Name: Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprende a implantar una ventana de vidrio en la médula espinal de ratón para microscopía intravital. Este método permite visualizar dinámicas proteicas en el sistema nervioso central intacto, con estabilidad de movimiento y tiempos quirúrgicos breves.

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S.E. Lutz cuenta con el apoyo del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, los Institutos Nacionales de Salud, bajo los fondos de inicio de Grant KL2TR002002 y University of Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford es compatible con RO1 MH084874. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH. Los autores agradecen a Dritan Agalliu en el Departamento de Neurología del Centro Médico de la Universidad de Columbia por los ratones Tg eGFP:Claudin-5, discusiones científicas e ideas sobre el desarrollo del protocolo quirúrgico y las aplicaciones de imagen. Los autores agradecen a Sunil P. Gandhi en el Departamento de Neurobiología y Comportamiento de la Universidad de California, Irvine por diseñar el primer prototipo del aparato estereotáctico y controlador de temperatura animal, la discusión del protocolo quirúrgico, y formación en microscopía de dos fotones. Los autores también agradecen a Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) por su ayuda en la personalización del estereomicroscopio quirúrgico, y a Ron Lipinski (Whale Manufacturing) por el mecanizado de piezas estereotácticas.

Todos los experimentos siguen los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois, Chicago. Este es un procedimiento terminal.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Preparar el líquido cefalorraquídeo cerebral artificial (aCSF) para que contenga 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glucosa, 10 mM de HEPES, 2 mM MgCl2s6H2O, 2 mM de CaCl2x 2HendDH2O. Filtro estéril y congelar en alícuotas de uso individual. Caliente el aCSF en un baño de agua a 39 oC antes de su uso.</li>
	<li>Agarosa cálida de bajo punto de fusión (2%) en aCSF hasta que se disuelva completamente en un baño de agua ajustado a 65 oC. Durante la laminectomía, enfríe la alícuota de agarosa derretida a 39 oC en un baño de agua, para que pueda estar lista cerca de la temperatura fisiológica para el paso 5.2. Nota: La solución de agarosa se puede almacenar a -20 oC en alícuotas de un solo uso.</li>
	<li>Preparar 50 mg/ml de carprofeno estéril en agua bacteriostática. Conservar a 4oC.</li>
	<li>Limpie los anteojos con 70% de etanol, tres lavados de ddH2O y guárdelos secos en un recipiente libre de polvo.</li>
</ol>2. Impresión 3D de placa posterior
<ol><li>El software CAD 3D de uso se utiliza para crear un modelo a las dimensiones que se muestran en la Figura 1. El interior es una elipse más ancha en la superficie inferior con respecto a la impresora y cortada con un corte recubierto a una elipse más pequeña formando un lumen en la superficie opuesta. Dos brazos de proyección con orificios para aceptar tornillos se extienden lateralmente, para la fijación a la horquilla de sujeción de la placa posterior. A partir de esta estructura 3D, cree un archivo de malla 3D triangulado (. STL). Nota: Vea la figura 1B-u2012D y los archivos suplementarios 1 y 2.</li>
	<li>Cargue el archivo de malla 3D triangulado en una impresora 3D.</li>
	<li>Imprima placas posteriores utilizando una boquilla de extremo caliente de 0,4 mm y una altura de capa de 0,2 mm. Seleccione la temperatura de la boquilla de 205 oC, la temperatura de la cama de 45 oC y la velocidad de impresión de 45 mm/s.</li>
	<li>Evaluar visualmente las placas posteriores impresas en 3D resultantes para la integridad estructural(Figura 1E); fallo estructural bruto (ausente lumen, pared colapsada) indica defectos de impresión(Figura 1F).</li>
</ol>3. Preparación quirúrgica
<ol><li>Precalienta la almohadilla de calentamiento.</li>
