Métodos para evaluar el papel de c-Fos y Dusp1 en dependencia del oncogén
January 7th, 2019
Aquí, describimos protocolos de validación genética y química de c-Fos y Dusp1 como una diana farmacológica en leucemia usando modelos de ratón humanizado y genética in vitro e in vivo. Este método puede ser aplicado a cualquier objetivo de validación genética y desarrollo terapéutico.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos terapéuticos del cáncer, como la identificación de genes clave implicados en la dependencia del oncogén. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza la dependencia del oncogén que es común a muchos cánceres impulsados por la quinasa por lo tanto es aplicable a múltiples tipos de tumores. Aunque este método puede proporcionar información sobre la leucemia, también se puede aplicar a otros sistemas, como tumores sólidos como cáncer de pulmón, tumores cerebrales y tumores pancreáticos.
Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán debido a la falta de experiencia en biología molecular y fisiología celular. Para empezar, cosecha los huesos de las piernas de un ratón eutanasiado. Limpie los tejidos de los huesos con un bisturí.
A continuación, coloque los huesos en PBS frío sobre hielo y aplaste los huesos con un pestillo. Después de esto, filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de tapa de tornillo de 50 mililitros con una pipeta de 10 mililitros. Lave el mortero y el pestillo varias veces con PBS frío y agregue la suspensión celular al tubo de 50 mililitros.
Siguiente centrifugar la médula ósea y retirar el sobrenadante con pipeta de vacío y vidrio. Resuspender el pellet celular en 5 mililitros de PBS. Con una pipeta, agregue lentamente la médula ósea suspendida a la parte superior de la poli-sacarosa a temperatura ambiente.
Después de esto, gire la poli-sacarosa a 400 Gs durante 20 minutos con el freno apagado. Después de la centrifugación, recoja la interfaz de celda mononuclear total turbia con una pipeta y transfiérala a un nuevo tubo de 15 mililitros. Lleve el volumen a 10 mililitros con PBS y retire 20 microlitros para contar.
Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y coloque el pellet sobre hielo. A continuación, resuspender el pellet celular en PBS con EDTA y BSA. Agregue microperlas CD117 a la suspensión celular y vórtice para mezclar.
Después de esto, incubar la suspensión durante 10 minutos a 4 grados centígrados. A continuación, subir el volumen a 10 mililitros con más PBS con EDTA y BSA y centrífuga a 1200 G a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Utilice un vacío para quitar el sobrenadante y suspender el pellet celular en PBS con EDTA y BSA.
A continuación, agregue 3 mililitros de PBS con EDTA y BSA a un soporte de imán con una columna magnética y permita que fluya en un tubo de recogida. Después de que el búfer termine de fluir a través de la columna, agregue la suspensión de celda y permita que fluya a través de la columna en el tubo de recolección. A continuación, agregue 5 mililitros más de PBS con EDTA y BSA a la columna y eléjelo inmediatamente con el émbolo.
Retire el émbolo y repita el lavado antes de contar las celdas. Después de centrifugar las células, retire el sobrenadante y suspenda el pellet celular en IMDM completo para el cultivo. Cultivo de las células durante la noche a 37 grados Celsius con 5% dióxido de carbono.
En primer lugar, combinar el ADN del plásmido retroviral con el plásmido de envases, cloruro de calcio y agua en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, añada 500 microlitros de HBS a otro tubo de 1,5 mililitros. Agregue la mezcla de transfección en gota al tubo que contiene HBS mientras se mezcla simultáneamente con el vórtice establecido en el ajuste más bajo.
Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Durante el período de incubación, agregue cloroquina a las células HEK y guárdalas en la incubadora. Después de agregar la mezcla de transfección, incubar las células durante 8 horas en una incubadora de 37 grados Celsius 5%CO2 cambiando el medio celular añadiendo 14 mililitros de medios DMEM10 frescos muy lentamente.
Pipetear lentamente contra la pared del plato ayuda a evitar cualquier despojo de las células HEK. Luego incubar las células durante la noche en la incubadora de 37 grados Celsius 5%CO2. Utilice una jeringa de 10 mililitros para recoger el sobrenadante viral.
