unos segundos.</li>
	<li>Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de sobremesa (por ejemplo, a 1.200 rpm).</li>
	<li>Con una pipeta repetitiva, añadir 150 μL de un reactivo de precipitación a la mezcla estándar interno a la muestra.</li>
	<li>Otra vez, mezclar el tubo para unos pocos segundos e incubar 5 min a temperatura ambiente en un agitador de sobremesa (por ejemplo, a 1.200 rpm).</li>
	<li>Centrifugar la suspensión a 20.000 x g en una centrífuga de mesa durante 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Diluir el sobrenadante 1:3 con agua de calidad HPLC utilizando un frasco de vidrio con una inserción de micro y cargar muestras procesadas como para el inyector automático.</li>
	<li>Iniciar el análisis de HPLC-MS/MS el 'ejemplo medición control de archivo '. Nota: Para un almacenamiento prolongado, deje correr la columna analítica según las recomendaciones del fabricante [p. ej., 0,5 mL/min metanol-agua (50: 50, v/v)] para evitar el colapso de la fase.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58148/58148fig1.jpg"> Figura 1: representación esquemática de la limpieza de la muestra. Precipitación de proteínas en la alta fuerza centrífuga da un pellet denso y claro sobrenadante, indicando eso precipitación de la proteína fue completa. Todo el tiempo de procesamiento es aproximadamente 30 minutos, incluyendo el análisis MS/MS, la limpieza de la muestra y la separación cromatográfica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58148/58148fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
9. cuantificación y evaluación de la calidad
<ol><li>Para procesar las muestras, abrir el correspondiente 'archivo de control de medición muestra ', seleccione los calibradores, controles de calidad y muestras de pacientes y evaluarlos con el 'método de cuantificación de antibióticos '.
</li>
	<li>Verificar si los picos para un analito se integran correctamente. Inspeccione los picos para cada calibrador, control de calidad y muestra del paciente y reintegrarlos manualmente en la línea de base si es necesario.</li>
	<li>Estudio de la curva de calibración y determinar si satisface los siguientes criterios de calidad: a) linealidad sobre el rango entero de calibración, b) un coeficiente de calibración r2 &gt; 0.995, c) la desviación de cada calibración estándar dentro de ± 15% de la valor nominal, excepto por el límite inferior de cuantificación (LLOQ), donde se requiere ± 20%.</li>
	<li>Rechazar un estándar de calibración que no cumplan con los criterios antes mencionados y evaluar la curva de calibración, incluyendo el análisis de regresión.</li>
	<li>Los controles de calidad de estudio y examinar si las desviaciones son dentro de ± 15% del valor nominal.</li>
	<li>Si la concentración de una muestra del paciente excede la concentración del calibrador más alto, diluir la muestra con agua destilada, hasta 1:5 (p. ej., 100 μl de suero plus 400 μL de agua destilada) antes de la limpieza de la muestra. Reperform pasos 8.8 – 8.14 para muestra específica y reprocesarlo.</li>
</ol>

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<li>United States Pharmacopeia and National Formulary. Chapter <621>. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CHROMATOGRAPHY+%28USP+37-NF+32+S1%29%22">CHROMATOGRAPHY (USP 37-NF 32 S1)</a>. , United Book Press, Inc. Baltimore, MD. 6376-6385 (2014).</li>
<li>Wong, G., Sime, F. B., Lipman, J., Roberts, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+we+use+therapeutic+drug+monitoring+to+improve+outcomes+from+severe+infections+in+critically+ill+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">How do we use therapeutic drug monitoring to improve outcomes from severe infections in critically ill patients?</a> BMC Infectious Diseases. 14, 288(2014).</li>
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<li>Meropenem: Highlights of prescribing information. , Available from:
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<li>Ciprofloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf</a> (2016).</li>
<li>Moxifloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf</a> (2010).</li>
<li>Linezolid: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf</a> (2011).</li>
<li>Piperacillin and Tazobactam: Highlighs of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf</a> (2017).</li>
<li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+biobanking+conditions+on+six+antibiotic+substances+in+human+serum+assessed+by+a+novel+evaluation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Effects of biobanking conditions on six antibiotic substances in human serum assessed by a novel evaluation protocol.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 54 (2), 265-274 (2016).</li>
<li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+piperacillin%2C+tazobactam%2C+cefepime%2C+meropenem%2C+ciprofloxacin+and+linezolid+in+serum+using+an+isotope+dilution+UHPLC-MS%2FMS+method+with+semi-automated+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Quantification of piperacillin, tazobactam, cefepime, meropenem, ciprofloxacin and linezolid in serum using an isotope dilution UHPLC-MS/MS method with semi-automated sample preparation.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 53 (5), 781-791 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este manuscrito, se presenta el protocolo para un método de masa basado en la espectrometría de tándem sencillo y robusto para la cuantificación de los antibióticos utilizados en el ICU19, es decir, cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid, y piperacilina14. Una hoja de cálculo acompaña el manuscrito para la preparación de soluciones stock de antibióticos, calibradores y controles de calidad, teniendo en cuenta la pureza de los antibióticos y el peso...