	<li>Cargue el isoflurano en la jeringa de entrega mientras trabaja en una campana de humo sordo químico. Coloque la jeringa de administración en la unidad de isoflurano.</li>
	<li>Seleccione un ratón de 8 u201212 semanas. Pesa el animal. Inducir la anestesia usando 2% de isoflurano en una cámara de inducción. Inyectar carprofeno a 5 mg/kg por vía subcutánea.</li>
	<li>Coloque el cono nasal y entregue isoflurano al 2% con un caudal de 150 ml/min para el mantenimiento de un plano quirúrgico de anestesia(Figura 2A.u2012E). Envuelva la almohadilla de calentamiento con una almohadilla absorbente desechable para facilitar la limpieza.</li>
	<li>Coloque un animal en la almohadilla de calentamiento en la estación quirúrgica e instale el cono nasal. Lubricar el termómetro con vaselina e insertarlo 5 mm en el recto. Pegue la sonda del termómetro a la cola para la estabilidad. Aplique pomada oftálmica a los ojos del ratón.</li>
	<li>Para mantener la hidratación, aplique 200 ml de solución de Ringer lactada por inyección subcutánea cada 30 minutos hasta la terminación del experimento.</li>
	<li>Rocíe el dorso con 70% de etanol, retire el pelaje con cortadoras y limpie el sitio con povidona-yodo.</li>
</ol>4. Laminectomía
<ol><li>Coloque el animal entre las barras de los oídos; estos mantienen la posición de la cabeza del ratón con respecto al cono nasal.</li>
	<li>Confirme que el animal está profundamente anestesiado según lo evaluado por la falta de reflejo de pellizco interdigital y patrón respiratorio constante.</li>
	<li>Hacer una incisión rostral-caudal de 1,5 cm en la línea media sobre la región torácica/lumbar superior inferior usando #11 cuchilla(Figura 2). Separa la piel agarrándola con fórceps dentados contundentes y/o dedos enguantados. Use fórceps para separar y pelar cualquier tejido conectivo transparente restante debajo de la piel. La musculatura superficial ahora debe ser expuesta; desplazar esto con una lanza quirúrgica de espuma.</li>
	<li>Utilice lanzas quirúrgicas de espuma (o una cureta) para eliminar la musculatura más profunda y restante de la vértebra diana (torácica 12). Para crear un asiento para la placa posterior, también despeje el músculo del aspecto posterior del torácico 11, y el aspecto anterior del torácico 13. Controle cualquier sangrado aplicando una presión suave con una lanza quirúrgica o use un pulso mínimo con una pistola de cauterización. Continúe retirando el músculo restante de los tendones usando fórceps</li>
	<li>Una vez que se retiran los músculos, separa cuidadosamente los tendones cortando con fórceps. Debe haber mucho espacio para visualizar y manipular el cable cuando este paso se haya completado. Compruebe que la duración del espacio intervertebral, el hueso laminar semitransparente, el vaso sanguíneo superficial central debajo del hueso y la arteria radiante anterior son ahora claramente visibles.</li>
	<li>Humedezca la región con aCSF caliente. Utilice el microrretaparacropara adelgazar repetitivamente el hueso laminar utilizando trazos rectos paralelos al eje largo de la médula espinal(Figura 2, Figura 3). Si lo desea, utilice una etapa de deslizamiento para girar la plataforma quirúrgica para una mayor comodidad ergonómica (por ejemplo, un operador diestro puede girar la plataforma quirúrgica en sentido antihorario para el paso de perforación). Nota: La etapa de deslizamiento utilizada está construida con una placa de aluminio superior que se desliza de 15 mm con respecto a la placa base fija.</li>
	<li>Agarre suavemente el proceso espinoso superficial con fórceps y levante la vértebra; el hueso debe levantarse fácilmente. Si hay resistencia, repita el adelgazamiento del hueso con el taladro y, si es necesario, utilice tijeras de iris, teniendo cuidado de apuntar las puntas de las tijeras hacia arriba para evitar dañar el tejido. Nota: Para mantener la dura intacta, es esencial no tirón del hueso.</li>
	<li>Usa #4 fórceps para eliminar cualquier fragmento óseo. Use una lanza quirúrgica para aplicar una presión constante suave para controlar cualquier sangrado. Enjuague el tejido con aCSF caliente. No permita que el tejido se seque.</li>
