Name: Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprende a desarrollar un sistema dominante negativo inducible para la inactivación condicional de proteínas en células NIH3T3. Este método permite estudiar funciones proteicas preservando actividad endógena residual.

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La pCS2 + CB-Myc6 vector fue un regalo de Marshall Horwitz (Universidad de Washington, Seattle, WA, USA). Las células de HEI-OC1 fueron amablemente proporcionadas por Fedrico Kalinec (escuela de medicina David Geffen, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Asistencia técnica fue proporcionada por la UNMC ratón genoma ingeniería base (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) y la Creighton University biomédica imagen instalación integrada (Richard Hallworth, John Billheimer). La UNMC ratón genoma Ingeniería fue apoyada por una concesión de desarrollo institucional (IDea) de los NIH/NIGMS, concesión número GM103471 P20. La instalación de imagen biomédica integrada fue apoyada por la Universidad de Creighton de la medicina y becas GM103427 y GM110768 de NIH/NIGMS. La instalación fue construida con el apoyo de becas del centro nacional para recursos de investigación (RR016469) y el NIGMS (GM103427). Las líneas de ratón generadas en este estudio fueron mantenidas en instalaciones de recursos Animal de la Universidad de Creighton, cuya infraestructura fue mejorada a través de una subvención por NIH/NCRR G20RR024001. Este trabajo recibida más allá del apoyo a través de un NIH/NCRR 5P20RR018788 - NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE conceder (a Shelley D. Smith), NIH/D.I.I.P R21OD019745-01A1 (s. S.) y una beca de investigación emergente de la Fundación de salud auditiva (para S. Tarang). El contenido de esta investigación es únicamente responsabilidad de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Generación de todo cuidado de los animales en el ratón transgénico de CBRb y experimentos relacionados con el estudio fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional de Universidad de Creighton y el Comité uso (IACUC) y realizadas por sus orientaciones.
1. transgénicos CB-Myc6-construcción de Rb1
Nota: La clonación de CBRb en un vector de pTet_Splice fue hecha en un proceso de múltiples paso (figura 1A y 1B).
<ol><li>
Llevar a cabo la primera clonación de etapa en la pCS2 + CB-Myc6 vector.
	<ol>
<li>Para crear la construcción del transgén de CBRb, amplificar un fragmento de cDNA de Rb1 de 1583-bp-largo (528 los aminoácidos correspondientes a la región del aminoácido 369 – 896) de la proteína de RB1 utilizando la siguiente cartilla establece: para EcoRI +RB 1243F, utilice GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCy XbaI + EcoRV +2826 RBR, CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.</li>
		<li>Copia el fragmento generado (1546 bp) entre los sitios de restricción EcoR1 y XbaI del pCS2 + CB-Myc6 vector como se describió anteriormente1,12. Nota: La construcción de CB-Myc6 1012-bp-larga (337 aminoácidos) fusionados con el fragmento de Rb1 dio lugar a una proteína de aproximadamente 865 aminoácidos (aproximadamente 108 kDa), que es ligeramente más pequeña que la proteína endógena de RB1 (~ 110 kDa) (figura 1 Un), con una etiqueta de6 CB-Myc en el N-terminal y Rb1 en el C-terminal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Llevar a cabo la segunda etapa subcloning en el vector pTet-empalme.
	<ol>
<li>Amplificar el fragmento de fusión Myc6-RB-CB y ganar el promotor Tet, amplificar el cassette, que consiste en la CB-myc6-Rb1 usando las cartillas que contienen los EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) y SalI : para SalI +CBF, uso de CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.</li>
		<li>Subclone el fragmento generado (2567 bp) en el vector pTet-empalme, entre los sitios de restricción SalI y EcoRV , de tal manera que el transgén de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 todo, incluyendo el intrón SV40 y el PolyA, puede ser aislada mediante una sola digestión con NotI (figura 1B). Nota: El fragmento de NotI se utilizó para generar a los transgénicos fundadores.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. en las pruebas de Vitro del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1
<ol><li>
DOX-Reglamento: Línea de células NIH3T3 Nota: A menos que se indique lo contrario, todos los volúmenes se han ajustado para una placa de 6 pozos.<ol>
<li>Crecen las células NIH3T3 siguiendo las especificaciones del proveedor, utilizando los medios de cultivo celular recomendado que contiene 10% de suero fetal bovino a 37 ° C con 10% CO2.</li>
		<li>Cotransfect las células con pTet-empalme y vectores pCMV-Tet3G (desde el paso 1) por 24 h. siguen los pasos mencionados a continuación para cotransfection.<ol>
<li>Mezcla de 2-4 μL del reactivo de transfección basada en lípidos/pozo y 1 mL de incompleta (sin suero) de Dulbecco modificado Eagle medio (DMEM) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para una placa de 12 o 24 pocillos, utilice 250 o 500 μl de medio de cultivo, respectivamente y Ayuste el volumen de reactivo de transfección.</li>