Aunque los antibióticos han revolucionado la práctica de la medicina, graves infecciones bacterianas siguen siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en enfermedades graves1. En este sentido, la administración pronta de un antiinfeccioso adecuado en una dosis adecuada es de importancia superior para el control de la enfermedad2.
Un creciente cuerpo de evidencia demuestra que el tratamiento empírico con antibióticos de amplio espectro se está convirtiendo en cada vez más problemático con la complejidad de las poblaciones de pacientes. Esto es especialmente cierto para unidades de cuidados intensivos (UCI), donde una enorme variabilidad interindividual de los parámetros farmacocinéticos claves del (PK) con frecuencia se observa3,4. En consecuencia, pacientes de la UCI están en riesgo inminente de niveles sub-terapéuticos con el peligro de un escaso éxito terapéutico5,6. Por otra parte, pacientes exponen innecesariamente a excesivamente altas concentraciones de antibióticos que pueden resultar en eventos adversos graves con ningún beneficios clínicos7. El mal uso de antibióticos y la dosificación insuficiente también han impulsado la difusión de la resistencia a los antibióticos, que se está convirtiendo en una amenaza creciente para la salud pública8.
Para mejorar el uso de antibióticos y para preservar su effectivenessas tiempo como sea posible, la Organización Mundial de la salud ha puesto en marcha un plan de acción global sobre resistencia a los antimicrobianos en 20159. Los programas de administración de antibióticos constituyen una piedra angular esencial de uso prudente de antimicrobiano en la salud pública nacional estrategias10, ayudando a los médicos a mejorar significativamente la calidad de atención del paciente11 y, al mismo tiempo, la reducción de la resistencia a los antibióticos12. Antimicrobiano dosis en pacientes individuales a través de la aplicación de drogas terapéuticas (TDM) el monitoreo es un instrumento clave en este contexto13.
Hasta la fecha, disponible en el mercado TDM ensayos sólo están disponibles para los antibióticos glucopéptidos y aminoglucósidos. La cuantificación de sustancias de otras clases comúnmente requiere un desarrollo interno o validación que puede resultar engorroso. Por lo tanto, presentamos en detalle el protocolo para un ensayo basada en espectrometría de masa sólido que puede ser utilizado para la cuantificación de los principales antibióticos en UCI dentro de sus rangos de concentración relevante clínica14. El método fue establecido recientemente en nuestro centro de espectrometría de masas y se ha aplicado para la rutina de TDM en UCI desde entonces. El procedimiento utiliza un marco analítico sencillo y simple con una limpieza uniforme de la muestra, lo que permite la rápida aplicación de antibiótico TDM en muchas instalaciones con capacidades de espectrometría de masas.
El protocolo descrito aquí fue optimizado para la cuantificación de cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid y piperacilina en suero humano, usando la cromatografía de líquidos de dilución isotópica (LC) en combinación con un tándem masa Espectrometría (MS/MS). Para la dilución del isótopo metodología LC-MS/MS, compuestos marcados con isótopos estables se añaden a una muestra de interés con una matriz específica (p. ej., suero). Normas de marcado con el isótopo pueden distinguirse de sus contrapartes sin etiqueta, es decir el analito de interés, debido a distintos pesos moleculares de la molécula natural y sus productos de fragmentación, como una transición de padres-ion a hija-ion. Compuestos marcados con isótopos tienen un comportamiento general fisicoquímico idéntico en comparación con su contraparte sin etiqueta, son normas internas ideal para MS/MS, lo que permite una cuantificación del analito casi independiente de la matriz con un alto grado de precisión15. Hoy en día, muchos estables isótopo-etiquetada estándares internos que pueden utilizarse para la cuantificación de moléculas pequeñas, como el TDM de antimicrobianos, están disponibles en el mercado.
La separación cromatográfica de los analitos antibióticos en el protocolo descrito se realiza con una columna de fase inversa de longitud de la cadena alquil C8 analítica (100 mm x 2,1 mm, 3 μm tamaño de las partículas). Durante el desarrollo del método, los factores internos estándar matriz normalizada para todos los analitos fue entre 94,6% y 105,4%, con un coeficiente de variación de ≤8.3%14.

