Name: Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprende la reprogramación directa de linaje para convertir fibroblastos de ratón en progenitores eritroides inducidos. Este método facilita el estudio de la regulación transcripcional en el desarrollo de células sanguíneas.

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Agradecemos a Evelyn Wang y Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) para clonación y Harvey Lodish (Whitehead Institute) para proporcionar muchos de la plásmidos utilizada para generar la biblioteca retroviral. Agradecemos a Kavitha Siva y Sofie Singbrant (Departamento de Medicina Molecular y genética Therapy, Universidad de Lund), Göran Karlsson y Shamit Soneji (Departamento de Hematología Molecular, Universidad de Lund) para sus funciones en la descripción de la iEP. También nos gustaría reconocer y agradecer a Julian Pulecio (centro de medicina regenerativa, Parque de investigación biomédica de Barcelona), Violeta rayón-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (Instituto de investigación médica de San Vicente y Departamento de medicina, Hospital de San Vicente, Universidad de Melbourne), Ángel Raya (institución catalana de investigación y estudios avanzados, Barcelona) y Vijay G. Sankaran (Instituto Broad del Instituto Massachusetts de tecnología y de Harvard, Cambridge ) por sus contribuciones anteriores a este trabajo. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Söderberg Ragnar (a j); el sueco de investigación Consejo (J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (a j); la Fundación sueca para la investigación estratégica (a j); Fundación de Åke Wiberg (J.F.); una beca de integración de Marie Curie (a J.F.).