</ol>5. Implantación de vidrio de cubierta
<ol><li>Aplique suavemente un vidrio de cubierta de borosilicato de 3 mm en el cable expuesto.</li>
	<li>Asegúrese de que la agarosa se enfríe a 39 oC. Usando una pequeña espátula, aplica un 2% caliente de agarosa/aCSF en el borde de la cubierta de vidrio y permite que la acción capilar la dibuje debajo de la superficie. Nota: A temperaturas por debajo de 39 oC, la agarosa puede comenzar a gelificarse. Si esto ocurre, vuelva a calentar con un baño de agua o un microondas. Algunos operadores prefieren aplicar primero una gota de agarosa y poner el vidrio de la cubierta en la parte superior.</li>
	<li>Aplicar adhesivo tisular a los procesos articulares óseos expuestos de la vértebra adyacente intacta a nivel torácico 11 espina vertebral y columna vertebral de nivel torácico 13. Aplique adhesivo de tejido adicional en un anillo alrededor del sitio de la laminectomía, sobre el tendón adyacente y el proceso transversal. Nota: Se requiere adhesivo tisular para la correcta adherencia del cemento dental en los pasos posteriores. Los procesos articulares forman un asiento natural sobre el cual la placa posterior puede descansar de forma estable(Figura 3). La adhesión a los procesos articulares formará los puntos más fuertes de unión.</li>
	<li>Mezclar cemento dental con acelerador en una bandeja de mezcla de porcelana. Utilice una pequeña espátula para transferir cemento dental a la capa adhesiva de tejido. Utilice cemento dental para adherir la placa posterior al campo quirúrgico, centrado sobre la ventana. Espere 10 minutos para que el cemento dental se cure. Nota: La adhesión firme de la placa posterior a los procesos articulares anteriores y posteriores proporciona la estabilidad estructural fundamental del implante.</li>
	<li>Utilice cemento dental adicional para rellenar la base interior de la placa posterior, y la parte inferior de la placa posterior: interfaz de tejido. Nota: La aplicación adicional de cemento dental mejora la adherencia y reduce el riesgo de fuga del fluido de inmersión objetivo del microscopio (salina) en la parte inferior de la placa posterior.</li>
	<li>Avance el soporte de la placa posterior bifurcada a la posición adecuada sobre la ventana. Fije la placa posterior en el soporte de la placa posterior con tornillos. Nota: Este protocolo utilizaba un soporte de placa posterior mecanizado a medida(Figura 2G.u2012H).</li>
	<li>Aplique salina a la placa posterior para comprobar si hay fugas. Si hay fugas de líquido, seque el área y aplique más cemento dental.</li>
</ol>6. Preparación de imágenes
<ol><li>Transfiera el animal de la plataforma quirúrgica a la mesa óptica. Nota: Nuestra plataforma quirúrgica, soporte de placa posterior, y soporte de nariz-cono de isoflurano se pueden transportar entre estaciones de imágenes quirúrgicas y de dos fotones como una unidad, mientras se aplica anestesia isoflurano continua(Figura 2D,H). Unidades similares se pueden ensamblar a partir de horquillas de sujeción, vigas y postes de pilares de apoyo que se pueden obtener de fuentes comerciales(por ejemplo,. ThorLabs). Para la microscopía intravital, debe haber al menos 11 pulgadas de espacio libre entre el objetivo del microscopio y la mesa óptica para acomodar la altura de la plataforma quirúrgica.</li>
	<li>Fije la plataforma quirúrgica a la mesa óptica utilizando un poste de montaje de acero inoxidable y una horquilla de sujeción contraborde.</li>
	<li>Aplique salina fresca en el pozo de la placa posterior. Baje una lente de inmersión en agua en el pozo.</li>
	<li>Utilice la luz transmitida o epifluorescencia para identificar el área de interés y enfoque. Cambie al modo de escaneo láser y realice imágenes in vivo de acuerdo con la longitud de onda de excitación láser de dos fotones adecuada, dicroics y filtros de paso de banda para los fluoróforos presentes en el tejido6.</li>
</ol>

