Name: Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a aislar hepatocitos primarios de ratón funcionales mediante perfusión hepática con catéter de 24G y detectar proteínas nacientes usando marcaje no radiactivo con L-azidohomoalanina. Este protocolo facilita el estudio del metabolismo energético hepático en enfermedades metabólicas como obesidad y diabetes tipo 2.

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Agradecemos a los Drs. Joonbae Seo y Vivian Hwa por sus contribuciones científicas y discusión. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de salud (NIH) (R01DK107530). T.N. fue apoyado por el PRESTO de la Agencia de tecnología y ciencia de Japón. Una parte de este estudio fue apoyada por una subvención del NIH (P30DK078392) para el centro digestivo enfermedad investigación Core en Cincinnati.

Este protocolo contiene el uso de ratones de laboratorio. Cuidado de los animales y los procedimientos experimentales fueron realizados según los procedimientos aprobados por los comités de cuidado de los animales del Cincinnati Children s Hospital Medical Center.
1. aislamiento de hepatocitos primario de ratón
<ol><li>Preparaciones pre-aislamiento<ol>
<li>Preparar 450 mL de buffer gradiente de densidad 40% tal como se describe en la tabla 1 y mantener a 4 ° C (15 mL/ratón).</li>
		<li>Preparar 500 mL de medio de Williams como se describe en la tabla 1 y guardar a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar 500 mL de DMEM como se describe en la tabla 1 y mantener en hielo (30 mL/ratón).</li>
		<li>Preparar 500 mL de tampón HBSS (-) como se describe en la tabla 1 y mantener a 42 ° C en el baño de agua (40 mL/ratón).</li>
		<li>Preparar 500 mL de HBSS (+) Buffer con 0,3 mg/mL de colagenasa tipo X como se describe en la tabla 1 con 30 min de incubación a 42 ° C en el baño de agua (40 mL/ratón).</li>
		<li>Configurar la bomba de perfusión mediante la colocación de los tubos de administración vía intravenosa (I.V) en el enganche pedal y comprobando el flujo de lavado solución sin burbujas de aire.</li>
		<li>Caliente el calentador de tubo de 42° C.</li>
		<li>Enfriar la máquina de centrifugar a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestesia y perfusión<ol>
<li>Limpiar las áreas de trabajo y de la bomba.</li>
		<li>Enjuague el tubo IV bomba conectada mediante la ejecución de etanol al 70% durante 10 minutos.</li>
		<li>Eliminar el etanol residual del tubo IV bomba conectada aclarando con DDW completamente durante 10 minutos.</li>
		<li>Limpie la tijeras y pinzas con etanol al 70%.</li>
		<li>Coloque el ratón en un recipiente de plástico con fondo de malla y con la gasa empapada de isoflurano de 2 mL por debajo de la malla para evitar el contacto directo.</li>
		<li>Evaluar la profundidad de la anestesia por reflejo pedal (pellizco firme del dedo del pie).</li>
		<li>Quite el ratón cuando ha alcanzado la profundidad deseada de la anestesia. Nota: El tiempo de inducción de la anestesia no debe ser más de 1 minuto.</li>
		<li>Construir un cono de la nariz mediante un tubo cónico de 15 mL con 1 mL isoflurano empapada empujada hasta el final del tubo.</li>
		<li>Controlar la profundidad de la anestesia al mover el cono de nariz más cerca o lejos de la nariz de ratón.</li>
		<li>Coloque el ratón sobre la plataforma de trabajo con el lado ventral hacia arriba.</li>
		<li>Etanol al 70% del aerosol sobre el área abdominal del ratón y luego abrir la cavidad abdominal por hacer una gran incisión transversal de la dermis y el peritoneo utilizando unas tijeras afiladas y pinzas dentadas.</li>
		<li>Luego, realizar un corte vertical de las capas abdominales hasta que todos los órganos abdominales están totalmente expuestos utilizando unas tijeras afiladas y pinzas dentadas.</li>
		<li>Movimiento pequeño e intestinos grandes hacia el lado izquierdo del ratón con punta de algodón esterilizado hasta el hígado, la vena porta y la vena cava inferior (IVC) están claramente expuestos.</li>
		<li>Inserte un catéter 24 G IVC a la bifurcación con la vena renal derecha con cuidado sin agitar las manos para evitar la lesión de la vena cava inferior y sangrado. Nota: Si se produce la hemorragia mientras se inserta el catéter en vena cava inferior, entonces usted debería intentar Inserte el nuevo catéter en una vena porta.</li>