			<li>Añadir 2 – 3 μg de plásmido ADN/bien al reactivo de transfección-DMEM e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
			<li>Añadir la mezcla que contiene el ADN y el reactivo de transfección en DMEM a cada pocillo. Después de 3 – 4 h de incubación, añadir 1 mL de medio completo (de modo que el volumen final es de 2 mL/pocillo). Guardar alícuotas de Dox stock (1 mg/mL) y añadir 2 μL en cada uno de los pozos (+ Dox). Incube las células a 37 ° C con 5% CO2. Nota: Muestras de control deben consistir en cotransfected células no tratadas con Dox (-Dox), así como las células NIH3T3 transfectadas con el vector de Tet3G pCMV transactivator y trataron con Dox por un período de 24 h. Para pCMV-Tet3G, las concentraciones de 0.1-1 μg/mL Dox debe ser suficiente para inducir la expresión del transgén.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prueba de la reversibilidad de la construcción mediante la línea de células HEK293.
	<ol>
<li>Para probar la reversibilidad del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , células en cultivo HEK293 del águila mínimo esencial media (EMEM) siguiendo las especificaciones del proveedor y cotransfect con vectores pTet-empalme y pCMV-Tet3G de 24 h, como se describe arriba (paso 2.1.2).</li>
		<li>Para la inactivación del transgen, eliminar los medios de comunicación que contiene Dox después de 24 h, lavar la células 2 x-3 x con tampón fosfato salino (PBS) e incubar en medios libres de Dox para un 24 h adicional. Nota: Sobre Dox-retiro, la inactivación del transgen y expresión de la proteína regular deben reanudar dentro de ese plazo de 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para evaluar la funcionalidad de la construcción de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en la promoción de la proliferación celular no programada, realizar el análisis funcionales utilizando una línea celular de HEI-OC1, como se describe a continuación.
	<ol>
<li>HEI-OC1 células en cultivo en 10% DMEM bajo permisiva condiciones (33 ° C con 10% CO2). Para estudios de proliferación celular, contar las células usando un contador de células y células de HEI-OC1 placa 10.000 en una placa de 96 pocillos en un volumen de 200 μl. Incube las células durante la noche.</li>
		<li>Al día siguiente, realizar una transitoria cotransfection de vectores pTet-empalme y pCMV-Tet3G utilizando un reactivo de transfección basada en lípidos (ver pasos 2.1.2). En un pozo independiente, realizar pmR-ZsGreen1 transfección at2 μg utilizando el reactivo de transfección basada en lípidos (pasos 2.1.2) para calcular la tasa de transfección. Utilice las células transfectadas no como controles.</li>
		<li>Detectar la presencia de fluorescencia verde bajo un microscopio de fluorescencia (excitación = 485 nm, emisión = 530 nm) para el transfected las células 24 h después de transfección. Registrar la presencia o ausencia de fluorescencia verde y calcular la tasa de la transfección como el número total de células GFP-positivas (células transfected) sobre las células etiquetadas con DAPI (células totales). Nota: Se estimó una tasa de transfección de ~ 70%.</li>
		<li>Para inducir la expresión de transgenes, añadir 1 μg/mL Dox a un subconjunto de células transfected mientras usa el otro subconjunto como control (-Dox). Uso de las células no tratadas de HEI-OC1 como controles adicionales.</li>
		<li>Para evaluar la proliferación celular, utilice un kit de proliferación celular según protocolo del fabricante.<ol>
<li>En Resumen, 48 h después de la transfección, eliminar el medio de cultivo celular y añadir 100 μl de solución de unión a la tinte 1 x a cada pocillo de la microplaca. Incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
			<li>Después de eso, medir la intensidad de fluorescencia de cada muestra usando un lector de microplacas de fluorescencia (excitación = 485 nm, emisión = 530 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para evaluar mediante inmunocitoquímica la proliferación celular, las células de HEI-OC1 en un vidrio de cubierta en una placa de 12 pozos de la placa e incubar durante una noche a 37 ° C.<ol>
<li>Al día siguiente, cotransfect pTet-empalme y pCMV-Tet3G y realizar el tratamiento de Dox (+ Dox). Utilice las células untransfected como controles. Células de HEI-OC1 proceso de etiquetado Ki-67.</li>
			<li>Fijar las células con 4% paraformaldehido (PFA) en PBS, pH 7,4, 10 min a temperatura ambiente. Lavar las células 3 x con helada PBS e incubar las células en detergente no iónico de 0,25% en PBS durante 10 minutos.</li>
			<li>Lavar las células otra vez, 3 veces en PBS por 5 min y bloque con 10% de suero en una cámara humidificada durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
			<li>Incubar las células en 500 μl de anticuerpo primario de Ki-67 (dilución 1: 200) durante 3 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.</li>
