Name: Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda a modelar la tuberculosis en peces cebra adultos usando Mycobacterium marinum y qPCR. Este método permite cuantificar cargas bacterianas y respuestas inmunitarias simultáneamente en el mismo individuo.

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Este trabajo ha sido apoyado por el finlandés Cultural Foundation (H.L.), Tampere Tuberculosis Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., M.P.), Fundación de la Asociación contra la Tuberculosis finlandesa (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H., M.P.), Sigrid frescos Juselius Fundación (M.P.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane y Aatos Erkko Fundación (M.P.) y Academia de Finlandia (M.P.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo y Jenna Ilomäki son reconocidos por su asistencia técnica. Los autores reconocen el laboratorio de pez cebra de Tampere para su servicio.

Pez cebra todos los experimentos han sido aprobados por la Junta de experimento Animal en Finlandia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Métodos se realizan según la ley (497/2013) y el decreto del gobierno (564/2013) sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos o educativos en Finlandia.
1. cultivo de Micobacterium marinum
Nota: Desde marinum de la micobacteria es un patógeno capaz de causar infecciones superficiales en los seres humanos, encontrar las orientaciones locales para la seguridad personal y la eliminación de residuos de riesgo biológico antes de comenzar a trabajar con esta bacteria.
<ol><li>M. marinum en un 7 H 10 de la cultura placa suplementado con 10% OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa, catalasa) enriquecimiento y 0.5% v/v del glicerol a 29 ° C durante al menos 5 días. Mantener culturas de M. marinum bacterias frescas del congelador cada dos semanas y transferir en un plato nuevo cada dos semanas. Nota: M. marinum es un patógeno de peces natural infectando a las especies acuáticas y es importante tomar precauciones para no contaminar las poblaciones de pez cebra con las bacterias. Pez cebra infectado y objetos contaminados con las bacterias tienen que mantenerse separados de las instalaciones de cría.</li>
	<li>Utilizar un asa de inoculación de 1 μl estériles asépticamente transferir un asa llena de masa bacteriana M. marinum en un frasco de cultivo celular que contenga 10 mL de 7 H 9 medio enriquecimiento ADC (dextrosa, albúmina, catalasa) de 10%, 0.2% v/v polisorbato 80 y 0.2% v/v de glicerol. Cultura de 3 a 4 días aproximadamente un OD600 (densidad óptica) de 0,7 a 29 ° C en la oscuridad sin agitación. Dejar la tapa suelta, o use una tapa de filtro, para permitir el suficiente intercambio de gases. Nota: Polisorbato 80 se agrega al medio para evitar la agregación de las bacterias. Además, la exposición a la luz conduce a cambios fenotípicos en colonias bacterianas (p. ej., el color cambia de blanco a amarillo). Para evitar esto, mantenga los cultivos en la oscuridad.</li>
	<li>Medir el valor de OD600con un espectrofotómetro. Diluir el cultivo líquido a un OD600 de 0.07-0.09 y continuar el cultivo durante 2 días a 29 ° C en la oscuridad, sin agitación. Dejar la tapa suelta. Nota: Durante estos dos días, la suspensión bacteriana llega a un OD600de aproximadamente 0.5 corresponde a una registro de la fase inicial.</li>
</ol>2. preparación de la solución bacteriana para infectar pez cebra adulto
<ol><li>Transferir la suspensión bacteriana en una gran cubeta estéril o en un tubo de 15 mL y colóquelo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos permitir que los grupos más grandes a resolver.</li>
	<li>Transferir la superior 5 – 7 mL de la suspensión a un tubo limpio o una cubeta y medir la OD600. Uso esta fase superior de la suspensión para las infecciones.</li>
	<li>Recoger 1 mL de cultivo de M. marinum en un fresco tubo y centrifugar durante 3 min a 10.000 x g. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de PBS estéril 1 x.</li>
	<li>Diluir hasta alcanzar la deseada concentración bacteriana utilizando estéril 1 x PBS con rojo de fenol 0,3 mg/mL como marcador. La suspensión diluida se dividen en tres alícuotas. Nota: Utilice un predeterminado OD600 vs UFC (unidades formadoras de colonias) / curva μL para estimar la dilución necesaria para obtener el número deseado de bacterias en la inyección de 5 μl volumen34. La correlación entre la concentración de la suspensión bacteriana y OD600 debe ser validado antes de iniciar los experimentos de infección real. Reserva dos semanas para recoger estos datos de validación.</li>
	<li>Utilizando una jeringa de 1 mL, lentamente tire la suspensión a través de 27 G aguja x 3. Para cada alícuota, realizar este paso antes de usar. Nota: No use la misma solución bacteriana por más de 2 h.</li>
</ol>3. experimental infección de M. marinum con inyección Intraperitoneal
<ol><li>Pipeta una gota de 5 μl de la solución bacteriana diluida en un pedazo de la película de parafilm y tire de la gota en una aguja de insulina 30 G.</li>
	<li>5 – 8 meses de uso-viejo tipo salvaje y peces mutantes rag1−/−hu1999 para el experimento. Anestesiar el pez cebra adulto en el agua del tanque con éster de etilo ácido 3-aminobenzoico de 0.02% (pH 7.0). Coloque el lado ventral del pez hacia arriba en una ranura en un plástico celular húmedo. Nota: Rag-/- peces mutantes no son capaces de pasar por la recombinación somática y producir las células T y B funcionales.</li>
	<li>Inyectar la aguja entre las aletas pélvicas en un ángulo aproximado de 45°. Mantener la apertura de la aguja hacia arriba para observar que la apertura es dentro de la cavidad abdominal. Inyecte lentamente la suspensión bacteriana y retire con cuidado la aguja. Nota: en caso de que el indicador rojo está escapando de los peces a inyección, excluir los pescados del experimento.</li>
