Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del glioblastoma, el tumor cerebral, las células madre o BTSC, al facilitar la identificación de nuevos enfoques para inhibir la migración y la invasión. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten cuantificar la migración e invasión de BTSC a lo largo del tiempo bajo múltiples condiciones. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del glioblastoma, ya que la migración e invasión de las células cancerosas al tejido cerebral normal contribuye a la recurrencia de la enfermedad.

Aunque este método puede proporcionar información sobre cómo migran e invaden las BTSC, también se puede aplicar a las células madre cancerosas derivadas de otros tipos de tumores. Comience por descongelar un frasco de BTSC criogénicamente conservados en un vaso de precipitados con 70% de etanol colocado dentro de un baño de agua a 37 grados centígrados justo hasta que se haya descongelado lo último del hielo. Diluir las células descongeladas y 10 mililitros de medio en un tubo cónico de 15 mililitros para su centrifugación y resuspender el pellet de BTSC en ocho mililitros de medio completo.

Transfiera las células a un matraz de cultivo T25 durante 10 a 14 días de cultivo en condiciones no adherentes, monitoreando el matraz diariamente y complemente las células con uno o dos mililitros de medios completos frescos según sea necesario. Cuando las neuroesferas alcancen un diámetro aproximado de 250 micrómetros, utilice una pipeta para enjuagar los medios a través del fondo del matraz para separar las células adherentes y transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 15 mililitros para la centrifugación. Para disociar las neuroesferas BTSC en células individuales, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de solución de desprendimiento celular precalentada e incube durante siete minutos a 37 grados centígrados, seguido de 40 trituraciones con una micropipeta P1000 ajustada a 800 microlitros.

Cuando las células estén completamente disociadas, agregue cinco mililitros de PBS suplementado con antibióticos al tubo para otra centrifugación y vuelva a suspender el pellet en uno a cuatro mililitros de medio completo, dependiendo del tamaño del pellet. A continuación, siembre dos o tres veces 10 a la quinta celda en ocho mililitros de medio completo por matraz T25 y transfiera los matraces a la incubadora de cultivo celular durante una o dos semanas de cultivo. Para evaluar los efectos de un tratamiento farmacológico de interés sobre la migración, primero se debe pretratar las células con la concentración adecuada del fármaco durante un período experimental adecuado.

Para preparar la placa de quimiotaxis, cubra tres pocillos de inserción de membrana y tres pocillos de depósito inferior por condición de una placa de quimiotaxis de 96 pocillos con 75 y 225 microlitros de 0,2 miligramos por mililitro de colágeno tipo I respectivamente durante una hora a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, aspire la solución de colágeno de cada pocillo sin rayar el recubrimiento de colágeno y lave los pocillos dos veces con PBS estéril. Después del último lavado, retire el inserto de la placa y agregue 225 microlitros de medio libre de factor de crecimiento suplementado con 10% FBS a cada pocillo del depósito inferior de la placa de quimiotaxis.

A continuación, vuelva a colocar suavemente el inserto superior en el depósito inferior en ángulo para evitar la formación de burbujas y añada 2,5 veces 10 al tercer BTSC disociado en 50 microlitros de medios sin factor de crecimiento a cada pocillo del inserto. Es importante disociar completamente las BTSC en células individuales y contarlas cuidadosamente antes de la siembra para evitar tener grupos de células o demasiadas células en el inserto superior. Para obtener imágenes de la migración de BTSC a lo largo del gradiente FBS, coloque la placa en un sistema de imágenes de células vivas y configure el software de imágenes automatizado para que adquiera imágenes microscópicas de la placa cada una o dos horas durante un máximo de 72 horas.