		<li>Retire la aguja del catéter y controlar la posición de la cánula para evitar salir de la vena cava inferior, luego conectar cánula 24 G con el tubo de perfusión mediante el conector. Nota: Evitar la presencia de burbujas de aire antes de comenzar la perfusión.</li>
		<li>Iniciar la perfusión del hígado con HBSS caliente (-) a un flujo de 4 mL/min y corte la vena esplénica rápidamente para drenar la sangre interna mediante el uso de tijeras. Nota: Si la canulación es exitosa, el hígado comenzará a blanch debido a la distribución del reflujo de la solución de IVC a las venas hepáticas. La vena porta está formada por la Unión de las venas mesentéricas superiores y esplénicas; por lo tanto, es bastante seguro cortar la vena esplénica, puesto que es grande y distal desde el hígado.</li>
		<li>Continuar perfusión con 35 mL de HBSS caliente (-). Nota: El hígado se convertirá en pálido en color si la perfusión es adecuada y el ratón sigue vivo bajo anestesia en esta etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digestión y extracción<ol>
<li>Perfusión del hígado de ratón con caliente 35 mL de HBSS (+) incluyendo colagenasa tipo X a una velocidad de flujo de 4 mL/min.</li>
		<li>La vena esplénica de la abrazadera de cada pocos minutos, mediante el uso de fórceps para ~ 10 s para permitir que todo el volumen de HBSS (+) para difundir en todas las partes anatómicas del hígado. Nota: El hígado comienza a hincharse después de pinzamiento de la vena esplénica debido a la congestión de búfer.</li>
		<li>Vierta 5 mL del preparado caliente HBSS (+) con colagenasa tipo X 100 mm plato de Petri en el final de la perfusión.</li>
		<li>Corte el hígado perfundido por el resto del cuerpo antes de parar la bomba para evitar el reflujo de sangre en el hígado, extirpar la vesícula biliar por fórceps y luego limpie el hígado suavemente con una toalla de papel para quitar la sangre.</li>
		<li>Transferir el hígado a la placa de Petri que contiene 5 mL de preparado caliente HBSS (+) y retire la cápsula hepática suavemente con unas pinzas de punta recta. Nota: La cápsula hepática es una capa delgada de tejido conectivo que rodean el hígado.</li>
		<li>Dispersar el tejido parénquima cuidadosamente mediante el uso de los fórceps. Añadir 15 mL DMEM frío a la caja Petri. Nota: El medio volverá turbio debido a células parenquimatosas si el hígado se digiere bien.</li>
		<li>Agite el hígado roto suavemente para liberar las células de parénquima residual en el medio y añadir otros 15 mL DMEM frío a la caja Petri para obtener el resto de las células.</li>
		<li>Transferencia de DMEM con el hígado disuelto a través de 100 μm tamiz de células en un tubo cónico de 50 mL y conservar en hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificación del<ol>
<li>Centrifugue la suspensión de células a 60 x g durante 2 min a 4 ° C, con cuidado quite el sobrenadante por aspiración al vacío y resuspender el precipitado en 10 mL DMEM.</li>
		<li>Añadir resuspendido como una capa delgada en la parte superior 40% buffer gradiente de densidad y centrifugar a 800 x g por 10 min sin freno en 4° C.</li>
		<li>Retire con cuidado el sobrenadante como la capa superior (DMEM) y la capa media (células no parenquimatosas o muertas), pero no la capa más baja (pellets: hepatocitos primarios de parénquima).</li>
		<li>Resuspender las células primarias con E medio de 2 – 3 mL William y transferir al nuevo tubo de 50 mL para evitar la contaminación de células muertas en la pared del tubo.</li>
		<li>Añadir medio de 7-8 mL Guillermo E, mezclar suavemente y centrifugar a 800 x g durante 1 min a 4 ° C.</li>
		<li>Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración al vacío y luego Resuspender el precipitado nuevamente con 10, 20 o 30 mL de medio de William E (según el tamaño de la pelotilla).</li>
		<li>Contar las células usando un contador de células automatizado.</li>
		<li>De semillas con medio de Guillermo E, mantenga la placa en una incubadora a 37° C para 2-3 h, entonces reemplazar el % de medio with10 medio DMEM FBS con anti-Anti para eliminar las células muertas o y para la incubación a 37 ° C.</li>
		<li>Al día siguiente, hepatocitos primario de ratón están listos para su uso experimental.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Análisis de la reacción de ligadura quimioterapia selectiva para la detección de la síntesis de la proteína naciente
<ol><li>Etiquetado metabólico<ol>
