Detección de 3-nitrotirosina en ambientes atmosféricos a través de un alto rendimiento sistema Detector electroquímico en cromatografía líquida
30 de enero de 2019
Se presenta un método para la detección de 3-nitrotirosina modificaciones químicas de las proteínas atmosféricas con 6 rondas de mm de diámetro de prefiltros de muestreador de aire utilizando un detector electroquímico de cromatografía de líquido de alto rendimiento (HPLC-ECD).
Este método puede ayudar a responder a la pregunta clave en la investigación ambiental sobre Nitrapyrin y 3-nitrotirosina. La principal ventaja de esta técnica es que es un método único y altamente sensible para detectar 3-nitrotirosina en filtros de muestra de aire. Para recoger partículas suspendidas totales o partículas de menos de siete micras de tamaño, primero pese un filtro de cuarzo aglutinante de 3 y fíjelo en un tomamuestras de aire de alto volumen. Cubra el filtro con un selector de tamaño de partícula para recoger PM7 o deje el filtro sin tapar para recoger el total de partículas suspendidas. Ejecute el tomamuestras de aire a 1000 litros por minuto de forma continua durante siete días. Cargue los prefiltros en una unidad de clasificación de tamaño e instale la unidad de clasificación de tamaño y un filtro de respaldo en el muestreador de aire de bajo volumen. Ejecute el muestreador de aire a 116 camadas por minuto de forma continua durante siete días para recoger PM2.5 en el filtro de respaldo. Cuando finalice el muestreo, registre el volumen de flujo total. Pesar el filtro y calcular el peso de las partículas recogidas. Sellar el filtro en una bolsa de plástico y almacenarlo a 30 grados Celsius.Next prepare 500 microlitros de cóctel de proteasa no específico 6X y tampón de acetato y colóquelo en una membrana dalasisna con un corte de peso molecular de 5000 daltons. Sumergir la membrana llena en 1 L del tampón de acetato y agitar a 4 grados Celsius durante 24 a 36 horas, reemplazando el tampón cada 12 horas para eliminar la indogénea 3-Nitrotirosina y Nitrito.Then mida la concentración de proteína en la solución de proteasa dialiada con un ensayo de proteína de ácido biconcininic. Después de eso, retire un filtro del congelador y deje que se caliente a temperatura ambiente mientras esté sellado en la bolsa. A continuación, perforar hasta cinco círculos de 6 milímetros de ancho desde el área cubierta de partículas del filtro, y colocar los círculos en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros. Preparar 300 microlitros de tampón de acetato que contengan 50
Descripción general
Este artículo presenta un método altamente sensible para detectar modificaciones de 3-nitrotirosina en proteínas atmosféricas utilizando prefiltros de muestreadores de aire. La técnica utiliza cromatografía líquida de alta eficacia con un detector electroquímico (HPLC-ECD) para analizar las muestras recolectadas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación ambiental
- Química analítica
- Ciencia atmosférica
Antecedentes
- La 3-nitrotirosina es un marcador del estrés oxidativo y de los contaminantes ambientales.
- La detección de esta modificación puede proporcionar información sobre la calidad del aire y sus impactos en la salud.
- Los métodos actuales pueden carecer de sensibilidad o especificidad para muestras atmosféricas.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar las técnicas de detección para un mejor monitoreo ambiental.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método sensible para detectar 3-nitrotirosina en muestras de aire.
- Mejorar la comprensión de las modificaciones proteicas atmosféricas.
- Contribuir a la investigación ambiental sobre contaminantes como Nitrapyrin.
Métodos Utilizados
- Recolección de muestras de aire utilizando muestreadores de alto volumen.
- Uso de filtros de cuarzo para capturar material particulado.
- Dialización de las muestras para eliminar sustancias interferentes.
- Medición de la concentración de proteínas mediante un ensayo de ácido bicinconínico.