			<li>Lavar las células 3 x durante 5 minutos con PBS. Después de eso, incubar las células con el anticuerpo secundario por 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
			<li>La solución de anticuerpo secundario de quitar y lavar las células 3 x con PBS durante 5 minutos en la oscuridad.</li>
			<li>Para el etiquetado phalloidin, incubar las células HEI-OC1 phalloidin 1: 200 por 30 minutos. Para los núcleos de las células de la etiqueta, incubar las células con DAPI de 5 μg/mL durante 10 minutos a temperatura ambiente. Nota: Asegúrese de que el conjugado de tinte phalloidin es diferente al conjugado de anticuerpo secundario.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. generación de CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) ratones transgénicos y en Vivo la prueba del enfoque DN CBRb
<ol><li>Sobre la confirmación de la efectiva regulación de Dox del transgén TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , purificar el fragmento NotI y microinject en cigotos de ratón, que más tarde se transfieren a pseudo-hembras. Nota: Estos procedimientos se llevaron a cabo en la Universidad de Nebraska centro (UNMC) ratón genoma ingeniería núcleo facilidad médica.</li>
	<li>Después de la entrega, el genotipo de las crías con un primer set específicas a la región de fusión CB-Rb1 : para CBRb F, utilice 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3 ' y para R de CBRB, 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′. Nota: El tamaño del producto PCR en gel de agarosa es 401 bp (bp 60 CB región + región de Rb1 341-bp (tabla 1). Se identificaron diez líneas fundador independiente, basada en la presencia del transgen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . En cinco de estas líneas, progenie heredó el transgén, que confirmó la transmisión de la línea germinal del transgén. En última instancia, una de las líneas transgénicas se utilizó para establecer y mantener la línea y generar animales experimentales de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 para estudios posteriores.</li>
	<li>Se crían ratones adultos de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 a la línea ROSA-CAG-rtTA de inductor de la tetraciclina (Stock #006965) (alternativamente, raza a una línea de tTA inductor) para generar ratones experimentales de DN CBRb. Genotipo de la descendencia de esta cruz con el siguiente conjunto de cartilla: rtTA WT R, utilice GGAGCGGGAGAAATGGATATG; para rtTA mutante R, use GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; y para rtTA común, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Los tamaños del producto PCR son 340 bp (mutante), 340 bp y 650 bp (heterocigoto) y 650 bp (tipo salvaje).</li>
	<li>Generar una curva de dosis-respuesta de la proteína de RB1 después del tratamiento de Dox para determinar el tiempo y la longitud del Dox tratamiento necesario para obtener una expresión del transgén. Nota: En este experimento, western blot y qRT-PCR fueron utilizados para evaluar tejidos específicos transgen activación y expresión de RB1.</li>
	<li>Realizar en situ hibridación de la fluorescencia (pescado) para confirmar la inserción genómica del transgén. Nota: Esto se llevó a cabo en el centro de genómica aplicada del Hospital para niños enfermos (Toronto, Canadá). ELISA o western blot (mediante anticuerpos específicos de proteína) puede utilizarse para evaluar la activación del transgen, especificidad de tejido y cambios en los niveles del PDI endógeno. Para la construcción DN-CB-myc6-Rb1 , se utilizó un anticuerpo anti-RB1.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
<li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+retinoblastoma+%28rb%291-inducible+dominant-negative+%28DN%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li>
<li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li>
<li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+ciliogenesis%2C+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122%2FWdr10%2C+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1%2FMbd4%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li>
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<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li>
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<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
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<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+retinoblastoma+1+%28Rb1%29+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+%28Skp2%29+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para eludir las limitaciones asociadas con las estrategias tradicionales de transgénicas, se buscó generar un modelo de ratón en el que un POI endógena puede ser condicional inactivado por overexpressing una forma mutante de DN de él de manera espacio-temporal. Para suprimir la función de POIs endógenos, varias opciones han sido propuestos15,16,17. Hemos modificado una estrategia genética anterior1 combin...