<li>(Tratamiento previo) Lavar dos veces hepatocitos primarios con PBS caliente de 37 ° C y añadir el medio DMEM libre de metionina por 30 min a agotar la metionina citoplásmica se reserva. Nota: L-Azidohomoalanine, es un aminoácido y un análogo de metionina, contiene una molécula de azido que puede ser incorporado en las proteínas durante la biosíntesis de proteínas celulares que agotamiento de metionina citoplásmico mejorará la alimentación y la incorporación de L-Azidohomoalanine en las proteínas recién sintetizadas de hepatocitos primarios cultivadas.</li>
		<li>(Tratamiento) Hepatocitos primarios de lavado con 37 ° C caliente PBS dos veces y añadir el medio DMEM libre de metionina con 25 μM AHA (L-Azidohomoalanine) por 4-6 h.</li>
		<li>Añadir cualquier químico específico (es decir, 10 rotenona μM) en el medio de 4 – 6 h en presencia de AHA para investigar su efecto sobre los niveles de expresión de la proteína naciente.</li>
		<li>Después de la incubación, el medio de extracción con bomba aspirativa Lave y hepatocitos primarios con PBS frío tres veces.</li>
		<li>Añadir tampón de lisis de 200 μL para la placa e incube durante 15-30 min en hielo, y luego incline la placa y el lisado a 1,7 mL de tubo de células enteras. Nota: Se debe observar que lisado de ese celular es muy pegajoso durante la recolección de células.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos el lisado celular en hielo durante 5 s tres veces mediante el uso de un sonicador de sonda para solubilizar las proteínas y el ADN se dispersan.</li>
		<li>Mezclar la célula lisada por 5 min, centrifugar la célula lisada a 21.130 x g por 10 min a 4 oC y luego transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Medir la concentración de proteínas dos veces. Nota: En esta etapa, las muestras de proteína pueden almacenarse a-20 ° C durante dos semanas si no se utilizan inmediatamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etiquetado la proteína naciente modificado de la azida<ol>
<li>Preparar los componentes (A + B) añadiendo 60 μL de componente (A) para la componente (B). Nota: La solución se convierte en rosa brillante en el color después de agregar el componente (A) a (B).</li>
		<li>Preparar los buffers (D) y (E) de acuerdo al Protocolo.</li>
		<li>20 – 40 μg celular lisado y añadir 50 μL de 2 x buffer de reacción (componente A + B), luego ajuste el volumen al 80 μL añadiendo DDW y agitar durante 5 s.</li>
		<li>Añadir 5 μL CuSO4 (componente C) y agitar durante 5 s.</li>
		<li>Añadir 5 buffer de reacción μL 1 aditivo (componente recién preparada D), a continuación, vortex para 5 s y espere 3 minutos.</li>
		<li>Añadir 10 μL reconstituido reacción tampón 2 aditivos (componente E), entonces vortex para 5 s y rotar las muestras durante 20 min a 4 ° C utilizando una máquina de rotor múltiple. Nota: La solución se convierte en naranja brillante en color después de agregar el componente (E). Las muestras deben protegerse de la luz durante la rotación.</li>
		<li>Añadir 300 μL de metanol y de vortex durante 5 s, agregar 75 μL cloroformo y vortex durante 5 s, luego agregar 200 μL DDW vortex durante 5 s.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 21.130 x g y 4° C durante 5 minutos, luego deseche el sobrenadante acuoso y mantener el pellet.</li>
		<li>Añadir 250 metanol μL al tubo, vortex y vuelta otra vez por 5 min a 21.130 x g.
</li>
		<li>Eliminar el sobrenadante, luego cubrir las muestras con la pelusa y permita que los pellets secar al aire durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de la página y el borrar occidental<ol>
<li>Solubilizar el precipitado en 20 μL de la carga del buffer sin β-mercaptoetanol, vortex durante 10 minutos, calor a 70 º C utilizando el bloque de calor durante 10 minutos. Luego de cargar las muestras en el gel de SDS 10% (1,5 mm) para la detección de Tetramethylrhodamine (TAMRA).</li>
		<li>Detectar la señal de AHA utilizando un escáner de láser de modo variable para la cuantificación precisa de proteínas nacientes.</li>
		<li>Lavar el Gel con DDW durante 15 minutos.</li>
		<li>Entonces, tinción del gel de SDS 10% con un reactivo colorante coomassie rápido y sensible de 15-60 min detectar proteínas totales como control.</li>
		<li>La mancha el Gel con DDW para 1 – 2 h y adquirir la imagen mediante el uso de un sensor de fluorescencia UV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores indican que no tienen ningún conflicto de intereses.