	<li>Inmediatamente después de la inyección, transferencia de los peces en un tanque de recuperación con agua dulce del tanque.</li>
	<li>Tomar muestras de la suspensión bacteriana en 7H 10 placas cada 15 min del alícuota en uso bacteriano e incubar las bacterias a 29 ° C durante 5 días y verificar la dosis de la infección por recuento de las colonias en las placas.</li>
	<li>Compruebe con regularidad el bienestar de los peces y eutanasia cualquier pez con síntomas de la infección con más de 0.02% concentración de éster de etilo ácido 3-aminobenzoico (pH 7.0). Nota: Aproximadamente, el 7% del pez cebra adulto infectado con 34 ± 15 UFC y 30% de pez cebra infectados con 2029 ± 709 UFC han tenido síntomas por semanas 819. Los síntomas pueden incluir natación anormal, falta de respuesta al tacto, jadeo, edema o pérdida observable.</li>
	<li>Mantener el pez cebra según las normas comunes35.</li>
</ol>4. colección de órganos internos
<ol><li>Eutanasia el pez cebra con una sobredosis de éster de etilo ácido 3-aminobenzoico (más 0,02% concentración, pH 7.0) en el agua del tanque.</li>
	<li>Inserte un perno posterior a los radios branquiostegos y otro por la cola a los peces en la plataforma de la tachuela.</li>
	<li>Abrir la cavidad abdominal entero con un bisturí y recoger los órganos internos mediante el uso de una cuchara pequeña y pinzas puntiagudas. Empiece desde el corazón y a lo largo de la columna vertebral hacia la cola para separar todos los órganos internos en un solo bloque. Nota: Asegúrese de recoger todo el tejido renal por raspado a lo largo de la columna vertebral con la cuchara.</li>
	<li>Por último, utilice unas pinzas para separar el intestino al lado de la cloaca y transferir los órganos en un tubo de 1,5 mL homogeneización con seis granos de cerámica mm 2,8. Colocar inmediatamente en hielo seco para congelar la muestra. La muestra puede almacenarse a-80 ° C hasta homogeneizada.</li>
	<li>Enjuague el instrumental con etanol al 70% entre los individuos.</li>
</ol>5. homogeneización y RNA la extracción de un bloque de órgano.
Nota: El método es modificado de la Universidad de Stanford protocolos36.
<ol><li>Añadir solución de tiocianato-fenol de guanidina utilizada para la extracción de ácidos nucleicos (Tabla de materiales) en la parte superior de la muestra hasta un volumen total de 1.500 μl. asegurar que la muestra cubre un máximo de 10% del volumen total. PRECAUCIÓN: El volumen esperado de tejido recolectado es 100 μl. guanidina tiocianato-fenol solución contiene tóxico e irritante compuestos requiere ropa protectora, guantes de nitrilo y trabajar en una campana de humos. No combinar con lejía ya que esto causará la formación de gases tóxicos. Lea la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) antes de uso.</li>
	<li>Homogeneizar las muestras usando un homogeneizador de talón-golpes 3 veces 40 s a 3.200 rpm. Enfriar en hielo por 30 s entre los ciclos. Someter a ultrasonidos las muestras homogeneizadas en un baño de agua durante 9 minutos.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C y mover 1.000 μl de homogenado despejado en un tubo de microcentrífuga fresco.</li>
	<li>Añadir 200 μL de cloroformo, mezclar inmediatamente con un vórtex durante 15 s e incúbelos durante 2 minutos a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El cloroformo es un tóxico y compuesto irritante si se inhala, ingiere o contacto con la piel o los ojos. Use equipo de seguridad necesario para la protección personal y trabajar en una campana de humos. Lea la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) antes de uso.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C para separar las fases acuosas y orgánicas.</li>
	<li>Cuidadosamente, transferir 500 μl de la fase superior a un tubo nuevo para evitar contaminar el ARN. Quitar y desechar el resto de la fase acuosa (~ 100 μL) y la interfase y la fase orgánica a 4 ° C para la extracción de ADN. Nota: La fase superior contiene el ARN.</li>
	<li>Añadir 500 μl de 2-propanol y mezcle inmediatamente con un vórtex durante 15 s. Incubar 10 min a temperatura ambiente precipitar el ARN.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C para el RNA de la pelotilla. Quite el sobrenadante mediante pipeteo.</li>
	<li>Añadir 1 mL de etanol al 75% y de vortex por 10 s. Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí, y las muestras toda la noche guardado a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante mediante pipeteo.</li>
	<li>Repita los pasos de lavado 5.9, 5.10. Retire con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo y dejar el sedimento seque al aire en una campana de humos.</li>
	<li>Disolver el pellet de RNA en 500 μl de agua libre de nucleasas y mantener las muestras en hielo. Medir las concentraciones con un espectrofotómetro de microvolume o equipos equivalentes. Guardar el ARN a-80 ° C.</li>
</ol>6. purificación del pez cebra Co extraído y ADN micobacteriano
<ol><li>Preparar un buffer de extracción de la parte posterior (BEB) disolviendo 118,2 g de tiocianato de guanidina (concentración final 4 M), 3,68 g de citrato de sodio (concentración final 50 mM) y 30,29 g de Tris base libre (concentración final 1 M) en 120 mL de agua libre de nucleasas (este mes de mayo requieren agitación durante la noche). Añadir agua libre de nucleasas hasta un volumen total final de 250 mL y filtro para esterilizar la solución. Nota: Esta memoria intermedia puede almacenarse a temperatura ambiente hasta 6 meses. No combine BEB con lejía como reaccionan para producir gases tóxicos como el cloruro de hidrógeno y cianuro de hidrógeno.</li>
