Contracciones de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC sincicios medición con un colorante fluorescente sensible al Ca en placas de 384 pocillos temperatura controlada

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la farmacología de seguridad cardíaca. Por ejemplo, ¿una nueva medicina humana conlleva el riesgo de modificar el ritmo cardíaco normal? La principal ventaja de esta técnica es que puede evaluar un gran número de compuestos rápidamente y a un costo moderado.

Demostrando el procedimiento estará Camille Forny, una investigadora asociada en mi laboratorio. Para prepararse para la medición de las contracciones de sincronía de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre, o HIPSCCM, comience colocando CryoTubes que contienen células congeladas en un baño de agua de 37 grados Celsius durante dos minutos. Transfiera toda la suspensión con células descongeladas de cada tubo a un solo tubo cónico fresco de 50 mililitros.

Para recuperar las células sobrantes, lave cada tubo con un mililitro de medio de enchapado precmanado de 37 grados Celsius y agregue este medio al tubo cónico de 50 mililitros que contiene células descongeladas. Añadir ocho mililitros de medio de chapado caliente al tubo y mezclar cuidadosamente la suspensión. Utilice el método de exclusión azul trypan y un hemocicómetro para contar las células vivas.

Mediante la adición de medio de chapado caliente, ajuste la concentración a 50.000 células por mililitro. Para distribuir las células en dos nuevas placas de cultivo celular de 384 pozos, agregue 25 microlitros a cada pozo, lo que producirá alrededor de 12.500 células por pozo. Incubar las células a 37 grados centígrados en placas de 384 pozos en atmósfera humidificada con un 5% de dióxido de carbono para un total de tres a cuatro semanas.

Al día siguiente, sustituya el medio de chapado por 50 microlitros de medio de mantenimiento en caliente. Después, reemplace la mitad del medio de mantenimiento cada dos o tres días. En los días siete, 14 y 21, sustituya completamente el medio.

Una vez que las células se han mantenido en cultivo durante tres a cuatro semanas, se han formado espontáneamente contraytia, y el efecto de los compuestos en estas contracciones se puede medir. El día del ensayo, al menos dos horas antes de que la primera placa de celda se coloque dentro del lector de placas para la medición, encienda el lector y ajuste el sistema de calefacción a 37 grados centígrados. Para preparar las placas compuestas, calentar a temperatura ambiente 40 mililitros de medio de mantenimiento complementado con 1%volumen por volumen estreptomicina.

Mientras el medio se está calentando, distribuya los compuestos de ensayo y los controles en dos placas compuestas de 384 pozos añadiendo 1,5 microlitros de solución de stock por pozo. Centrifugar las placas compuestas a 100 G durante un minuto. Añadir 37 microlitros de medio de mantenimiento a cada pozo y centrifugar las placas de nuevo a 100 G durante un minuto.

Para preparar el tinte fluorescente, calentar 100 mililitros de medio de mantenimiento complementado con 1%volumen por volumen estreptomicina en un baño de agua celsius de 37 grados. A continuación, agregue 10 mililitros del medio calentado a la mezcla de colorante fluorescente sensible al calcio y quencher para reconstituirlos como medio de fluorescencia de stock. Inicie el software del lector de placas.

Prepare el software para registrar un segmento de dos minutos de ondas de calcio con una frecuencia de adquisición de al menos 10 hercios. Para hacer un medio de fluorescencia para cada placa celular, diluir tres mililitros de medio de fluorescencia en stock con 12 mililitros de medio de mantenimiento caliente con antibióticos. Sustituya 20 microlitros de medio en cada pozo de la placa celular por 30 microlitros de medio de fluorescencia y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo una vez.

Inmediatamente después de eso, coloque la placa en un lector de placas para permitir que los HIPSCCM se ajusten a la temperatura del lector durante 60 minutos. A continuación, inicie el software del lector de placas. Registre un segmento de dos minutos de ondas de calcio con una frecuencia de adquisición de al menos 10 hercios para definir la tasa de batir basal para cada pozo.

Es importante asegurarse de que la placa de celda no se transfiere fuera del dispositivo después de la adquisición de datos. Con algunas versiones de software, debe detener la grabación antes de que termine por completo. Utilice el robot lector de placas para pipetear cinco microlitros de la prueba y los compuestos de referencia bien a pozo desde la placa compuesta en la placa celular.

Después de eso, comience la adquisición de datos en el software de lector de placas para registrar dos segmentos de minutos de ondas de calcio a partir de cinco, 15, 30, 45 y 60 minutos después de la adición compuesta. Para iniciar el análisis de datos, exporte los datos sin procesar para cada período de grabación desde el software de lector de placas en archivos de texto ASCII. Y luego importarlos en el software de análisis de datos.

Desde el software de análisis de datos, exporte las frecuencias de batido primarias para cada período de grabación como copias del portapapeles. Extraiga la frecuencia de latido primaria para cada pozo y cada punto de tiempo. Por último, importe las frecuencias de batido en un software de hoja de cálculo pegando portapapeles y continúe el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto.

El registro de las ondas de calcio al inicio en una placa de 384 pozos muestra que en la mayoría de los casos todos los pozos revelan una tasa de golpes regular con poca variabilidad a través de la placa. Cuando se añaden bloqueadores de los canales iónicos cardíacos, afectan el ritmo de los cardiomiocitos. Amlodipino, un bloqueador de los canales de calcio lentos, acelera el ritmo más del 100% en una forma dependiente de la concentración hasta un micromolar.

Y por encima de eso, Amlodipino detiene la paliza. E-4031, un bloqueador de los canales de potasio rectificador retardado rápido desacelera el ritmo alrededor de 65 a 70% de una manera dependiente de la concentración hasta 10 micromolares. La tetrodotoxina, un bloqueador de los canales de sodio rápidos desacelera el ritmo alrededor del 15% de una manera dependiente de la concentración hasta uno a 30 micromolares, mientras que por encima de 30 micromolares, la tetrodotoxina detiene la paliza en los primeros cinco minutos.

Bepridil, un bloqueador mixto de los canales cardíacos de sodio, calcio y potasio también produce un efecto total o nada, lo que sugiere que el bloqueo del canal de sodio es la acción principal de bepridil. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ser extremadamente suave al pipetear en la placa de cultivo celular. Estos tejidos son muy frágiles y se dañan fácilmente si son tocados por pipetas.

No olvide que trabajar con células humanas y drogas activas puede ser peligroso, y las precauciones como usar guantes de seguridad y gafas siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.