Aunque varias líneas inmortalizadas de la célula hepática han sido propuestas y usados para investigar funciones hepáticas49,50,51,52, estas células carecen generalmente de la importante y fundamental funciones de los hepatocitos normales, como la expresión de albúmina (figura 3). Es ampliamente reconocido, por lo tanto, que utilizando hepatocitos primarios es una ...

La proteína es un elemento nutricional importante y aproximadamente el 50% del peso seco de un cuerpo humano está compuesto de proteínas que tienen varios rasgos biológicos y funciones1. En consecuencia, la síntesis de proteínas es uno de los eventos que la mayoría de energía y una alteración en el metabolismo de la proteína es altamente asociada con el desarrollo de enfermedades, incluyendo enfermedades metabólicas2,3,4. En el hígado, biosíntesis de la proteína representa aproximadamente 20 – 30% del total de energía consumo5,6. Además, la función de las proteínas no sólo pasiva o bloques del hígado, pero también activas factores de mediación de señal intracelular o extracelularmente para regular el metabolismo sistémico7. Por ejemplo, niveles reducidos de albúmina sérica, que es sintetizada y secretada por el hígado y la proteína más abundante en el plasma8, aumenta el riesgo de diabetes tipo 2 desarrollo9,10, 11, mientras que una mayor concentración de albúmina sérica es protectora contra el desarrollo de síndrome metabólico12. Además, disturbado o ruptura de las proteínas hepáticas secretores o membrana-limite, que modulan las homeostasis del colesterol, incluyendo lipoproteínas, LDLR y LRP1, puede conducir al desarrollo de resistencia a la insulina, hiperlipidemia y ateroesclerosis 13. por lo tanto, la identificación de los mecanismos fisiopatológicos moleculares que están involucrados en la alteración del metabolismo de proteínas en el hígado y sus complicaciones metabólicas asociadas podría ser útil para descubrir la novela farmacológica enfoques para retardar Inicio o tratar enfermedades metabólicas como la resistencia a la insulina, diabetes y hígado graso no alcohólico.
Síntesis de la proteína está estrechamente ligada a la situación de la energía celular (p. ej., la formación de un enlace peptídico durante la etapa de elongación de la síntesis proteica requiere de enlaces fosfodiéster 414) y está regulada por vías moleculares que sensación Inter y intra cellular la disponibilidad de nutrientes15,16. Quinasa activada por AMP (AMPK) es uno de los sensores de energía intracelular que mantienen la homeostasis de energía17. Una vez que la AMPK se activa cuando los niveles de energía celulares se baja, AMPK y sus sustratos específicos función para estimular vías catabólicas e inhiben los procesos anabólicos incluyendo proteína síntesis18,19. La regulación de la síntesis de proteínas está mediada por fosforilación de múltiples factores de traducción y proteínas ribosomales20. De la nota, el blanco mamífero de rapamicina complejo 1 (mTORC1), un motor importante de la síntesis de proteínas, es uno de los principales objetivos de AMPK21. Activación de la vía de la mTORC1 aumenta el crecimiento celular y la proliferación de proteína estimulante traducción y autofagia20,21. Por lo tanto, es lógico que activación de la AMPK puede inhibir la síntesis de proteína mTORC1 mediada por22. De hecho, la activación de la AMPK contrarresta y fosforila directamente mTORC1 en residuos de treonina 2446 (Thr2446) conduce a su inactivación23 y la supresión de la biosíntesis de proteína24. Por otra parte, AMPK indirectamente puede inhibir la función de mTORC1 por fosforilación y activación de esclerosis tuberosa el complejo 2 (TSC2)25 que es el regulador de aguas arriba de la cascada de señalización de mTORC1. En definitiva, desregulación de estas vías en el hígado a menudo está relacionada con el desarrollo de enfermedades metabólicas y por lo tanto hay una necesidad crítica para establecer eficaces herramientas experimentales para investigar el papel de estas vías en la regulación de energía y metabolismo de proteínas en los hepatocitos.
Existe una fuerte similitud entre las propiedades funcionales de hepatocitos primarios aislados y en vivo hepatocitos que con en vitro derivados del hígado de la célula líneas26,27,28. Se ha demostrado que hepatocitos humanos primarios comparten similitud de 77% con la de las biopsias del hígado, mientras que las células HepG2, que son las células cancerígenas hepáticas bien diferenciadas y ampliamente utilizan para investigar las funciones hepáticas, muestran menos del 48% en el contexto de 29los perfiles de expresión génica. Por lo tanto, la utilización de hepatocitos primarios, en lugar de células inmortalizadas de la cultura, es de vital importancia en la investigación de la fisiología y función hepática, y varios protocolos están disponibles para el aislamiento y cultivo de hepatocitos primarios especialmente de las ratas30,31. Mientras que los hepatocitos de rata son útiles con un rendimiento relativamente superior de las células, hepatocitos de ratón tienen un potencial mayor en muchos aspectos científicos debido a la amplia disponibilidad de ratones genéticamente modulados. Sin embargo, hay varias dificultades técnicas en el aislamiento de hepatocitos primarias sanas y abundantes de los ratones para las evaluaciones en base celular y molecular: en primer lugar, inserción de cánula para inundar el hígado con reactivos buffer es muy difícil de manejar debido al ratón pequeño y delgado de la vena porta o vena cava inferior; en segundo lugar, un tiempo de manipulación de las células durante el aislamiento puede causar reducción en la cantidad de células y la calidad; métodos de separación mecánica en tercer lugar, no-enzimáticos pueden provocar daños graves y producir un bajo rendimiento de hepatocitos primarios aislados viable32,33. En la década de 1980, técnica de perfusión de colagenasa se introdujo para aislar hepatocitos de hígados de animales34. Este método se basa en perfusión de colagenasa de los hígado35,36,37, infusión de hígado con calcio quelante solución38,39, digestión enzimática y disociación mecánica de la parenquimia hepática35. En el primer paso, un hígado de ratón es inundado con un tampón libre de calcio [Ca2 +] que contiene un quelante de [Ca2 +] (ácido etilendiamina tetraacético EDTA). En el segundo paso, el hígado de ratón es inundado con un tampón que contienen colagenasa para hidrolizar las interacciones de la matriz extracelular a celular. A diferencia del búfer utilizado en el paso uno, la presencia de iones [Ca2 +] en el búfer de la segunda etapa se requiere para la actividad de la colagenasa eficaz, después de que el hígado digerido tiene que ser más suavemente y mecánicamente separados usando fórceps entre el la cápsula hepática y tejido parenquimatoso. Finalmente, del tejido conectivo se elimina por filtración y posterior centrifugación separa hepatocitos viables de tanto células no parenquimatosas y hepatocito no vivo con el uso de densidad gradiente buffer40,41 ,42. En el presente estudio, nos muestran una técnica de perfusión de colagenasa modificado dos pasos para aislar hepatocitos primarios de un hígado de ratón para el análisis de la síntesis de proteínas.
El radiolabeling de proteínas es ampliamente utilizado para cuantificar los niveles de expresión, tasas de rotación y determinar la distribución biológica de las proteínas43 debido a la alta sensibilidad de detección de radiactividad44. Sin embargo, el uso de isótopos radiactivos requiere de circunstancias y procedimientos de investigación altamente controlada45. Métodos no radiactivos alternativos se han desarrollado y han adquirido cada vez más en popularidad. La reacción de la ligadura selectiva de quimio con un método de detección de la proteína Tetramethylrhodamine (TAMRA) es uno de ellos y se basa en la reacción quimio selectiva entre una azida y alquino grupos46, que pueden ser utilizadas para analizar eventos celulares tales como detección de síntesis de la proteína naciente y subclases de glicoproteínas modificadas con un grupo de azida. Para la síntesis de la proteína naciente, L-Azidohomoalanine (L-AHA, un aminoácido modificado de la azida) puede incorporar proteínas metabólicamente y detectado mediante el uso de método de detección de la proteína TAMRA47. Usando este ensayo en hepatocitos primarios de ratón, muestran que la tasa de síntesis de la proteína naciente está estrechamente ligada a la disponibilidad de ATP de mitocondrial y la activación de AMPK (figura 1).
En Resumen, utilización de hepatocitos primario de ratón es fundamental para investigar el metabolismo proteico y energético y cuantificación de la síntesis de la proteína naciente es valiosa para obtener información sobre el papel fisiológico de las vías pertinentes para el desarrollo y curación de enfermedades relacionadas con el hepatocito.