1. establecimiento y mantenimiento de cola de ratón primaria punta culturas del fibroblasto
<ol><li>Preparar platos de cubierta de gelatina (se recomienda un plato de 10 cm para una cola) que cubre la superficie con 0.1% gelatina e incubando los platos para unos 20 min a 37 ° C. Aspire la solución de gelatina del plato y deje que se seque durante al menos 2 h.</li>
	<li>Eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Quitar la cola con las tijeras, corte en la base de la cola. Poner la cola en suero salino de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) con 2% de suero bovino fetal (FBS) hasta que esté listo para usar. Nota: Para mejores resultados, colas deben ser tomadas de ratones alrededor de 6 a 8 semanas de edad. Pueden tomar colas de ratones mayores de 8 semanas de edad, sin embargo, como la edad de los ratones, la capacidad de proliferación de los fibroblastos y la eficiencia de reprogramación disminución de11.</li>
	<li>Realizar todos los pasos posteriores de este protocolo en una campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles. Preparar una solución de tripsina diluido de 0.02% tripsina-EDTA en DPBS y añadir 5 mL en un plato de 10 cm sin recubrimiento.</li>
	<li>Lavar la cola, primero en etanol al 70%, entonces en DPBS. En un plato, colocar la cola plana y usar pinzas para sujetar en su lugar. Hacer una incisión en la cola a lo largo de su eje longitudinal desde la base hasta la punta.</li>
	<li>Sujete la cola con un par de pinzas y manténgalo verticalmente. Utilizando un segundo par de pinzas, agarre la piel al lado de la incisión en la base de la cola y piel vuelta. Hacerlo en ambos lados de la incisión hasta que la piel se puede pelar apagado tirando hacia abajo hacia la punta de la cola.</li>
	<li>Sujete la cola pelada con pinzas sobre el plato que contiene la solución de tripsina y cortar la cola en trozos largos de aproximadamente 1 cm. Con las piezas de la cola en la solución de tripsina, use tijeras para fragmentar los pedazos en trozos más pequeños. Incubar las piezas de la cola en la solución de tripsina a 37 ° C durante 10 minutos. Nota: Las piezas de los más pequeñas son preferidas para dar a cada pieza un elevada área superficial al cociente del volumen.</li>
	<li>Saciar la tripsina con 2 volúmenes de medio de expansión (FEX) de fibroblastos (alta glucosa Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con 15% SFB, 2 mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales (AANE) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina).</li>
	<li>Recoger todo el contenido del plato en un tubo de 50 mL y centrifugar a 350 × g por 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender los fragmentos de la cola en 10 mL de medio fresco de FEX.</li>
	<li>Fragmentos de la cola en medio de la transferencia a un plato cubierto de gelatina e incubar a 37 ° C en 5% CO2 y 4% O2, añadiendo medio fresco de FEX cada 2 días. Nota: Después de cinco a siete días, fragmentos de la cola han unido en la parte inferior del plato y se observan fibroblastos alejándose de ellos.</li>
	<li>Una vez que los racimos de los fibroblastos se han manchado, agite suavemente el plato para desplazar piezas de cola y aspire el medio y todos los fragmentos de hueso dejando los fibroblastos conectados a la placa. Agregar nuevo medio FEX y los fibroblastos de la cultura hasta el confluente.</li>
	<li>Para asegurar la no contaminación de los fibroblastos de progenitores hematopoyéticos, disociar las células de la placa con tripsina-EDTA de x 1 por 5 minutos y recoger las células. Agotan las células expresan marcadores hematopoyéticos (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 y Ter-119) utilizando un sistema de separación magnética10.</li>
</ol>2. retrovirus producción
<ol><li>Semilla células empaquetado retroviral en aproximadamente 2,5 × 104 células/cm2 (2,0 × 106 células por un plato de 10 cm) sobre un plato de cultivo de tejidos tratados (por vacío-gas plasma) y la cultura durante la noche en alta glucosa DMEM con 10% FBS, 10 mM sodio Piruvato y 100 U/mL penicilina/estreptomicina a 37 ° C y 5% CO2.</li>
	<li>A la mañana siguiente, tomar el medio DMEM sin aditivos con la mitad el volumen utilizado a la cultura durante la noche (5 mL para un plato de 10 cm). En la tarde, comprobar que las células son 70-80% confluente y comienzan la transfección.</li>
	<li>Para cada factor de reprogramación, Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc, preparar una mezcla 2:1 de la expresión vector (pMX) y ayudante (que contiene los genes gag y pol). Para un plato de 10 cm de los fibroblastos, use 6 μg de vector de la expresión y 3 μg de vector de ayudante en un volumen final de 100 μl de medio DMEM.</li>
	<li>Para cada factor de reprogramación, preparar 300 μL de temperatura (RT) DMEM en un tubo estéril de poliestireno y con cuidado añadir 27 μl de reactivo de transfección comercial. Nota: El reactivo de transfección se debe traer a RT antes de su uso y debe agregarse directamente en el medio como las propiedades electrostáticas del compuesto pueden pegarse a la pared de plástico del tubo.</li>
	<li>Añadir la mezcla de plásmido en el tubo que contiene el reactivo de transfección, vortex brevemente e incubar la mezcla de ADN de reactivo de transfección durante 15 min a TA. brevemente vórtice la mezcla y añadir gota a gota a las células de empaquetado retroviral que la transfección mezcla de reactivo-DNA se extiende uniformemente sobre la cultura e incubar a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>24 h después de la transfección, tomar el medio DMEM con 20% FBS y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina. 48 h después de la transfección, recoger el sobrenadante y filtrar con un filtro de jeringa de tamaño de poro de 0,22 μm. Nota: Sobrenadante Viral puede ser congelado a-80 ° C y mantenerse hasta que la necesite, aunque transducción es más eficiente si se utiliza fresco sobrenadante viral.</li>
</ol>3. GTLM transducción y cosecha de la iEP
<ol><li>Semilla de la cola punta de fibroblastos en el 1 × 104 células/cm2 en 0.1% gelatina cubierto primero platos en medio FEX e incubar a 37 ° C durante 24 h.</li>
	<li>Al día siguiente, prepare una mezcla de transducción como sigue.<ol>
<li>Agregar 1 volumen de sobrenadante viral para cada factor de reprogramación con 4 μg/mL de reactivo de infección retroviral (40%) a 6 volúmenes de medio FEX (60%).</li>
		<li>Para un plato de 10 cm de los fibroblastos, añadir 1 mL de cada sobrenadante viral (virus x 4 = 4 mL) suplementado con 4 μg/mL de reactivo de infección retroviral a 6 mL de medio FEX, dando un total de 10 mL de una mezcla de transducción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspire medio FEX de la cultura del fibroblasto y sustituirla por la mezcla de la transducción de señales. Incubar la transducción por 4 h a 37 ° C en condiciones hipóxicas (5% CO2 y de 4% O2).</li>
	<li>Aspirar la mezcla de transducción y reemplazarlo con medio fresco de reprogramación (medio libre de suero expansión (SFEM), 100 U/mLPenicillin/estreptomicina, 100 ng/mL Factor murino de células madre (mSCF), 10 ng/mL murino interleucina-3 (IL3), 2 recombinante humano U/mL Eritropoyetina (hrEPO) y 100 nM dexametasona).</li>
	<li>Incubar durante estancias 8 37 ° C en condiciones hipóxicas, añadiendo medio fresco reprogramación cada 2 días. Después de cinco a ocho días, reprogramación exitosa dará racimos de células que se han separado de la placa.</li>
	<li>Para recoger células reprogramadas para el análisis, suavemente pipeta hacia arriba y hacia abajo para recoger directamente en el plato. Para cosechar untransduced fibroblastos para la comparación, disociar las células de la placa utilizando 1 x tripsina-EDTA y recoger.</li>
</ol>