Resultados principales
- El método detecta con éxito 3-nitrotirosina con alta sensibilidad.
- Los resultados indican niveles significativos de 3-nitrotirosina en muestras atmosféricas.
- La técnica es reproducible y confiable para el monitoreo ambiental.
- Los hallazgos respaldan una mayor investigación sobre los efectos de los contaminantes del aire.
Conclusiones
- Este método proporciona una herramienta valiosa para los investigadores ambientales.
- Puede ayudar a evaluar el impacto de la calidad del aire en la salud.
- Estudios futuros podrían ampliar las implicaciones de la detección de 3-nitrotyrosina.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la detección sensible de 3-nitrotirosina, un biomarcador del daño oxidativo en proteínas, en material particulado atmosférico. Apoya la investigación en salud ambiental al vincular la calidad del aire con biomarcadores moleculares de inflamación y potencial alérgeno. El ensayo proporciona datos cuantitativos útiles para la eliminación mecanicista de riesgos en estudios de pulmonotoxicología e inmunotoxicología.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las vías de estrés oxidativo en modelos expuestos a bioaerosoles.
- Valor operativo: Proporciona una lectura de biomarcador para la nitrosación de proteínas en mezclas ambientales complejas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona una medición cuantitativa de 3-NT basada en HPLC-ECD con sensibilidad de pg/m3.
- Valor operativo: Utiliza una perforación estandarizada del filtro y digestión con proteasa para una preparación reproducible de muestras.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Relaciona la exposición ambiental a PM con modificaciones proteicas detectables en modelos relevantes para el pulmón.
- Valor operativo: Facilita la comparación entre estudios de la carga oxidativa a través de fracciones de partículas de diferentes tamaños.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que se evalúan factores ambientales para determinar su relevancia mecanicista en vías respiratorias o inmunitarias.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la nitración proteica inducida por ozono y NO2 en modelos de tejido pulmonar.
- Tamizaje: Permite obtener muestras listas para ensayos a partir de filtros con PM2,5 para la detección de biomarcadores.
- Análisis: Proporciona separación cromatográfica y detección electroquímica para la cuantificación específica de 3-NT.
- Investigación Traducional: Conecta los datos de exposición atmosférica con eventos moleculares iniciales en las vías de estrés oxidativo.
- Reutilización Empresarial: La plataforma HPLC-ECD puede adaptarse para detectar otras modificaciones postraduccionales en muestras ambientales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reducción del riesgo mecanicista mediante vínculos causales respaldados por biomarcadores entre contaminantes atmosféricos y daño proteico.
- Valor operativo: Alta sensibilidad (1.13 pg/m3) permite la detección en muestras ambientales de baja abundancia.
- Valor estratégico: Informa la evaluación de riesgos mediante la cuantificación de una modificación oxidativa específica en mezclas complejas.
- Impacto en la cartera: Apoya decisiones de avance o interrupción en programas dirigidos a patologías respiratorias relacionadas con la contaminación.
Consideraciones de Implementación
- Experiencia en hidrólisis de proteínas, diálisis y operación de HPLC-ECD.
- Acceso a muestreadores de aire de bajo volumen, clasificadores de tamaño y sistemas de digestión con proteasas.
- Normalización del tamaño del disco de filtro, condiciones del tampón y duración de la diálisis.
- Consideraciones de adaptación para diferentes tamaños de material particulado y cargas de proteínas.
- Límite práctico: requiere la eliminación de 3-NT endógeno y nitrito mediante diálisis prolongada.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Collection and Hydrolysis of Proteins in Particulate Matter (PM)
3:59
Determination of 3-Nitrotyrosine (3-NT) Content via a High-Performance Liquid Chromatography and Electrochemical Detection (HPLC-ECD) System
6:06
Results: Detection of 3-NT in PM2.5, PM7, and Total Suspended Particle (TSP) Samples Using HPLC-ECD
7:19
Conclusion