Una vez completada la adquisición de la imagen, seleccione una nueva definición de procesamiento para distinguir las BTSC de sus poros de inserción en la parte inferior de la membrana, modificando el análisis si no distingue con precisión las células de la membrana de fondo según sea necesario. Para cuantificar las células que han migrado a través de los poros, recoja los datos como el área de la superficie celular en la parte inferior de la membrana para cada uno de los tres pocillos replicados por condición, luego grafíe la migración celular como el área de las células migradas en micrómetros cuadrados a lo largo del tiempo. Para evaluar la invasión de la neurosfera BTSC, primero agregue el compuesto de interés al matraz a la concentración deseada durante el curso de tiempo predeterminado antes de la invasión

Cuando el tamaño medio de la neurosfera alcance aproximadamente de 150 a 200 micrómetros, incline y mezcle suavemente el matraz con una pipeta y transfiera 500 microlitros de las neuroesferas BTSC resuspendidas a un tubo de 1,5 mililitros por condición experimental en hielo. Aspire la mayor cantidad posible de medios desde el fondo de cada tubo de 1,5 mililitros sin perder la pelletita de neurosfera y resuspenda suavemente las neuroesferas en 500 microlitros de solución de colágeno tipo I de 0,4 miligramos por mililitro recién preparada. Transfiera 100 microlitros de las neuroesferas suspendidas en colágeno a tres pocillos por condición a una nueva placa de 96 pocillos en hielo y deje que las neuroesferas se asienten durante cinco minutos.

Es fundamental permitir que las neuroesferas se asienten durante cinco minutos en el hielo. De lo contrario, las esferas no estarán en el mismo plano de enfoque para la obtención de imágenes. Después de cinco minutos de polimerización del colágeno en la incubadora de cultivos celulares, transfiera la placa a la bandeja del sistema de imágenes de células vivas para adquirir una imagen de referencia del tamaño de la neurosfera en el momento de la siembra antes de que comience la invasión.

A continuación, configure el software para que adquiera imágenes cada una o dos horas hasta que la tasa de invasión se haya estabilizado, normalmente en 24 horas. Para obtener imágenes del área de superficie creciente de las BTSC a medida que invaden la matriz con el tiempo, use el objetivo 10X para adquirir cuatro imágenes por pocillo para cada conjunto de tres pocillos replicados. Para determinar el área relativa de la superficie de la celda representada como el porcentaje de confluencia del pozo, configure una definición de procesamiento que resalte específicamente las celdas sobre el fondo del pocillo, luego recopile los datos como el área total de la superficie de la celda para cada pocillo en cada punto de tiempo, determine la media de los tres pozos replicados, y graficar la invasión de las BTSC trazando el aumento del área celular a lo largo del tiempo.

Las BTSC plasmadas en células individuales pueden cultivarse como neuroesferas que flotan libremente. A continuación, las neuroesferas pueden tratarse con un fármaco de interés y platearse para el análisis de quimiotaxis de los efectos de las intervenciones terapéuticas en la migración de BTSC. Si las BTSC no están completamente disociadas, las células no migran a través de los poros y permanecen como pequeñas neuroesferas.

Si se siembran más de 2,5 veces 10 a la tercera BTSC por pocillo, las células se agrupan en lugar de migrar a los lados inferiores de las membranas. Además, es esencial evitar hacer burbujas en los pocillos de inserción de membrana mientras se colocan las celdas o al colocar el inserto de membrana en el depósito inferior, ya que las burbujas impiden la obtención y cuantificación precisas de imágenes celulares. La invasión de BTSC desde las neuroesferas hacia la matriz circundante se puede visualizar y medir a lo largo del tiempo en un formato de placa de 96 pocillos.

El efecto de las intervenciones terapéuticas sobre la invasión de BTSC se puede evaluar cuantificando el área de superficie de las células a medida que invaden la matriz a lo largo del tiempo. La incrustación de neuroesferas BTSC con un diámetro superior a 200 micrómetros conduce a un plano de enfoque que es demasiado grande para cuantificar con precisión todas las esferas en el campo de visión. Del mismo modo, si no se mantiene la matriz a cuatro grados centígrados mientras se incrustan las neuroesferas en el colágeno para el ensayo de invasión, también se pueden producir esferas que no están en el mismo plano de enfoque con una matriz extracelular que no se solidifica de manera uniforme, lo que impide una adquisición de datos precisa.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar las condiciones de tratamiento del fármaco y los tiempos de adquisición de imágenes para cada cultivo de BTSC que se esté investigando. Este procedimiento también se puede modificar para responder preguntas adicionales sobre cómo las células madre cancerosas de otros tipos de tumores migran e invaden in vitro. Esta técnica puede ayudar a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la biología del cáncer exploren la migración e invasión in vitro en las BTSC de glioblastoma.