<table><tbody><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenglicol-bis(&beta;-aminoetiléter)-tetraacético</td><td>AmericanBio</td><td>AB00505-00025</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x) sin calcio, magnesio, rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de gradiente de densidad</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) glucosa baja, piruvato</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Hiclón</td><td></td> <td>de suero fetal bovinoSH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>1897141</td><td></td></tr><tr><td>Williams medio E, sin glutamina</td><td>Gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de dipéptido de L-alanil-L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa Tipo X</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-17864</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusión</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>IV set de administración</td><td>EXELINT</td><td>29081</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Un baño de agua</td><td>REVSCI</td><td>RS-PB-200</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Calentador de tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Lab, Inc</td><td>0-39613</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>PHOENIX</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Puntas de algodón</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de Petri TPP</td><td></td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Conector (Anillo de bloqueo Luer macho)</td><td>Instrumento Cole-Parmer</td><td>EW-4551807</td><td></td></tr><tr><td>Catéteres 24 G</td><td>TERUMO</td><td>Surflo 24Gx3/4'100</td><td></td></tr> <tr><td>&mu; m Filtro (FILTROS DE CELDAS)</td><td>VWR</td><td>10199-658</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de fondo cónico de 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de fondo cónico de 50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Reacción de ligadura quimioselectiva KIT DE DETECCIÓN PARA ANÁLISIS DE PROTEÍNAS, TAMRA ALKYNE</td><td>Invitrogen</td><td>C33370</td><td></td></tr><tr><td>AHA (L-azidohomoalanina)</td><td>Invitrogen</td><td>C10102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (sin metionina)</td><td>Gibco</td><td>21013024</td><td></td></tr><tr><td>diclorhidrato de L-cistina</td><td>SIGMA</td><td>C2526</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de muestra Laemmli</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>SIGMA</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>SDS solución (20%)</td><td>BioRad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (1M)</td><td>Americano Bioanalítica</td><td>AB14044-01000</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de fosfatasa</td><td>SIGMA</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Kit de medición de concentración de proteínas (Bovin Serum Albumin-BSA)</td><td>BioRad</td><td>500-0207</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de calor digital</td><td>VWR</td><td>12621-092</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Multi-Rotator</td><td>Grant-bio</td><td>PTR-60</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Sonicador ultrasónico</td><td>Cole-Parmer</td><td>GE130PB</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice estándar para alta resistencia</td><td>VWR</td><td>97043-566</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>A Escáner láser de modo variable</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>FLA 9500</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Reactivo de colorante Coomassie</td><td>Thermo Scientific</td><td>24594</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Equipo Olympus</td><td>CKX53</td><td>Western</td></tr><tr><td>Aparato de transferencia</td><td>BioRad</td><td>Equipo</td><td>1658004</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>Equipo BioRad</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>Sistema FluorChem R</td><td>proteinsimple-Equipment</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anticuerpo p-Ampka (T172)</td><td>Señalización celular</td><td>2535</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo AMPK total</td><td>Señalización celular</td><td>5832</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de albúmina</td><td>Señalización celular</td><td>4929</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo beta actina</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-130656</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas y pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo l-azidohomoalanine