A continuación, conecte un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros a la jeringa. Sumerja el sobrenadante viral en un nuevo tubo de recolección. Recoger el sobrenadante viral aproximadamente 16 horas más tarde.
Después de esto, añadir dos mililitros de fragmento de fibronectina humana recombinante en PBS a placas de cultivo de 6 pozos sin tratar. Al día siguiente, use una pipeta para eliminar la fibronectina de las placas. Bloquear las placas con 2%BSA en PBS e incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Utilice un aspirador para eliminar la BSA y lavar las placas con PBS antes de retirarlas con un vacío. Después de esto, agregue inmediatamente el sobrenadante viral filtrado y centrifugar la placa durante dos horas. Utilice un vacío para quitar el sobrenadante y girar la placa de nuevo.
A continuación, retire el sobrenadante con un vacío y lave los pozos recubiertos víricas con PBS. Retire el PBS con un vacío, agregue el c-Kip previamente cultivado más las células del ratón a los pozos recubiertos virales. Después de la centrifugación, incubar las células a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
48 horas después de la transducción, peletizar las células a través de la centrifugación y resuspend suscribiendo en el buffer FACS 1. Primero descongelar la celulosa metilo con citoquinas para ratones a temperatura ambiente. Luego aliquot 3 mililitros de metilcelulosa en un tubo FACS.
Añadir 100 microlitros de la suspensión celular con los inhibidores apropiados a 3 mililitros de celulosa de metilo. A continuación, vórtice la suspensión en alto durante 10 a 30 segundos. Después de que la mayoría de las burbujas de aire escapen, utilice una jeringa de 1 mililitro para placa 1 mililitro del medio en tres placas de réplica.
Coloque los platos en un plato grande de Petri junto con un plato abierto que contenga agua estéril. Luego cubra el plato grande de Petri e incuba las células a 37 grados centígrados. Preparar la mancha de cloruro de iodonitrotetrazolium disolviendo 10 miligramos del cloruro de iodonitrotetrazolium en 10 mililitros de agua.
Filtre la solución de tinción con una jeringa de bloqueo Luer equipada con un filtro de 0,2 micrómetros. En la capucha de cultivo de tejido, agregue 100 microlitros de la solución de tinción gotas alrededor de la placa CFU. Luego incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular.
Finalmente, después de que las colonias se hayan convertido en un color marrón rojo oscuro, utilice un fondo blanco en la capucha de cultivo de tejido estéril para tomar fotos de la placa de CFU teñida. En este protocolo, se utilizaron múltiples análisis imparciales de expresión génica para identificar el componente genético que orquesta la adicción al oncogén. Para validar el papel de c-Fos y Dusp1 como diana terapéutica en la leucemia, su sobreexpresión se confirmó con células que expresan el oncogén BCR-ABL1.
El análisis a través de RT-qPCR e hinchazón occidental confirmó que ambos fueron inducidos por BCR-ABL1 y que su expresión se ve aumentada por el factor de crecimiento IL-3. YFP más células de expresión se clasificaron a través de FACS para más ensayos in vitro e in vivo. Los resultados demostraron que la eliminación de c-Fos y Dusp1 por sí sola inhibió los números de UFC.
Las células que carecían de c-Fos y Dusp1 se vieron significativamente comprometidas en su capacidad para formar colonias y el tratamiento con Imatinib aniquiló todas las UFC, lo que indica que la pérdida de c-Fos y Dusp1 es sintéticamente letal para la expresión BCR-ABL1. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del cáncer exploraran las redes genéticas y los genes que impulsan la dependencia del oncogén y cómo estos genes afectan su respuesta particular en los modelos de ratón y los pacientes humanos. No olvide que trabajar con retrovirus y muestras de pacientes puede ser extremadamente peligroso y se deben observar prácticas de laboratorio seguras durante la realización de este procedimiento.