	<li>Usar la interfase y la fase orgánica de la muestra para extraer ADN micobacteriano. Añadir 500 μL de BEB a cada tubo. Mezcla extensivamente durante 10 minutos por inversión a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 12.000 x g durante 30 min a temperatura ambiente y cuidadosamente transferir 500 μl de la fase acuosa superior que contiene el ADN a un tubo nuevo.</li>
	<li>Añadir 400 μL de 2-propanol. Mezclar por inversión e incubar 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Un pellet que contiene el ADN debe ser visible en este momento. Retire con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo.</li>
	<li>Añadir 800 μL de etanol al 70%. Lavar el precipitado por inversión. No no agitar con vortex las muestras en este punto, como ADN genómico se descompone fácilmente.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante por pipeteo. Repita el lavado etanol (pasos 6.6 y 6.7).</li>
	<li>Eliminar el etanol por Pipetear cuidadosamente. Dejar que las muestras secar por 5 – 10 min disolver el pellet en 200 μL de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Medir las concentraciones de ADN con un espectrofotómetro de microvolume o equipos equivalentes. ADN puede almacenarse a 4 ° C o a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>7. cuantitativo PCR para medir cargas de micobacterias
<ol><li>Preparar mezclas de reacción de qPCR con no-ROX (carboxi-X-rodamina) contra el espaciador transcrito interno M. marinum (ITS) entre ITS 16S-23S según las instrucciones del fabricante con las cartillas de MMITS1 (tabla 1). Pipetear la mezcla de reacción y las diluciones de la muestra como duplicados en una placa de 96 pocillos adecuada para qPCR. Incluyen una serie de diluciones estándar de ADN de una cantidad conocida de bacterias en cada serie. Nota: La esperada carga de M. marinum por peces puede variar de 0 UFC a 1.000.000 UFC en wpi 4. El análisis de qPCR puede realizarse también con otros kits para qPCR pero la temperatura de recocido de los cebadores ha de ser volver a optimizado.</li>
	<li>Selle la placa con una película ópticamente transparente y centrifugar la placa a 2.000 x g durante 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ejecute el programa de qPCR que se muestra en la tabla 2.</li>
	<li>Usando la curva estándar, calcular el número de bacterias en la muestra de pescado entero.</li>
</ol>8. DNasa tratamiento de las muestras de RNA
<ol><li>Para eliminar cualquier posible resto de ADN genómico del RNA, realizar DNasa I tratamiento. Descongelar las muestras de RNA en el hielo. Nota: Asegúrese de utilizar sólo soluciones y equipo libre de RNasa y limpie la superficie de trabajo y pipetas con un reactivo de descontaminación eliminar RNasas (Tabla de materiales) antes de comenzar a trabajar. Usar una bata de laboratorio manga larga y guantes para proteger sus muestras.</li>
	<li>Preparar 10 μL DNasa I mezclas de reacción sobre hielo según las instrucciones del fabricante. Mezclar 1 μL de DNasa I, 1 μL de 10 x buffer de DNasa y 8 μL de ARN de la muestra incluyendo un máximo de 1 μg de RNA.</li>
	<li>Suavemente mezcle las reacciones (no Vortex) e incubar durante 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Antes de la inactivación de calor, añadir 1 μl de EDTA 50 mM a cada 10 μl de muestra. Si no se agrega EDTA, el RNA se someterá a degradación química cuando se calienta.</li>
	<li>Incubar 10 min a 65 ° C-Inactive por calor DNasa I. seguir directamente a la síntesis de cDNA o almacenar el ARN tratados con DNasa a-80 ° C.</li>
</ol>9. síntesis de cDNA
<ol><li>Mantenga todos los reactivos y las muestras en hielo y preparar las mezclas de reacción según las instrucciones del fabricante. Incluyen una mezcla de reacción de 5 μL, 1 μL de mezcla de maestra de transcripción reversa, 3 μL de agua libre de nucleasas y 1 μL de DNasa trataron RNA.</li>
	<li>Mezclar suavemente las reacciones de transcripción inversa y brevemente girar el tubo, si es necesario.</li>
	<li>Colocar las muestras en una máquina PCR y usar el programa que se muestra en la tabla 3.</li>
	<li>Diluir el cDNA en agua libre de nucleasa para qPCR a una concentración máxima de 2.5 ng/μL, si es necesario. cDNA puede ser almacenado a-20 ° C.</li>
</ol>10. expresión del gen de pez cebra por PCR cuantitativo de medición
<ol><li>Preparar una mezcla maestra de qPCR sobre hielo según las instrucciones del fabricante y proteger de la luz. Utilizar los iniciadores introducidos en la tabla 1. Nota: Para calcular el doble de la inducción para cada gen, medir la expresión también de una muestra de referencia agrupados extraída de pez cebra saludable 6.</li>
	<li>Preparan réplicas de cada muestra y pipetear las mezclas de reacción en un plato de qPCR. Selle la placa con una película ópticamente transparente y centrifugar la placa a 2.000 x g durante 2 min a 4 ° C antes de comenzar la carrera.</li>
	<li>Ejecutar la qPCR programa que se muestra en la tabla 4 con la temperatura de recocido según el par de la cartilla utilizada (tabla 1).</li>
	<li>Analizar la relación de la expresión de gene en comparación con un gen de mantenimiento de la casa (loopern437) con el método de ΔCt usando la ecuación: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58299/58299eq1.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos una aplicación basada en qPCR para medir cargas micobacterias de ADN extraído de los tejidos del pez cebra adulto infectados experimentalmente. Esta aplicación se basa en cartillas diseñadas alrededor de la 16S-23S rRNA espaciador transcrito interno secuencia40. La carga total de micobacterias en una muestra de pescado se calcula usando una curva estándar, preparada a partir de ADN extraído de un número conocido de micobacterias cultivadas y suponiendo que una bacteria tiene una c...