Enfoques más con el objetivo de la ablación del gen y la proteína dependen de procesos permanentes, que generalmente conducen a la eliminación completa o el truncamiento de la gene, secuencias de ARN o proteínas de interés (POI). El objetivo general de este método es diseñar una proteína recombinante para suprimir la función de la proteína endógena, tipo salvaje. Hemos revisado y renovado una estrategia alternativa1,2, que permite la ablación temporal de un POI a través de la inhibición de la DN. Este método funciona para multiméricas y péptidos monoméricos pero es el más adecuado para las proteínas que funcionan en una Asamblea de multimérica.
El método consiste en fundir la proteasa lisosomal CB a una subunidad de un multimérica POI (complejo de fusión de la CB). La fusión resultante de CB complejo puede interactuar con proteolytically digerir la proteína endógena y desviar todo el complejo de POI CB al lisosoma para ser degradados3. Por otra parte, una combinación de la fusión de CB compleja con el carácter inducible del sistema de activación transcripcional controlado por tetraciclina (TetO) permite una expresión inducible y controlada del transgén en una manera reversible2. Aunque útil en muchas circunstancias, la supresión completa de genes o proteínas in vivo puede resultar en mortalidad4,5,6. Además, eliminación de tejidos específicos, condicional de algunos genes o proteínas mediante el sistema Cre/Lox puede no ser sencillo, ya que provocaría, en última instancia, a la pérdida permanente de elementos genómicos críticos7. Por lo tanto, dependiendo de la genética o POI, ninguno de estos enfoques será eficaz en proporcionar un modelo útil para estudios posteriores, particularmente genes o proteínas los estudios funcionales en ratones adultos y postnatales tardíos.
Para eludir los problemas asociados con estos enfoques y proporcionar prueba de principio sobre la efectividad del método propuesto, hemos optado por probar el método presentado aquí por generar una versión DN condicional de la proteína Retinoblastoma 1 (RB1). Varias opciones han sido propuestos8,9,10 para suprimir la función de RB1 endógeno; sin embargo, todos ellos frente a algunas de las mismas limitaciones mencionadas: eliminación permanente del germline de RB1 es catequizador letal y, coherente con su función de supresor de tumor, permanente borrado condicional RB1 conduce a una variedad de tumores11. Aunque una versión de DN de RB1 parece no ocurre naturalmente, una mejor alternativa a las estrategias actualmente disponibles debe permitir una inactivación temporal controlada de RB1 endógeno y proporcionar un mecanismo alternativo para finalmente restaurar su función. La base para dicha construcción fue descrita hace más de dos décadas1. Sin embargo, debido a limitaciones tecnológicas, carecía de un mecanismo de control transgen activación, la respuesta y la especificidad de tejido. Este estudio es el primero en combinar la elegancia de la doxiciclina (Dox)-sistema transcripcional dependiente con una construcción transgénica ingeniería de proteínas de CB y Rb1 proteasa lisosomal. El modelo de ratón de CBRb resultante permite una RB1 mediada por Dox temporalmente regulada regulación2. La ventaja de utilizar un enfoque basado en el proteoma para estudiar la función genética es que puede adoptarse para cualquier gen de interés, con la mínima información sobre su actividad.
La estrategia propuesta de transgen DN ofrece muchas ventajas sobre los enfoques tradicionales. En primer lugar, inhibición de la proteína DN conduce a solamente una ablación parcial en actividad de la proteína, preservando así una expresión endógena residual. Ese resultado es muy conveniente en situaciones donde una eliminación completa de la actividad de la proteína conduce a mortalidad embrionaria, limitando grandemente cualquier investigación para estudiar la función del gen en un ratón vivo. En segundo lugar, la presencia del sistema TetO permite activación de transgen sólo en presencia de un antibiótico, que permite un control eficaz y reversible de la actividad del transgen. Así, al dejar la administración de antibióticos, se puede desactivar el sistema de transgénico, y es una expresión normal de RB1 en lugar. En tercer lugar, la especificidad de la expresión del transgen puede variar según el promotor de la opción. Aunque hemos optado por el promotor de ROSA-CAG ubicuo para la prueba de principio, colocar el transgén en un promotor tejido específico es probable restringir la expresión del transgén no deseados y facilitar estudios sobre la aplicación terapéutica de este transgén metodología.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle, MEME&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F2442&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina &nbsp;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma&nbsp;</td>Kit de proliferación celular <td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant NF&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>Retinoblastoma 1 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>c-Myc anticuerpo</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-actina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Phallodin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas de fluorescencia</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia&nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>La línea de ratones TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) está disponible en el Laboratorio Jackson como JAX#032011.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inhibición de la proteína inducible y reversible dominante negativo (dn)