<ol><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li>
<li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826(2013).</li>
<li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081(2013).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li>
<li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li>
<li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration%2C+but+Not+Tight+Junction+Remodeling%2C+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li>
<li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li>
<li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-0381-8_2">Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue</a>. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li>
<li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li>
<li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito aquí permite imágenes estables de la médula espinal en ratones a través de una ventana de vidrio. Este método se ha aplicado para evaluar la remodelación de BBB en ratones transgénicos eGFP:Claudin5+/- que expresan una proteína fluorescente de unión estrecha BBB, pero podría aplicarse igualmente bien para estudios de cualquier proteína fluorescente o células en la médula espinal.
Se han desarrollado múltiples métodos para la laminectomía y estabilización de la médula espinal...

Los modelos animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes, cuando se combinan con la microscopía intravital, proporcionan una potente plataforma para abordar la biología y la fisiopatología. Para aplicar estas técnicas a la médula espinal, se requieren protocolos especializados para preparar la médula espinal para la toma de imágenes. Una de esas estrategias es llevar a cabo una laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal. Las características clave de un protocolo de laminectomía ideal para la microscopía incluyen la preservación de la estructura y función del tejido nativo, la estabilidad del campo de la imagen, el tiempo de procesamiento rápido y la reproducibilidad de los resultados. Un desafío particular es estabilizar el campo de imagen contra el movimiento inducido por la respiración y los latidos del corazón. Múltiples estrategias ex vivo e in vivo han sido reportadas para alcanzar estos objetivos1,2,3,4,5. La mayoría de los métodos in vivo implican sujetar los lados de la columna vertebral2,4 y a menudo es seguido por la implantación de un aparato metálico rígido3,4 para la estabilidad durante la cirugía y aplicaciones de imágenes posteriores. Sujetar la columna vertebral puede comprometer potencialmente el flujo sanguíneo e inducir la remodelación de proteínas de barrera hematoencefálica (BBB).
El propósito de este método es hacer que la médula espinal intacta esté disponible para imágenes ópticas en el ratón vivo, minimizando al mismo tiempo la invasividad del protocolo y mejorando los resultados. Describimos una sola laminectomía y un procedimiento de implantación de vidrio de cubierta combinado con una placa posterior impresa en 3D de plástico ovalada mínimamente invasiva que todavía logra una estabilidad mecánica robusta. La placa posterior se adhiere directamente a las espinas vertebrales anteriores y posteriores con cemento dental. La placa posterior está equipada con brazos de extensión lateral con orificios de tornillo que se fijan rígidamente a la etapa del microscopio a través de un brazo metálico. Esto ancla eficazmente la vértebra anterior y posterior intacta a la etapa del microscopio, proporcionando resistencia mecánica al artefacto de movimiento que de otro modo sería introducido por la respiración y los latidos del corazón. El método ha sido optimizado para la laminectomía de una sola vértebra a nivel torácico 12, omitiendo las abrazaderas utilizadas en estrategias alternativas de estabilidad durante la imagen in vivo. El procedimiento es rápido, tardando aproximadamente 30 minutos por ratón.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de la enfermedad de la BBB. El BBB es un sistema microvascular dinámico compuesto por células endoteliales, músculo liso vascular, pericitos y procesos de pie astrocito que proporcionan un ambiente altamente selectivo para el sistema nervioso central (SNC). Los datos representativos describen la aplicación de este protocolo en ratones transgénicos diseñados para expresar proteína fluorescente verde mejorada (eGFP):Claudin-5, una proteína de unión estrecha BBB. Los archivos de impresión de placa posterior proporcionados también se pueden personalizar para aplicaciones alternativas.

