Digital de la reacción en cadena de polimerasa para la variación genética en un paciente de la poliposis adenomatosa familiar esporádico con el formato de Chip en tubo

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las pruebas genéticas, como la detección de mosaicismo y las pruebas genéticas basadas en biopsias líquidas. La principal ventaja de esta técnica es la detección de alto rendimiento de la fracción alélica de baja variante. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de tumores, ya que la detección de mutaciones oncogénicas con alta sensibilidad puede contribuir a la medicina de precisión.

Comience este experimento agregando 10 L de tampón de muestra de ADN a los tubos de una tira de 8 tubos. A continuación, añada 1 microlitro de escalera de ADN al primer tubo de la tira de 8 tubos, y un microlitro de muestra de ADN genómico a cada uno de los tubos restantes. Utilice el accesorio de microplaca para mezclar el contenido de la tira de 8 tubos mediante vórtice durante un minuto.

Coloque la tira, las puntas de pipeta y un dispositivo de gel en un instrumento de electroforesis. Presione el botón de inicio para iniciar la ejecución. Después de la ejecución completa, verifique el electroferograma en la pantalla para confirmar que el marcador inferior contenido en el tampón de muestra de ADN está asignado correctamente en el electroferograma.

De lo contrario, asigne manualmente el marcador en el modo de electroferograma del software. Luego, en el modo de región del software, especifique el tamaño de la región del ADN genómico para calcular automáticamente la concentración de ADN. Agregue cebadores, sondas y ADN genómico previamente diseñados a una nueva tira de 8 tubos para lograr un volumen total de 15 L.Pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar.

Agregue la plataforma de carga a las virutas construidas en la nueva tira de 8 tubos y luego coloque la tira de tubos en el cargador automático. Asegúrese de que haya un contacto entre las virutas y la plataforma de carga. A continuación, coloque un deslizador de carga en la plataforma y use un tope para mantener el deslizador fuera del cargador.

Pipetee 15 L de la mezcla de PCR cerca de la punta del deslizador y, a continuación, pulse el botón del cargador para hacer funcionar el cargador durante un minuto. Retire la tira de tubos del cargador después de la carrera y colóquela en el potenciador de sellado. Empuje con cuidado la tapa deslizante y el borde de la tapa superior.

Ejecute el potenciador de sellado durante aproximadamente dos minutos. Si el sellado está incompleto, indicado por un charco de líquido, repita la ejecución durante un minuto más. Agregue 230 L de líquido de sellado a los tubos.

Coloque la tira de tubos en el termociclador y ejecute la PCR como se describe en el protocolo. Si hay una distribución desigual de particiones positivas, ajuste la temperatura o la duración de la PCR. Para detectar y analizar la intensidad de fluorescencia de los productos de PCR, coloque la tira de tubo en la plantilla de detección y agregue 6 ml de agua destilada.

Elimine las burbujas de aire visibles con la punta de una pipeta. Cargue la plantilla en el detector. En el software de detección, seleccione las pestañas Fluorescencia, Experimento y, a continuación, Muestra NTC y haga clic en el botón EJECUTAR para iniciar la ejecución.

Después de completar la ejecución, confirme la gráfica de posición, el histograma y la gráfica de dispersión 2D. Para recoger el producto PCR, retire el líquido de sellado del tubo. Agregue 100 L de tampón TE y haga vórtice vigorosamente durante 30 segundos.

Centrifugar brevemente los tubos en una centrífuga de mesa y proceda como se describe en el protocolo de texto para terminar de recolectar el producto de PCR. Los gráficos de posición creados por PCR digital muestran fluorescencia HEX amarilla tanto en los pacientes como en las muestras padre, lo que indica la presencia de la variante T del alelo APC, pero no en ningún control de plantilla. Solo el ADN genómico de los pacientes contiene la variante C, como lo muestra una fluorescencia verde de FAM.

Como se confirma aún más mediante diagramas de dispersión, tanto el paciente como el padre son positivos para HEX, o variante T, mientras que solo el paciente muestra la presencia de la variante C. La fracción alélica variante del paciente, o VAF, calculada por DPCR, fue del 13,2%, similar al 12,7% logrado por la secuenciación de próxima generación. Por otro lado, los VAFs de los padres y donantes sanos de los pacientes fueron inferiores al 0,1%La electroféresis de los productos DPCR recolectados y concentrados confirma que el tamaño del fragmento predicho es de 123 pares de bases en el ADN de los pacientes y los padres. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el banco limpio, por ejemplo, utilizando una unidad de filtro de ventilador.