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominante negativa inhibición de la proteína (DN) es un método potente para manipular la función de la proteína y ofrece varias ventajas sobre otros enfoques basados en el genoma. Por ejemplo, aunque quimérica y Cre-LoxP estrategias objetivos han sido ampliamente utilizados, las limitaciones intrínsecas de estas estrategias (es decir, actividad de promotor agujereado, expresión del Cre de mosaico, etc.) han restringido significativamente su aplicación. Por otra parte, una canceladura completa de numerosos genes endógenos es catequizador letal, lo que hace imposible para el estudio de funciones de los genes en la vida postnatal. Para enfrentar estos desafíos, hemos hecho cambios significativos a un protocolo de ingeniería genética temprana y combina una versión corta (transgénica) del gen Rb1 con una proteasa lysosomal B procathepsin (CB), para generar un modelo de ratón de DN de Rb1 (CBRb). Debido a la presencia de una proteasa lisosomal, la proteína de la fusión completa de CB-RB1 y su complejo de interacción se dirigen para la degradación mediada por el proteasoma. Por otra parte, la presencia de un elemento inductor (rtTA) de tetraciclina en la construcción de transgénico permite una regulación inducible y reversible de la proteína de RB1. La presencia de un promotor de ROSA-CAG omnipresente en el modelo de ratón de CBRb es una herramienta útil para realizar ablación de gene Rb1 transitoria y reversible y proporcionar a los investigadores un recurso para comprender su actividad en prácticamente cualquier tipo de célula donde se expresa el RB1.