<table><tbody><tr><td>Impresora 3D</td><td>Raise3D</td><td>Pro2</td><td>Para la impresión de placas traseras</td></tr><tr><td>PLA Filamento de impresión 3D</td><td>Interior</td><td>PLA+-175-B</td><td>Material de impresión 3D de plástico negro</td></tr><tr><td>Software CAD 3D Software</td><td>Dassault Systèmes</td><td>Solidworks</td><td>utilizado para diseñar formas 3D</td></tr><tr><td>Software de impresora 3D</td><td>Raise3D</td><td>Software Ideamaker</td><td>utilizado para interactuar con la impresora 3D</td></tr><tr><td>Placa posterior ovalada impresa en 3D</td><td>personalizada</td><td></td><td>Estabilización del campo de imagen</td></tr><tr><td>Microscopio de disección quirúrgica</td><td>Leica</td><td>M205 C</td><td>Equipado con Leica FusionOptics, objetivo de la serie M Planapo 0.63x y platina deslizante</td></tr><tr><td>Cámara microscópica</td><td>Leica</td><td>MC170</td><td>HD Cámara en color para visualizar el campo quirúrgico</td></tr><tr><td>Platina deslizante</td><td>Leica</td><td>10446301</td><td>La etapa de deslizamiento está construida con dos placas metálicas. La placa base es fija. La placa superior se desliza sobre una interfaz engrasada para permitir el movimiento giratorio y lineal.</td></tr><tr><td>Estación quirúrgica y horquilla de estabilización</td><td>Whale Manufactoring</td><td>laminectomía</td><td>personalizada</td></tr><tr><td>Unidad de administración de isoflurano de bajo flujo SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01 Administración de</td><td>anestesia quirúrgica con vaporizador digital integrado</td></tr><tr><td>Poste de montaje de acero inoxidable de 1,5 pulgadas</td><td>ThorLabs</td><td>P50/M</td><td>Para el montaje de la estación quirúrgica en una mesa óptica para la obtención de imágenes</td></tr> <tr><td>de dos fotonesHorquilla de apriete avellanada para montaje de 1,5" Post</td><td>ThorLabs</td><td>PF175</td><td>Para estabilizar el montaje de la estación quirúrgica en la mesa óptica para la obtención de imágenes de dos fotones</td></tr><tr><td>Microtaladro óseo ideal</td><td>Aparato Harvard</td><td>72-6065</td><td>Adelgazamiento de hueso para laminectomía</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td>Solución salina de calentamiento</td></tr><tr><td>Pistola de cauterización</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>Cauterización menor Calentador</td></tr><tr><td></td><td>Benchmark</td><td>BF11222</td> de <td>silicona de 1.9" x 4.5" con 20" Cables de teflón, 10 W, 5 V</td></tr><tr><td>Sonda rectal termoacoplada tipo K</td><td>Physitemp</td><td>RET3</td><td>Medición de la temperatura corporal del ratón</td></tr><tr><td>vaselina</td><td>Sigma</td><td>8009-03-8</td><td>Sonda rectal lubricante</td></tr><tr><td>Controlador térmico regulado por retroalimentación</td><td>NA personalizado</td><td></td><td>Las alternativas disponibles en el mercado incluyen la serie Physitemp TCAT</td></tr><tr><td>PVA Lanza ocular quirúrgica</td><td>Beaver-visitec internacional</td><td>40400-8</td><td>Absorbente de sangre</td></tr><tr><td>Recortadora eléctrica</td><td>Wahl</td><td>41590-0438</td><td>Recorte de piel de ratón</td></tr><tr><td>Cuchilla, #11</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Herramienta