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Visión general
Este artículo describe protocolos para validar c-Fos y Dusp1 como objetivos de fármacos en la leucemia utilizando métodos genéticos y químicos. El enfoque es aplicable a varios tipos de tumores, proporcionando información sobre la dependencia de oncogenes.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Oncología
- Genética
- Farmacología
Antecedentes
- La identificación de genes clave en la dependencia de oncogenes es crucial para la terapia del cáncer.
- El método puede aplicarse a múltiples cánceres impulsados por quinasas.
- Existen desafíos para los recién llegados debido a la complejidad de la biología molecular.
- Involucra la recolección y procesamiento de huesos de las patas de ratón para el análisis.
Propósito del estudio
- Validar c-Fos y Dusp1 como objetivos terapéuticos en la leucemia.
- Demostrar la aplicabilidad del método a otros tipos de cáncer.
- Mejorar la comprensión de la dependencia de oncogenes en el cáncer.
Métodos utilizados
- Protocolos de validación genética in vitro e in vivo.
- Uso de modelos de ratones humanizados para pruebas.
- Técnicas de validación química para el direccionamiento de fármacos.
- Recolección y limpieza de huesos de las patas de ratón para uso experimental.
Principales resultados
- Validación exitosa de c-Fos y Dusp1 como objetivos de fármacos.
- Información sobre el papel de la dependencia de oncogenes en la leucemia.
- Metodología aplicable a varios tipos de tumores más allá de la leucemia.
- Identificación de desafíos para los investigadores nuevos en el método.
Conclusiones
- El estudio proporciona un marco para la validación genética en la investigación del cáncer.
- Los hallazgos respaldan el potencial de terapias dirigidas en la leucemia.
- El método puede adaptarse para aplicaciones más amplias en oncología.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables target validation in oncogene dependence, a critical inflection point in early discovery where mechanistic de-risking informs portfolio decisions. By genetically and chemically validating c-Fos and Dusp1 as synthetic lethal partners to BCR-ABL1, the approach provides predictive confidence for target prioritization in kinase-driven cancers. The protocol supports translational continuity from in vitro assays to humanized mouse models, facilitating risk-adjusted advancement of therapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by validating genes whose deletion inhibits colony formation in oncogene-dependent cells.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for genetic validation using retroviral transduction and FACS-sorted YFP+ cells.
- Predictive Value: Demonstrates synthetic lethality where loss of c-Fos and Dusp1 combined with TKI treatment eradicates CFU formation, supporting go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (c-Kit+ mouse cells transduced with YFP) suitable for downstream compound screening.
- Quantitative Outputs: Enables CFU counting and colony formation assays as quantitative readouts for target dependency.
- Scalability: Uses standardized methyl cellulose plating and triplicate replicates to support screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applies to leukemia models where BCR-ABL1-driven oncogene dependence is validated via genetic and chemical inhibition.
- Preclinical Continuity: Bridges in vitro target validation to in vivo efficacy in humanized mouse models, supporting IND-enabling studies.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity by confirming target role through orthogonal methods (RT-qPCR, western blot, functional assays).
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis to lead identification, providing validated models for mechanistic screening and predictive biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by confirming that c-Fos and Dusp1 are induced by BCR-ABL1 and augmented by IL-3 signaling.
- Screening: Delivers assay-ready cells with quantifiable CFU outputs for evaluating compound effects on oncogene dependence.
- Analytics: Enables statistical comparison of colony formation across conditions using FACS-sorted populations and methyl cellulose assays.
- Translational Research: Connects target validation to preclinical models where genetic deletion synergizes with TKIs to eradicate disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating any genetic target in kinase-driven cancers beyond leukemia.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in oncogene dependence through genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1.
- Operational Value: Standardizes target validation via bone marrow harvest, retroviral transduction, and CFU assay workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by demonstrating synthetic lethality that predicts therapeutic vulnerability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets that show TKI sensitization upon inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, retroviral work, and hematopoietic stem cell isolation.
- Depends on instrumentation for centrifugation, FACS, and cytokine-supplemented methyl cellulose assays.
- Necessitates cross-team standardization for bone marrow processing and viral titer consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to solid tumor models due to differences in cell sourcing and culture.
- Limited by biosafety requirements for handling retroviruses and primary patient samples.