En general, diseñar una mutación DN requiere una cantidad considerable de información sobre la estructura y función de la PDI. En contraste, la estrategia de DN presentada aquí es particularmente útil cuando la información estructural y funcional para el POI es limitada. Si el POI es una proteína multimérica, una fusión de una subunidad a una proteasa lysosomal dominante puede inhibir multimer montado y, potencialmente, otros ligandos a través de una combinación de la proteólisis de las s...

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.

Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en una amplia variedad de campos que requieren inactivación condicional y transitoria de un gen de interés al sobre-expresar de manera reversible una versión negativa dominante del índolo. La principal ventaja de esta técnica es que sólo permite una ablación parcial en la actividad proteica, preservando así una expresión endógena residual. Aunque, aquí describimos la condición de inactivación de la proteína RB, que funciona en un ensamblaje multimérico, esta metodología también se puede aplicar a proteínas monoméricas.Umesh Pyakurel, nuestro teciniciano de laboratorio y coautor en el manuscrito demostrará los procedimientos. Para empezar, el cultivo de células NIH3T3, siguiendo las especificaciones del proveedor, a 37 grados Celsius con 5%CO2, utilizando el medio de cultivo celular recomendado que contiene 10%suero bovino fetal. Para coducduccionar las células usando vectores pTet-Splice y pCMV-Tet3G, primero mezcle de dos a cuatro microlitros del reactivo de transfección a base de lípidos por pozo, y un mililitro de DMEM incompleto por pozo en un tubo de 15 mililitros, e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Añadir de dos a tres microgramos de ADN plasmático por pozo a la mezcla DMEM de este reactivo de transfección. Mezclar e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Añadir un mililitro de la mezcla que contiene ADN y el reactivo de transfección en DMEM a cada pocero de placa de seis pocillos con células NIH3T3.Después de tres a cuatro horas de incubación a 37 grados Celsius con 5%CO2, añadir un mililitro de medio completo. A continuación, agregue 2 microlitros de caldo de doxiciclina a cada pozo y marque la placa como más doxiciclina. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5%CO2.Para evaluar la funcionalidad de la construcción TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en la promoción de la proliferación celular no programada, cultivo de células HEI-OC1 en DMEM que contiene 10%FBS, en condiciones permisivas. Para estudios de proliferación celular, cuente las células HEI-OC1 utilizando un contador de células. Placa 10.000 células HEI-OC1 por pozo en una placa de 96 pozos en 200 microlitros de volumen cada una.Incubar las células durante la noche a 33 grados centígrados con 5%CO2. Para inducir la expresión de transgén, agregue un microgramos por mililitro de doxiciclina a un subconjunto de células HEI-OC1 transfectosas. Utilice el otro subconjunto etiquetado como menos-doxiciclina y las células HEI-OC1 no transfectadas como controles, e incubar las células como 33 grados Celsius con 10%CO2.Para evaluar la proliferación celular, 48 horas después de la transfección, retire el medio de cultivo celular y agregue 100 microlitros de solución de unión de tinte 1x de un kit de proliferación celular a cada pocólite de la microplaca. Siga el protocolo del fabricante e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Utilice un lector de microplacas de fluorescencia para medir la intensidad de fluorescencia de cada muestra.Para evaluar aún más la proliferación celular mediante inmunocitoquímica, placa las células HEI-OC1 en un vidrio de cubierta colocado en cada pozo de una placa de 12 pozos en DMEM. Incubar las células durante la noche a 33 grados centígrados. Al día siguiente, cotransfecta a las células en dos pozos con el pTet-Splice y los vectores pCMV-Tet3G, y luego realizar el tratamiento de doxiciclina en uno bien como se hace con las células NIH3T3.Utilice uno no infectado, así como un control. Para procesar las celdas para el etiquetado Ki-67, fijelas con 4%paraformaldehído en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, lávelos tres veces con PBS helado durante cinco minutos cada uno.Añadir 0.25% detergente no iónico en PBS, e incubar durante 10 minutos. Repita el lavado tres veces en PBS durante cinco minutos cada uno. Usa 10% de suero para bloquear las células.En una cámara humidificada durante una hora a temperatura ambiente. Añadir 500 microlitros de anticuerpos primarios Ki-67 e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave las células de nuevo tres veces en PBS durante cinco minutos cada una.Añadir un mililitro del anticuerpo secundario e incubar las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de extraer la solución secundaria de anticuerpos, lave las células de nuevo tres veces durante cinco minutos en PBS en la oscuridad. Para etiquetar las células HEI-OC1 con falhalloidina, incubarlas en 1:200 faloidein durante 30 minutos a temperatura ambiente.Para etiquetar los núcleos celulares, incubar las células con cinco microgramos por mililitro de DAPI Durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la entrega de los ratones transgene, genotipo los cachorros utilizando un conjunto de imprimación específico para la región de fusión CBRb1 como se describe en el manuscrito. Criar ratones adultos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 a la línea de inductores ROSA-CAG-rtTA y tetrecycline para generar ratones DN-CBRb experimentales, y genotipo su descendencia como se describe en el manuscrito.NIH3T3 no expresa la proteína RSB1 endógena, por lo que la robusta expresión RB1 que se ve aquí se debe a la inducción transgén en presencia de Dox, pero no en su ausencia, confirmando la activación eficiente de la construcción RB1 de mezcla TetO-DN-CB-myc6-Rb1. Por el contrario, las células HEK293 tienen expresión de RB1 endógena. La adición de doxiciclina llevó a TetO-DN-CB-myc6-Rb1 activación y RB1 down-regulation.La expresión RB1 se reanudó 21 horas después de que se retirara la doxiciclina de los medios. Las células HEI-OC1 cotransfectadas con los mismos vectores, mostraron un aumento modesto pero significativo en el número de células siguen el tratamiento de doxiciclina en comparación con las células transfectadas no tratadas con doxiciclina, y las células no transfectadas. La hibridación fluorescente in situ confirmó la inserción genómica del transgén TetO-DN-CB-myc6-RB1 en ratones.Hubo un aumento inicial en la expresión total de proteína RB1 en cóclea de los ratones transgénicos tratados con doxiciclina durante tres días en comparación con el grupo de control. Sin embargo, en grupos tratados con doxociclina durante siete y 10 días, se observó una reducción significativa en la expresión de RB1. Independientemente del tejido analizado, se observó una reducción significativa de la proteína RB1 en ratones transgénicos tratados con doxociclina, pero no en el grupo de control, lo que confirma la eficiencia de la construcción TetO-DN-CB-myc6-RB1.Al intentar este procedimiento, es importante comprobar que cada uno de los elementos de codificación del transgén están en fotograma entre sí. Si las regiones codificantes de Cathepsin B y el retinoblastoma descritos en este informe estuvieran, por casualidad, conectadas fuera de marco, no produciría la proteína de fusión prevista. Por lo tanto, la verificación de la secuencia de ADN debe realizarse antes de inyectar el transgén en embriones de ratón de una sola célula.Después de este procedimiento, el ubicuo promotor CAG puede ser reemplazado por promotores específicos con el fin de estudiar la función génica de la manera específica de una célula.