Pez cebra (Danio rerio) es un modelo animal ampliamente utilizado en la investigación biomédica y es un modelo aceptado para la biología de vertebrados comun. El pez cebra se ha adaptado a muchos campos de investigación modelado de enfermedades humanas y trastornos que van desde cáncer1 y2 de la enfermedad cardiaca infección y estudios inmunológicos de varias bacterias 3 y las infecciones virales4 , 5. Además, el desarrollo de ex útero de embriones de pez cebra ha hecho el pez cebra un modelo popular en Biología del desarrollo6 y toxicología7,8.
En muchos campos de investigación, incluida la biología de la infección, se utilizan las larvas de pez cebra ópticamente transparente. Las primeras células inmunes aparecen dentro de fertilización post de 24 h (hpf), cuando los macrófagos primitivos son detectado9. Neutrófilos son las células inmunes próximo a aparecer alrededor 33 hpf10. Larvas de pez cebra son factibles para el estudio de las primeras etapas de la infección y el papel de la inmunidad innata en la ausencia de las células inmunes adaptantes11. Sin embargo, el pez cebra adulto con su sistema inmune adaptante completamente funcional proporciona una capa adicional de complejidad para los experimentos de infección. Las células T pueden detectarse alrededor de 3 días post fecundación12, y B las células son capaces de producir anticuerpos funcionales por 4 semanas post fecundación13. El pez cebra adulto cuenta con las principales contrapartes de los mamíferos inmunitarias innata y adaptativa. Las principales diferencias entre la immune systems de los peces y los seres humanos se encuentran en isotipos de anticuerpos, así como en la anatomía de los tejidos linfoides. El pez cebra tiene sólo tres anticuerpos clases14, mientras que los seres humanos tienen cinco15. En la ausencia de médula ósea y ganglios linfáticos, los órganos linfoides primarios en los peces son el riñón y el16 del timo y el bazo, el riñón y el intestino sirven como órganos linfoides secundarios17. A pesar de estas diferencias, con su arsenal completo inmune de células innatas y adaptativas, el pez cebra adulto es un modelo altamente aplicable, fácil de usar, no mamíferos para estudios de la interacción huésped-patógeno.
El pez cebra se ha establecido últimamente como un posible modelo para estudiar la tuberculosis18,19,20,21,22. La tuberculosis es una enfermedad aerotransportada causada por Mycobacterium tuberculosis. Según la Organización Mundial de la salud, la tuberculosis causó1,7 millones de muertes en 2016 y es la principal causa de muerte por un solo patógeno en todo el mundo23. Ratones de24,25, conejos26 y27 de primates no humanos son que los animales más conocidos modelos de investigación de tuberculosis sino cada cara sus limitaciones. El modelo de primates no humanos de infección por M. tuberculosis se asemeja a la enfermedad humana más cerca, pero con este modelo es limitado debido a serias consideraciones éticas. Otros modelos animales se ven obstaculizados por la especificidad del hospedador de M. tuberculosis que afecta a la patología de la enfermedad. El amplio espectro de infección y enfermedad los resultados en la enfermedad humana es probablemente el mayor problema en modelado de tuberculosis: la tuberculosis es una enfermedad muy heterogénea desde esterilización inmunidad a la infección latente, activa y reactivar28 , que puede ser difícil de reproducir y modelo experimental.
Mycobacterium marinum es un pariente cercano de M. tuberculosis con proteínas orthologous ~ 3.000 con el 85% del aminoácido identidad29. M. marinum naturalmente infecta peces cebra produce granulomas, los sellos de la tuberculosis, en sus órganos internos19,30. A diferencia de otros modelos animales utilizados en la investigación de la tuberculosis, pez cebra produce muchos descendientes, que requiere sólo un espacio limitado y lo importante, es el modelo de tuberculosis vertebrados menos desarrollado disponible neurophysiologically. Además, la infección de M. marinum provoca una infección latente, enfermedad activa o incluso la esterilización de la infección micobacteriológica en pez cebra adulto mímico de cerca el espectro de los resultados de la enfermedad de tuberculosis humana19, 31 , 32. aquí, se describen métodos para el modelo de tuberculosis experimental del pez cebra adulto por M. marinum de inyección en la cavidad abdominal y mediante PCR cuantitativa para medir las cargas de micobacterias y respuesta inmune del pez cebra muestras de tejido.