quirúrgica</td></tr><tr><td>Pinzas, #5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Herramienta quirúrgica</td></tr><tr><td>Pinzas, #4</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Herramienta quirúrgica</td></tr><tr><td>Pinzas dentadas de titatnium</td><td>WPI</td><td>555047FT</td><td>Herramienta quirúrgica</td></tr><tr><td>Tijeras de iris de titanio</td><td>WPI</td><td>555562S</td><td>Herramienta quirúrgica</td></tr><tr><td>Vetbond adhesivo para tejidos</td><td>3M</td><td>084-1469SB Preparación de</td><td>la superficie del tejido para acrílico dental</td></tr><tr><td>Bandeja mezcladora de cerámica</td><td>Jack Richeson</td><td>420716</td><td>Mezcla de agente acrílico dental con acelerante</td></tr><tr><td>Acrílico dental Orthojet</td><td>Lang Dental</td><td>1520BLK, 1503BLK</td><td>Adhesión permanente de la placa posterior al tejido</td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos pequeños, #1 de grosor, 3 mm</td><td>Aparato Harvard</td><td>64-0720</td><td>ventana óptica</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>KCl Fisher</td><td>Scientific</td><td>7447-40-7</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-99-7</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>MgCl2& punto medio; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td>para aCSF</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>Para aCSF</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Rimadyl</td><td>QM01AE91</td><td>Analgesia</td></tr><tr><td>Agua bacteriostática</td><td>Henry Schein</td><td>2587428</td><td>Diluyente para carprofeno</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Solución ringer lactada</td><td>Baxter</td><td>0338-0117-04</td><td>Hidratación para ratón</td></tr><tr><td>Agarosa High EEO</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>punto de gel 34-37 grados C</td></tr><tr><td>Pomada lubricante oftálmica</td><td>Akwa Tears</td><td>68788-0697</td><td>Prevenir la sequedad de la córnea</td></tr><tr><td>MOM Microscopio de dos fotones</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Este protocolo describe un método para la laminectomía de la médula espinal y la implantación de ventanas de vidrio para la toma de imágenes in vivo de la médula espinal del ratón. Un vaporizador digital integrado se utiliza para lograr un plano estable de anestesia a una velocidad de bajo flujo de isoflurano. Se retira una sola columna vertebral, y se superpone un vidrio de cubierta disponible comercialmente en un lecho de agarosa delgada. A continuación, se fija una placa posterior de plástico impresa en 3D a las espinas vertebrales adyacentes utilizando adhesivo tisular y cemento dental. Se utiliza una plataforma de estabilización para reducir el artefacto de movimiento de la respiración y los latidos del corazón. Este método rápido y libre de abrazaderas es adecuado para la microscopía aguda de fluorescencia multifotón. Se incluyen datos representativos para la aplicación de esta técnica a la microscopía de dos fotones de la vasculatura de la médula espinal en ratones transgénicos que expresan eGFP:Claudin-5 — una proteína de unión apretada.