<table><tbody><tr><td>clorhidrato de cefepima</td><td>Sigma-Aldrich 1097636</td><td></td><td>Estándar de referencia USP</td></tr><tr><td>trihidrato de meropenem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001252</td><td>EP Estándar de referencia</td></tr><tr><td>ciprofloxacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de moxifloxacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> SML1581 <td></td></tr><tr><td>linezolid</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td></td><td></td>L466500</tr><tr><td>piperacilina sódica sal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93129</td><td></td></tr><tr><td>cefepima-13C12D3 sulfato</td><td>Alsachim</td><td>C1297</td><td>Patrón interno marcado con isótopos para cefepima</td></tr><tr><td>meropenem-D6</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M225617</td><td>Patrón interno marcado con isótopos para meropenem</td></tr><tr><td>ciprofloxacina-D8</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>C482501</td><td>Patrón interno marcado con isótopos para ciprofloxacina</td></tr><tr><td>clorhidrato de moxifloxacina-13C1D3</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M745003</td><td>Patrón interno marcado con isótopos para moxifloxacina</td></tr><tr><td>linezolid-D3</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>L466502</td><td>Patrón interno marcado con isótopos para linezolid</td></tr><tr><td>piperacillin-D5</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>P479952</td><td>Isótopo marcado internamente estándar para piperacillina</td></tr><tr><td>metanol</td><td>JT Baker</td><td>8402</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado HPLC</td><td>JT Baker</td><td>4218</td><td></td></tr><tr><td>ácido fórmico</td><td>Biosolve</td><td>6914132</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>Biosolve</td><td>1070501</td><td></td></tr><tr><td>formiato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>terc-Butil éter metílico</td><td>Merck</td><td>101845</td><td></td></tr><tr><td>Fortis 3 &mu; m C8 100 * 2,1 mm</td><td>Fortis</td><td>F08-020503</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Prifilter revestido de Ti-PEEK (2 &mu; m)</td><td>Chromsystems</td><td>15011</td><td></td></tr><tr><td>2795 Alliance Sistema de HPLC</td><td></td><td>176000491</td><td></td></tr><tr><td>Quattro micro API de Waters Sistema de cuadrupolo en tándem</td><td>720000338</td><td></td><td>de Waters</td></tr><tr><td>QuanLynx 4.1</td> Software <td>de evaluación de aguas</td><td>/</td><td>datos proporcionado por el fabricante del espectrómetro de masas</td></tr><tr><td>Archivo</td><td></td><td></td> complementario <td>Soluciones de stock</td></tr></tbody></table>

múltiplex análisis farmacológico por la dilusión del isótopo hplc-ms/ms de los antibióticos en enfermedades graves

Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses

Hay una demanda creciente para el monitoreo de drogas terapéuticas de antibióticos en muchas instalaciones clínicas, particularmente con respecto a la implementación de programas de administración de antibióticos del hospital.
En el presente trabajo, presentamos un protocolo multiplex alto rendimiento líquido cromatografía-espectrometría total en tándem (HPLC-MS/MS) para la cuantificación de cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid y piperacilina, utilizados antibióticos en unidades de cuidados intensivos. El método comprensivo anteriormente se validó según la pauta de la Agencia Europea de medicamentos.
Después de una limpieza rápida de la muestra, los analitos son separados en una columna HPLC de fase reversa C8 dentro de 4 minutos y cuantificados con el correspondientes estables isótopo-etiquetada estándares internos en espectrometría de masas por electrospray ionización (ESI +) en reacción de múltiples tiempo control (MRM). El método presentado utiliza una instrumentación simple ajuste con condiciones cromatográficas uniforme, lo que permite el seguimiento diario y robusto antibiótico terapéutico en los laboratorios clínicos. La curva de calibración extiende el rango de concentración farmacocinética, así como antibióticos cantidades cerca de la concentración inhibitoria mínima (CIM) de las bacterias susceptibles y las concentraciones máximas (Cmax) que se obtienen con bolo regímenes de administración. Sin la necesidad de la dilución de suero antes de la limpieza de la muestra, puede obtenerse el área bajo la curva para un antibiótico administrado a través de mediciones múltiples.

Utilizando el protocolo descrito, un cromatograma típico se muestra en la figura 2. Según el United States Pharmacopeia (USP) cromatografía directrices16, se determinó el volumen muerto de la columna en el sistema actual con ~0.22 mL y el volumen de la columna extra (incluyendo los conectores, inyector y tubería) con ~0.08 mL, dando un volumen de retención de ~0.30 mL. Los factores de retención calculado para todos los analitos fueron ...

Aquí presentamos un protocolo de masa basado en la espectrometría de tándem para la cuantificación de los antibióticos utilizados en unidades de cuidados intensivos, es decir, cefepime, meropenem, ciprofloxacina, moxifloxacina, linezolid y piperacilina.

Múltiplex análisis farmacológico por la dilusión del isótopo HPLC-MS/MS de los antibióticos en enfermedades graves

There is an ever-increasing demand for the therapeutic drug monitoring of antibiotics in many clinical facilities, particularly with regard to the ...