<table><tbody><tr><td>Mycobacterium marinum</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 927</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H10 agar</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11799042</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock OADC enriquecimiento</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H9 medio</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific 11753473</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock ADC enriquecimiento</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GENESYS20 Espectrofotómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tabletas salinas tamponadas con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Rojo de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 27 G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 100 30 G aguja de insulina</td><td>Braun</td><td>9151133</td><td></td></tr><tr><td>Éster etílico de ácido 3-aminobenzoico (pH 7.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tubo de homogeneización</td><td>Qiagen</td><td>13119-1000</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de cerámica de 2,8 mm</td><td>Qiagen</td><td>13114-325</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, ETAX Aa</td><td>Altia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td></td></tr><tr><td>Tiocianato de guanidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277</td><td>FW 118,2 g/mol</td></tr><tr><td>Citrato</td> <td>de sodioSigma-Aldrich</td><td>1613859</td><td>FW 294,1 g/mol</td></tr><tr><td>Tris (base libre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>FW 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Reactivo TRI</td><td>Centro de Investigación Molecular</td><td>TR118</td><td>Solución de tiocianato-fenol de guanidina</td></tr><tr><td>Homogeneizador PowerLyzer24</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator m08</td><td>Finnsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Mezcla Maestra Verde</td><td>Bioline</td><td>BIO-98005</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Placa de 96 pocillos</td><td>BioRad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Película ópticamente transparente</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Termociclador con sistema en tiempo real CFX96</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10666421</td><td>reactivo de descontaminación que elimina las RNasas</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Transcripción inversa Master Mix</td><td>Fluidigm</td><td>100-6298</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green master mix</td><td>BioRad</td><td>172-5211</td><td></td></tr></tbody></table>