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocitos son células parenquimatosas del hígado y realizar múltiples funciones metabólicas, incluyendo la síntesis y secreción de proteínas esenciales para la homeostasis de energía sistémica. Hepatocitos primarios aislados del hígado murino constituyen una valiosa herramienta biológica para comprender las propiedades funcionales o alteraciones que se producen en el hígado. Aquí describimos un método para el aislamiento y cultivo de hepatocitos primario de ratón mediante la realización de una técnica de perfusión de colagenasa de dos etapas y discutir su utilización para la investigación de metabolismo de la proteína. El hígado de un ratón adulto secuencialmente es inundado con ácido tetraacético de glicol de etileno bis (EGTA) y colagenasa, seguido por el aislamiento de hepatocitos con el tampón de gradiente de densidad. Estos hepatocitos aislados son viables en las placas de cultivo y mantienen la mayoría de características dotadas de hepatocitos. Estos hepatocitos pueden utilizarse para la evaluación del metabolismo de proteína incluyendo la síntesis de la proteína naciente con reactivos no radiactivo. Demostramos que los hepatocitos aislados son controlados fácilmente y forman una mayor estabilidad de la calidad y el volumen de la síntesis de proteínas vinculada al metabolismo energético mediante la utilización de la reacción de ligadura quimioterapia selectiva a una proteína Tetramethylrhodamine (TAMRA) método de detección y análisis Blot western. Por lo tanto, este método es valioso para la investigación de síntesis de la proteína naciente hepática relacionada con la homeostasis de la energía. El siguiente protocolo describe los materiales y métodos para la detección de la síntesis de la proteína naciente y el aislamiento de hepatocitos primario de alta calidad de ratón.

Aislamiento de hepatocitos primario de ratón da lugar a un rendimiento de aproximadamente 20 x 106 total células de ratón. Histológico, vivo y Unidos hepatocitos primarios aparecen poligonales o típica hexagonal en forma claramente descritos límite membranosa después de 24 h de incubación (figura 2).
Para confirmar si las células aisladas son hepatocitos primarios, se compararon los nivel...

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de hepatocitos primario de ratón sano y funcional. Para detectar la síntesis hepática de la proteína naciente por substrato etiquetado no radiactivo se instrucciones para ayudar a comprender los mecanismos subyacentes a la síntesis de proteínas en el marco de la homeostasis del metabolismo energético en el hígado.

Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en varios campos de investigación de enfermedades metabólicas sobre alteraciones moleculares de la energía hepática y la biosíntesis de proteínas en la obesidad, hígado graso no alcohólico, y tipo dos diabetes. Las principales ventajas de esta técnica son que facilita el aislamiento de hepatocitos primarios funcionales de ratón y la detección de proteínas nacientes hepáticas a través de un sustrato de etiquetado no radioactivo. La demostración visual de este método es crítica ya que el paso de perfusión es difícil de aprender debido a los vasos sanguíneos de ratón pequeños y delgados.Para la perfusión hepática, inserte cuidadosamente un catéter de calibre 24 en la Vena Cava Inferior o IVC justo en la bifurcación con la vena renal derecha. Retire la aguja del catéter manteniendo la posición de la cánula dentro de la CIV y conecte una cánula de calibre 24 con un tubo de perfusión utilizando el conector. Comience a perfundir el hígado con HBSS caliente menos a un flujo permanente de cuatro mililitros cortando rápidamente la vena esplénica para drenar la sangre interna.Después de 10 minutos, perfunda el hígado del ratón con 35 mililitros de HBSS más complementado con colágeno tipo X a un caudal de cuatro mililitros por minuto, sujetando la vena esplénica durante unos 10 segundos cada pocos minutos para facilitar la distribución del perfundido en todo el hígado. Cuando toda la colagenasa se ha perfundido, transferir el hígado a un tejido de laboratorio antes de detener la bomba para evitar el flujo de sangre en el hígado. Usa fórceps para extirpar la vesícula biliar y limpiar suavemente el hígado con un tejido de laboratorio fresco para extraer sangre.Coloque el hígado en un plato petri de 100 milímetros que contenga cinco mililitros de HBSS fresco y cálido, además de suplementado con colágenonasa y use fórceps de punta extraviada para eliminar suavemente la cápsula hepática. Utilice los fórceps para dispersar cuidadosamente el tejido parénquima y añadir 15 mililitros de DMEM frío a la placa Petri. Agitar el hígado desgarrado suavemente para liberar las células parénquimales residuales en el medio y añadir otros 15 mililitros de DMEM frío al plato para adquirir el resto de las células.Luego filtre la suspensión del tejido a través de un colador de células de 100 micras en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Para aislar los hepatocitos primarios del ratón, recoger las células por centrifugación y resuspend el pellet en 10 mililitros de DMEM fresco. Capa cuidadosamente las celdas sobre un búfer de gradiente de densidad 40% para la separación de gradiente de densidad, descartando las células de las capas superior y media después de la centrifugación.Resuspender el pellet de hepatocito parénquimal primario con dos a tres mililitros de William's Medium E para evitar recoger células muertas de la pared del tubo y transferir las células a un nuevo tubo de 50 mililitros. Mezcle las células con otros siete a ocho mililitros del medio E de William antes de la centrifugación y resusppend el pellet en 10, 20 o 30 mililitros de E media de William fresco dependiendo del tamaño del pellet. Después de contar, siembra seis veces 10 a las quintas células a cada pozo de un plato de seis pocillos para una incubación de dos a tres horas a 37 grados centígrados.Al final de la incubación, reemplace el medio con DMEM complementado con 10%Fetal Bovine Serum y anti-anti para eliminar las células muertas y no asociadas y devolver las células a la incubadora durante la noche. Para el etiquetado de proteína naciente modificado con azida, agregue de 20 a 40 microgramos de lisato celular a 50 microlitros de tampón de reacción 2X. Lleve el volumen a 80 microlitros con agua desionizada destilada y vórtice la solución proteica durante cinco segundos.Añadir cinco microlitros de sulfato de cobre a las células para otro vórtice de cinco segundos, seguido de cinco microlitros de aditivo de búfer de reacción uno con cinco segundos de vórtice. Después de una incubación de tres minutos, agregue 10 microlitros de aditivo de búfer de reacción reconstituido dos a las células para otro vórtice de cinco segundos y gire la muestra durante 20 minutos a cuatro grados centígrados en una máquina multi-rotador protegida de la luz. Al final de la rotación, añadir 300 microlitros de metanol al ésato, seguido de 75 microlitros de cloroformo, y 200 microlitros de agua destilada doble.Recoger la proteína etiquetada por centrifugación y añadir 250 microlitros de metanol fresco al pellet. Después del vórtice, centrifugar el izado de nuevo y cubrir el pellet desnudo con un tejido libre de pelusas durante 15 minutos a temperatura ambiente. Para el análisis PAGE, solubilite el pellet seco en 20 microlitros de tampón de carga sin beta-mercaptoetanol y vórtice el pellet durante 10 minutos.A continuación, calentar la proteína en un bloque de calor de 70 grados Celsius durante 10 minutos y cargar la muestra en un 10%gel de sulfato de dodecil sódico para la detección de tetrametilrhodamina. A continuación, utilice un escáner láser de modo variable para la cuantificación precisa de las proteínas nacientes etiquetadas por AHA. Histológicamente, los hepatocitos primarios vivos y adjuntos aparecen típicamente poligonales o hexagonales en forma con un límite membranoso claramente esbozado después de 24 horas de cultivo.Para confirmar si las células aisladas son hepatocitos primarios, en este experimento, se compararon los niveles de expresión de proteína de albúmina en fibroblastos embrionarios de ratón, una línea celular de hepatoma de ratón, hepatocitos primarios aislados de ratón y hígados de ratón. La expresión de la proteína albúmina se detectó en hepatocitos primarios de ratón e hígados de ratón, pero no era detectable ni en fibroblastos embrionarios de ratón ni en células de línea celulares de hepatoma. El tratamiento primario de hepatocitos con 10 rotenona micromolar durante cuatro a seis horas reveló una inducción robusta de la proteína quinasa activada por AMP hepático, tal como se detectó mediante el aumento de los niveles de fosforilación en la proteína quinasa T172 activada por AMP hepático similar a las observadas in vivo.De hecho, cinco horas de tratamiento con 10 micromolares de rotenona tuvieron profundos efectos inhibitorios sobre la síntesis de proteínas nacientes en hepatocitos primarios tratados en comparación con las células de control no tratadas, como lo demuestra un ensayo de reacción de ligadura quimioselectiva. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar todos los reactivos y medios necesarios con antelación. Esta técnica allanó el camino para que el investigador en el campo de la fisiopatología metabólica hepática explorara el mecanismo molecular de la regulación de proteínas energéticas en la obesidad y la diabetes tipo dos en el hepatocito primario aislado de ratón.