El monitoreo terapéutico de los antibióticos se reconoce cada vez más como un elemento importante para la implementación de programas nacionales y locales de administración de antibióticos. Para satisfacer esta creciente demanda de monitorización de fármacos terapéuticos antibióticos en instalaciones médicas, presentamos un protocolo para la cuantificación de antibióticos en circulación que tiene como objetivo ajustar la dosis a la susceptibilidad de los patógenos implicados. El protocolo basado en espectrometría de masas presentado se optimizó para la cuantificación de los antibióticos más utilizados en las unidades de cuidados intensivos, a saber, cefepima, meropenem, ciprofloxacino, moxifloxacina, linezolid y piperacilina.Debido al amplio rango de calibración, el método también se puede utilizar para calcular el área farmacocinética bajo la curva de un antibiótico administrado. Con un tiempo de respuesta total de aproximadamente 30 minutos, el protocolo presentado es adecuado para el seguimiento diario de fármacos terapéuticos antibióticos en laboratorios clínicos. Primero espiga nueve volúmenes de suero libre de drogas con un volumen de soluciones de espiga concentradas 10 vece

multiplex-therapeutic-drug-monitoring-isotope-dilution-hplc-msms

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Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

Aquí describimos un ensayo de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) para cuantificar el inmunosupresor tacrolimus en manchas de sangre seca utilizando un paso simple de precipitación manual de proteínas y extracción en columna en línea.

Cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante LC-MS/MS

Aquí, describimos un análisis cromatográfico juntado con la separación de movilidad de iones precursores de péptidos seguida por la alta resolución (~ 30.000) MS-detección de fragmentos de péptidos para la cuantificación de normas péptido con púas en un anticuerpo monoclonal Digest.

Un ensayo de HS-MRM para la cuantificación de las proteínas de la célula huésped en productos biofarmacéuticos de proteínas por cromatografía líquida QTOF masa espectrometría por movilidad iónica

Combinado precursor de marcaje isotópico y etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia proteómica cuantitativa que mejora las capacidades de multiplexación de muestra de las etiquetas isobáricas. Este protocolo describe la aplicación de cPILOT a los tejidos de los controles de modelo de ratón de la enfermedad y de tipo salvaje de un Alzheimer.

Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

Este protocolo describe un proceso analítico eficaz y práctico de la extracción de muestra y determinación simultánea de múltiples fármacos, doxorrubicina (DOX), mitomycin C (MMC) y un metabolito DOX cardio tóxico, doxorubicinol (DOXol), en lo biológico muestras de un modelo de tumor de mama preclínicos tratadas con nanopartículas formulaciones de combinación de fármacos sinérgicos.

Extracción de muestras y cuantificación cromatográfica simultánea de doxorrubicina y mitomicina C siguiendo la combinación del fármaco en nanopartículas en ratones con tumores

Presentamos un protocolo para cuantificar con precisión las proteínas con etiquetado isobárico, fraccionamiento extensa, herramientas bioinformáticas y pasos de control de calidad en combinación con interfaz a un espectrómetro de masas de alta resolución de la cromatografía líquida.

Proteoma profundo perfiles de etiquetado isobárico, extenso de la cromatografía líquida, espectrometría de masas y asistida por el Software de cuantificación

Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.

Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

Aquí describimos un método de alto rendimiento para farmacovigilancia integral que permite mejorar la resolución y detección de paneles grandes de drogas de abuso y sus metabolitos, con control de calidad basado en siguientes inyección capilar electroforesis-espectrometría de masas.

Alto rendimiento y amplio farmacovigilancia mediante espectrometría de masas siguientes electroforesis capilar de inyección

El etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT) es una estrategia mejorada de multiplexación de muestras que es capaz de aumentar el número de muestras que se pueden analizar simultáneamente con las etiquetas isobáricas disponibles. La incorporación de una plataforma robótica ha aumentado considerablemente el rendimiento experimental, la reproducibilidad y la precisión cuantitativa.

Multiplexación automática de muestras mediante el etiquetado isotópico de precursor combinado y el etiquetado isobárico (cPILOT)

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se utiliza para identificar la desregulación de los metabolitos en pacientes con diversas enfermedades. Esta técnica permite la cuantificación de los metabolitos alterados, desentrañando los conocimientos fisiopatológicos. Aquí, describimos el procedimiento paso a paso del enfoque basado en RMN para la caracterización metabólica de los pacientes.

Identificación y cuantificación de metabolitos alterados en pacientes críticos mediante metabolómica basada en RMN

Aprenda a cuantificar antibióticos en suero mediante HPLC-MS/MS con dilución de isótopos para monitoreo terapéutico en unidades de cuidados intensivos. Este protocolo permite ajustar dosis según la susceptibilidad de patógenos en 30 minutos.

Múltiplex análisis farmacológico por la dilusión del isótopo HPLC-MS/MS de los antibióticos en enfermedades graves

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