modelado de la tuberculosis de mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis es actualmente el patógeno humano más mortal causando infecciones 10,4 millones y 1,7 millones de muertes cada año. La exposición a esta bacteria causa un espectro amplio de enfermedad en los seres humanos que van desde una infección esterilizada a una mortal enfermedad activa progresiva. La forma más común es la tuberculosis latente, que es asintomática, pero tiene el potencial de reactivar en una enfermedad fulminante. Pez cebra adulto y su patógeno natural marinum de la micobacteria han demostrado recientemente para ser un modelo aplicable para estudiar el espectro amplio de enfermedad de la tuberculosis. Lo importante, se puede estudiar espontánea latencia y reactivación así como respuestas inmune adaptativas en el contexto de infección por micobacterias en este modelo. En este artículo, se describen métodos para la infección experimental del pez cebra adulto, la colección de órganos internos para la extracción de ácidos nucleicos para la medición de cargas de micobacterias y anfitrión inmunorespuestas por PCR cuantitativa. El en desarrollada internamente, M. marinum -ensayo qPCR específica es más sensible que los métodos tradicionales de la galjanoplastia como también detecta DNA de micobacterias no se dividen, latentes o recientemente muertas. Como ADN y ARN extraídos de la misma persona, es posible estudiar las relaciones entre el estado enfermo y la expresión de genes huésped y patógeno. El modelo de pez cebra adulto para la tuberculosis se presenta así como un sistema altamente aplicable, no mamíferos en vivo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno.