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Investigación

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De la lipogénesis de novo y la oxidación de ácidos grasos β-constituyen vías metabólicas claves en los hepatocitos, las vías que son perturbados en varios trastornos metabólicos, incluyendo la enfermedad de hígado graso. Aquí se demuestra el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón y describimos cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β-y la lipogénesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Aquí, se describen métodos optimizados para generar modelos in vivo e in vitro de esteatosis hepática y para analizar los fenotipos esteatóticos y los parámetros fisiológicos relacionados.

Análisis optimizada de<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; La esteatosis hepática

El objetivo de este protocolo es obtener alta viabilidad y alto rendimiento de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado. Esto se logra por perfundiendo el hígado con una solución de colagenasa tipo IV a través de la vena porta, seguida de centrifugación diferencial para obtener hepatocitos y células endoteliales sinusoidales.

Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. Este es un modelo valioso para probar nuevos tratamientos para la hipercolesterolemia.

Un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar con hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento de hepatocitos de ratón de hígados de ratón adultos utilizando una técnica de perfusión de colagenasa modificada. También se describe el cultivo a largo plazo de hepatocitos en un ajuste de sándwich de colágeno 3D, así como la inmunoetiquetado de los componentes citoesqueléticos para estudiar la formación canalicular biliar y su respuesta al tratamiento.

Aislamiento y cultivo de sándwich de colágeno 3D de hepatocitos primarios de ratón para estudiar el papel del citoesqueleto en la formación canalicular de bilis en Vitro

Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.

Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica esencial responsable de generar energía en muchos tipos de células diferentes, incluidos los hepatocitos. Aquí, describimos un método para medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios recién aislados utilizando ácido palmítico marcado con 14C.

Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Este protocolo describe cómo realizar el marcado de proteínas específicas del tipo celular con azidonorleucina (ANL) utilizando una línea de ratón que expresa una sintetasa de ARNt de L274G-Metionina mutante (MetRS*) y los pasos necesarios para el aislamiento de proteínas específicas de tipo celular marcadas. Describimos dos posibles vías de administración de ANL en ratones vivos mediante (1) agua potable y (2) inyecciones intraperitoneales.

Purificación e identificación de proteínas específicas de tipo celular a partir de tejidos complejos utilizando una línea de ratón de ARNt sintetasa de metionina mutante

Aprenda a aislar hepatocitos primarios de ratón funcionales mediante perfusión hepática con catéter de 24G y detectar proteínas nacientes usando marcaje no radiactivo con L-azidohomoalanina. Este protocolo facilita el estudio del metabolismo energético hepático en enfermedades metabólicas como obesidad y diabetes tipo 2.

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Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

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