inducible-and-reversible-dominant-negative-dn-protein-inhibition

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Una manera rápida y sencilla para generar líneas celulares humanas con sobreexpresión inducible y reversible de ADNc o shRNA mediada derribar-del gen de interés. Este método permite a los investigadores a las líneas celulares altamente fiable y reproducible manipular que son difíciles de modificar por métodos de transfección transitoria o estrategias convencionales desmontables / knockout.

Generación de líneas celulares estables Humanos (Tet-on) inducible por tetraciclina o shRNA expresión cDNA

El método descrito aquí se utiliza para inducir la cascada de señalización apoptótica en pasos definidos con el fin de diseccionar la actividad de una proteína efectora bacteriana antiapoptótica. Este método también se puede utilizar para la expresión inducible de proteínas proapoptóticas o tóxicas, o para diseccionar la interferencia con otras vías de señalización.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

Describimos aquí un sistema que utiliza un bloque de proteínas in vivo reversible y específico del sitio para detener y colapsar las horquillas de replicación en Escherichia coli. El establecimiento del bloque de replicación se evalúa mediante microscopía de fluorescencia y se utiliza electroforesis en gel de agarosa en 2 dimensiones neutro-neutro para visualizar los intermedios de replicación.

Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico<i&gt; E. coli</i&gt; El uso de un sistema fluorescente represor operador

Este protocolo sirve como un esquema para establecer un sistema funcional de Tet-ON en líneas celulares de cáncer y su posterior utilización, en particular para estudiar el papel de proteínas derivadas de células de tumor en el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del tumor.

Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor

Este protocolo describe los pasos necesarios para generar un modelo de sistema en que se puede regular la transcripción de un gen endógeno de interés condicional en animales vivos o células con mayor lac represor y tet activador de sistemas.

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

Aquí, describimos una herramienta de edición del genoma basada en la estabilización temporal y condicional de la proteína 9 asociada a la repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada (CRISPR) (Cas9) bajo la pequeña molécula, Shield-1. El método se puede utilizar para células cultivadas y modelos animales.

Un nuevo kit de herramientas para evaluar las funciones genéticas utilizando la estabilización condicional cas9

La interacción de un remodelador de cromatina dependiente de ATP con un ligando de ADN se describe mediante espectroscopia de CD. Los cambios conformacionales inducidos en un promotor génico analizado por los picos generados pueden ser utilizados para comprender el mecanismo de regulación transcripcional.

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Aquí, presentamos un protocolo para la selección in vitro de represores transcripcionales (ETR) diseñados con una alta eficiencia de silenciamiento estable, estable y a largo plazo y una baja actividad fuera del objetivo en todo el genoma. Este flujo de trabajo permite reducir un repertorio inicial y complejo de ETR candidatos a una lista corta, adecuada para una evaluación posterior en entornos terapéuticamente relevantes.

In vitro Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido

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Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

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Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

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