El patógeno natural de pescado marinum de la micobacteria infecta los órganos internos del pez cebra y produce una infección sistémica con granulomas histológicamente visible19. Pez cebra adulto están infectadas con M. marinum por inyección intraperitoneal. Se extracción el ADN y el ARN, y la carga por micobacterias se mide por la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) usando la DNA como plantilla. El esquema del método se muestra...

Aquí, presentamos un protocolo de tuberculosis humana modelo en un pez cebra adulto utilizando su patógeno natural marinum de la micobacteria. Extraen ADN y ARN de los órganos internos del pez cebra infectado pueden utilizarse para revelar que el total de micobacterias cargas en los peces y la respuesta inmune del hospedador con qPCR.

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la tuberculosis, como cuál es el papel de las respuestas inmunitarias adaptativas y la patogénesis de esta enfermedad multifactorial. La principal ventaja de este método base de ácido nucleico es que tanto las cargas bacterianas como los niveles de expresión génica se pueden medir desde el mismo individuo. Para comenzar este procedimiento, haga referencia a M.marinum en una placa 7H10 como se describe en el protocolo de texto.Transfiera 10 mililitros de medio 7H9 que contengan enriquecimiento ADC, polisorbato 80 y glicerol a un matraz de cultivo celular. A continuación, utilice un bucle de inoculación estéril de un microlitrotro para transferir asépticamente un bucle de masa bacteriana M.marinum al matraz. Deje la tapa suelta o use una tapa de filtro para permitir un intercambio de gas y un cultivo suficientes a 29 grados centígrados en la oscuridad sin agitar durante tres o cuatro días hasta que el OD600 alcance aproximadamente 0,7.Diluir y continuar cultivando las bacterias como se describe en el texto. Para comenzar a preparar la solución bacteriana para la infección, transfiera un mililitro del cultivo a un tub

modeling-tuberculosis-mycobacterium-marinum-infected-adult

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales...

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

Fuente: Niu, L., et al. Visualización de la muerte celular lítica de macrófagos durante la infección por micobacterias en embriones de pez cebra mediante microscopía intravital. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demuestra el uso de microscopía confocal intravital para visualizar la muerte lítica de los macrófagos en embriones de pez cebra tras una infección por Mycobacterium marinum .