Las ventanas de vidrio implantadas y la microscopía intravital de dos fotones proporcionan una herramienta útil para evaluar los cambios dinámicos en las proteínas del SNC. La integridad funcional del BBB está influenciada por la expresión, la localización subcelular y las tasas de rotación de proteínas de uniónestrecha7. Estudios anteriores han demostrado que las proteínas de unión estrecha sufren una remodelación rápida y dinámica en estado estacionario<sup class...

Este protocolo describe la implantación de una ventana de vidrio en la médula espinal de un ratón para facilitar la visualización mediante microscopía intravital.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Este método permite el examen de la dinámica de proteínas in vivo dentro del sistema nervioso central intacto para abordar preguntas en neurociencia e inmunología. Las principales ventajas de este procedimiento son una excelente estabilidad de movimiento para la adquisición de imágenes, un breve tiempo quirúrgico, una exposición reducida del operador a la anestesia gaseosa y placas traseras personalizables de bajo costo. La demostración visual de este método es crítica, ya que es difícil extraer el hueso sin dañar el tejido del sistema nervioso estrechamente subyacente durante las etapas de laminectomía del procedimiento.Antes de comenzar el procedimiento, utilice el software de diseño asistido por ordenador 3D para crear un modelo según las dimensiones indicadas. Así que tenemos un objeto, que es el objeto tridimensional, que es con lo que podemos empezar. Lo que puedo hacer entonces es poner ajustes en eso para la versión de impresión.Así que si abro Editar esto, vaya a Avanzado, abra una ventana que me permita ver todos estos ajustes. Ajuste la temperatura de la boquilla a 205 grados Celsius, la temperatura de la cama a 45 grados Celsius y la velocidad de impresión a 45 milímetros por segundo en una impresora 3D. Utilice una boquilla caliente de 0,4 milímetros y una capa de 0,2 milímetros de altura para imprimir las placas posteriores.A continuación, evalúe visualmente las placas posteriores impresas para comprobar su integridad estructural. Las fallas estructurales brutas indican defectos de impresión. Cuando las placas traseras estén listas, coloque la cabeza de un ratón anestesiado de ocho a 12 semanas de edad sobre una almohadilla de calor entre las barras de los oídos de un retén quirúrgico y aplique un ung ón en los ojos del animal.Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, utilice una cuchilla número 11 para hacer una incisión de línea media rostral a caudal de 1,5 centímetros sobre la región lumbar superior torácica inferior y separe la piel del peritoneo. Use fórceps para pelar cualquier tejido conectivo transparente restante debajo de la piel para exponer la musculatura superficial. Desplazar los músculos con una lanza quirúrgica de espuma junto con el músculo más profundo restante de la vértebra objetivo.Para crear un asiento para la placa posterior, borre el músculo del aspecto posterior del torácico 11 y el aspecto anterior del torácico 13. Usar fórceps para eliminar el músculo restante de los tendones según sea necesario. Cuando se haya eliminado todo el músculo, corte cuidadosamente los tendones con fórceps hasta que se logre suficiente espacio para visualizar y manipular la médula espinal.Confirme que la duramadre del espacio intervertebral, el hueso laminar semitransparente, el vaso sanguíneo superficial central debajo del hueso y la arteria radiante anterior son claramente visibles. Humedezca la región con líquido cefalorraquídeo artificial cálido y utilice un micro-perforador para adelgazar el hueso laminar usando trazos rectos paralelos al eje largo de la médula espinal. Agarrando suavemente el proceso espinoso superficial con fórceps, levante la vértebra.El hueso debe levantarse fácilmente. Utilice fórceps número cuatro para eliminar cualquier fragmento óseo, controlando cualquier sangrado con una lanza quirúrgica y una presión constante suave según sea necesario. A continuación, enjuague el tejido con líquido cefalorraquídeo artificial caliente.Para la implantación de vidrio de cubierta, aplique suavemente un vidrio de cubierta de borosilicato de tres milímetros al cordón expuesto. Utilice una pequeña espátula para aplicar 39 grados Celsius calentado 2%agarose al borde del vidrio y permitir la acción capilar para dibujar la agarosa debajo de la superficie de vidrio de la cubierta. Aplique adhesivo tisular en los procesos articulares óseos expuestos de la vértebra adyacente intacta en las espinas vertebrales de nivel torácico 11 y 13.Aplique adhesivo de tejido adicional en un anillo alrededor del sitio de laminectomía sobre el tendón adyacente y el proceso transversal. A continuación, utilice una nueva espátula para aplicar cemento dental mezclado con acelerador en la capa adhesiva de tejido y coloque una placa posterior en el campo quirúrgico centrado sobre la ventana de vidrio de la cubierta. La aplicación de múltiples capas delgadas de cemento dental da como resultado una adhesión más fuerte de la placa posterior, pero asegúrese de colocar la placa posterior rápidamente antes de que el cemento dental comience a secarse.Después de permitir que el cemento dental se cure durante 10 minutos, rellene la base interior y la parte inferior del lugar posterior con adhesivo adicional. La aplicación del cemento dental en capas delgadas puede ayudar a reducir el riesgo de que el cemento se propague al vidrio de la cubierta y a la agarosa, lo que puede comprometer todo el protocolo. Cuando el cemento dental se haya secado, aplique un soporte de placa posterior bifurcado a la posición adecuada sobre la ventana y atornille la placa posterior en el soporte de la placa posterior.A continuación, aplique solución salina en la placa posterior para comprobar si hay fugas. El animal y la plataforma quirúrgica se pueden transferir a la mesa óptica de un microscopio de dos fotones para obtener imágenes a través de la ventana de cristal de la cubierta. En este experimento representativo, la claudina-5 positiva EGFP se visualizó dentro de las uniones estrechas con etiqueta fluorescente a lo largo de un plexo vascular.La delineación clara de las estructuras de unión estrecha en la proyección Z indica que se produce un desplazamiento mínimo de la imagen XY después de una laminectomía exitosa, la colocación de la ventana y la implantación de la placa posterior. Al intentar este procedimiento es importante recordar que esta microcirugía es difícil y puede tomar tiempo para dominar. Sin embargo, una vez dominada, esta cirugía se puede realizar en aproximadamente 30 minutos.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de dos fotones y las imágenes in vivo, para responder preguntas adicionales sobre la remodelación neurovascular y otros procesos de la enfermedad que involucran la médula espinal.