Imágenes en vivo de la muerte celular de los macrófagos durante la infección por micobacterias en embriones de pez cebra

Fuente: Bernut, A., et al. Desciframiento e imagen de la patogénesis y cordón de Mycobacterium abscessus en embriones de pez cebra. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demuestra un protocolo que utiliza embriones transgénicos de pez cebra que expresan macrófagos fluorescentes e infectados con la cepa rugosa fluorescente de Mycobacterium abscessus para visualizar las interacciones huésped-patógeno. Revela cómo el cordón extracelular permite la evasión inmunitaria, promoviendo la supervivencia...

Imágenes en vivo de las interacciones huésped-patógeno en embriones de pez cebra infectados con Mycobacterium abscessus

Fuente: Luukinen, H., et al. Modelado de la tuberculosis en peces cebra adultos infectados por Mycobacterium marinum .  J. Vis. Exp. (2018).

Evaluación del papel de la inmunidad del huésped en la infección por micobacterias utilizando un modelo de pez cebra

Fuente: Flores, E., et al. Utilizando el protozoo Paramecium caudatum como vehículo para infecciones alimentarias en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demuestra el método para establecer un modelo de infección intestinal bacteriana transmitida por alimentos en larvas de pez cebra, alimentándolas con paramecia infectada con E. coli fluorescente.

Modelado de la infección intestinal en larvas de pez cebra utilizando bacterias transmitidas por alimentos

Este artículo describe la tubería de vídeo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para infectar y analizar un gran número de embriones de pez cebra que proporcionan una nueva herramienta potente para las pruebas de compuesto y el descubrimiento de fármacos usando todo un organismo animal vertebrado.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Las interacciones espacio-temporales in vivo del patógeno y las defensas inmunitarias a nivel de la mucosa no se visualizan fácilmente en los huéspedes vertebrados existentes. El método presentado aquí describe una plataforma versátil para estudiar la candidiasis de la mucosa en vertebrados vivos utilizando la vejiga natatoria del pez cebra juvenil como sitio de infección.

Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

Los embriones de pez cebra ópticamente transparentes se utilizan ampliamente para estudiar y visualizar en tiempo real las interacciones entre los microorganismos patógenos y las células inmunitarias innatas. La microinyección de Mycobacterium abscessus, combinada con imágenes de fluorescencia, se utiliza para examinar las características patógenas esenciales, como la formación del cordón en los embriones de pez cebra.

Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; En embriones de pez cebra

Aquí se describe un protocolo para la inmunización del adulto pez cebra (Danio rerio) con una vacuna de ADN y demostrar la validación de un evento de éxito de la vacunación. Este método es adecuado para la investigación preclínica de candidatos vacunales en varios modelos de infección.

Inmunización de pez cebra adulto para la evaluación preclínica de vacunas basadas en ADN

Este protocolo describe una técnica para visualizar el comportamiento de los macrófagos y la muerte en peces cebra embrionarios durante la infección por Mycobacterium marinum. Se incluyen medidas para la preparación de bacterias, infección de embriones y microscopía intravital. Esta técnica se puede aplicar a la observación del comportamiento celular y la muerte en escenarios similares que implican infección o inflamación estéril.

Visualización de la muerte de células líticas de macrófagos durante la infección micobacteriana en embriones de pez cebra a través de la microscopía intravital

En la actualidad hay una falta de modelos in vivo susceptibles de cribado de fármacos contra infecciones bacterianas crónicas. En este trabajo se describe un protocolo para la infección de heridas por un aislado clínico de Pseudomonas aeruginosa para generar una infección persistente en larvas de pez cebra.

Modelado de la infección persistente por Pseudomonas aeruginosa en larvas de pez cebra heridas

Aprenda a modelar la tuberculosis en peces cebra adultos usando Mycobacterium marinum y qPCR. Este método permite cuantificar cargas bacterianas y respuestas inmunitarias simultáneamente en el mismo individuo.

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

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