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Un protocolo de mínima invasión para estabilizar la columna espinal de ratón y realizar...

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

El trasplante de células madre neurales (NSC) en la médula espinal de ratones con desmielinización establecido se detalla. La preparación de los comités directivos nacionales, la laminectomía de vértebra torácica 9 (T9), y el trasplante de NSCs se perfila, junto con la atención pre y post-operatorio de los ratones.

El trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico Hepatitis Ratón

Este video presenta un procedimiento quirúrgico para implantar una ventana craneal en un modelo de ratón para un acceso óptico estable a diferentes regiones del cerebro.

Implantación de una ventana de imagen craneal en un modelo de ratón: un procedimiento quirúrgico para implantar cubreobjetos a base de vidrio para un acceso óptico estable a regiones del cerebro murino

Este video muestra el registro de la actividad neuronal del cerebro a través de una ventana óptica en ratones transgénicos. Los ratones expresan una proteína fluorescente que permite la detección de actividades neuronales. Se extrae cuidadosamente una pequeña porción del cráneo para instalar una ventana óptica, y luego se cubre el cráneo con cemento negro para bloquear la luz antes de la obtención de imágenes.

Instalación de ventanas ópticas en el cerebro de ratones transgénicos para visualizar actividades neuronales

Fuente: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomía e implantación de ventana de la médula espinal en el ratón. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la implantación de una ventana de la médula espinal en un ratón anestesiado para imágenes in vivo. El protocolo estabiliza la médula espinal expuesta utilizando una cubierta de vidrio de borosilicato y una placa posterior impresa en 3D. Este método permite la microscopía de dos fotones de alta resolución para estudiar la dinámica de la barrera...

Implantación de ventana de la médula espinal en un ratón para imágenes in vivo

Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Describimos un método para implantar y mantener ventanas de vidrio sobre la médula espinal expuesta de ratones adultos para estudiar la encefalomielitis autoinmune experimental. Estas ventanas proporcionan acceso óptico crónico a la médula espinal para monitorear la dinámica celular a nivel subcelular en animales vivos utilizando microscopía de dos fotones.

Implante de ventanas de vidrio de la médula espinal en ratones adultos con encefalomielitis autoinmune experimental

Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.

Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal

En este vídeo, se describe un procedimiento para la implantación de una cámara de imagen óptica crónica sobre la dorsal de la médula espinal de un ratón vivo. La cámara, procedimiento quirúrgico, y la imagen crónica son revisados ​​y demostraron.

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal En Vivo Imágenes de la médula espinal de ratón

Este protocolo describe cómo crear una laminectomía precisa para la inducción de lesiones medulares estables de tipo transección en el modelo de ratón, con un daño colateral mínimo para la investigación de lesiones de la médula espinal.

Inducción de lesiones completas de la médula espinal de tipo transección en ratones

El presente protocolo describe el desarrollo de un modelo murino reproducible de glioma de médula espinal mediante la inyección de células tumorales en el espacio intervertebral, ofreciendo un enfoque más eficaz y menos invasivo para la investigación y el desarrollo terapéutico.

Trasplante quirúrgico de células tumorales en la médula espinal de ratones

Aprende a implantar una ventana de vidrio en la médula espinal de ratón para microscopía intravital. Este método permite visualizar dinámicas proteicas en el sistema nervioso central intacto, con estabilidad de movimiento y tiempos quirúrgicos breves.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

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