<ol><li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+We+Really+Vastly+Outnumbered%3F+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li>
<li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057492">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li>
<li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+conversions%3A+unnatural+but+useful%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li>
<li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li>
<li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+reprogramming%3A+a+two-way+street%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li>
<li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+couples+erythropoiesis%2C+B-lymphopoiesis%2C+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li>
<li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li>
<li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li>
<li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83(2016).</li>
<li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li>
<li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de interés al informe.

La sobreexpresión de un cóctel de cuatro factores, GATA1, TAL1, LMO2 y c-MYC (GTLM), es suficiente para reprogramar fibroblastos murinos y humanos directamente a iEPs10. Las células eritroides reprogramado mucho se asemejó a bona fide eritroides progenitores en cuanto a morfología, fenotipo, genes y capacidad formadora de colonias. Este hallazgo corrobora el fundamento de la utilizació...

Glóbulos rojos (gr) son esenciales en todos los vertebrados y conforman el 84% de todas las células del cuerpo humano1. De embrión a la vida adulta, nuestra salud es altamente dependiente de la exacta regulación de la homeostasis de la RBC. La continua producción de glóbulos rojos maduros en todo el desarrollo en la edad adulta se conoce como eritropoyesis. Un desafío importante en la investigación de la eritropoyesis es definir los principales reguladores que orquestan el desarrollo de la RBC y el interruptor entre eritropoyesis primitiva y definitiva. Reprogramación de linaje directo de progenitores eritroides presenta una oportunidad para entiendo eritroides desarrollo in vivo.
Linaje directo reprogramación (DLR), también conocido como transdiferenciación, es el proceso de reprogramación de un tipo de célula directamente a otro, evitando pluripotenciales y progenitoras multipotentes etapas. DLR hasta el momento se ha utilizado para producir numerosos tipos de células incluyendo nervios2, hematopoyética3,4,5, hepática6 y nefrótico7, las células progenitoras. Para los biólogos del desarrollo, DLR se ha convertido en una herramienta importante para interrogar aspectos de linaje compromiso y procesos de diferenciación terminal8,9. DLR puede complementar y reemplazar parcialmente en vivo estudios de mecanismos de comprensión del destino celular factores determinantes durante el desarrollo. El protocolo DLR para reprogramación de progenitores eritroides que se describe en este artículo proporciona el campo un método gratuito para estudios del desarrollo de la eritropoyesis.
Previamente hemos demostrado que la sobreexpresión de un cóctel de cuatro factores, GATA1, TAL1, LMO2 y c-MYC (GTLM), es suficiente para reprogramar fibroblastos murinos y humanos directamente a progenitores eritroides inducida (iEPs) 10. las células eritroides GTLM el reprogramado mucho se asemejan a bona fide primitivo eritroides progenitores en cuanto a morfología, fenotipo y gene expresión10. Así iEPs tienen una capacidad de proliferación limitada y madurar a eritrocitos nucleados similares a los producidos transitoriamente en el embrión antes del inicio de la eritropoyesis definitiva. Al hacer cambios en las condiciones de reprogramación (p. ej., mutaciones de punto en reprogramación factores o la adición de otros factores), uno puede entender cómo esto conduce a cambios en la diferenciación y desarrollo eritroide. Por ejemplo demostramos que además de Klf1 o Myb al cóctel GTLM cambia el patrón de expresión de la globina de predominantemente embrionario (primitivos) para principalmente adultos (definitivo). Este hallazgo corrobora la validez de la utilización de DLR como una herramienta para la definición de factores de desarrollo en la eritropoyesis.
Aquí, describimos el proceso de generar iEPs de fibroblastos de punta de cola de ratón (TTF). En nuestros resultados representativos, se realizó la reprogramación en fibroblastos de los ratones de seguimiento del linaje eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expresan la proteína amarilla fluorescente (eYFP) desde el locus Rosa26 en todas las células que han expresado el receptor de eritropoyetina, lo que permite la fácil visualización del compromiso del linaje eritroide. Usando este método, YFP (EpoR +) las células positivas están presentes tan pronto como cinco días después de la transducción de señales. Este protocolo, por lo tanto, ofrece una técnica rápida y robusta para la generación de progenitores eritroides en vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM sin piruvato de sodio</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>Medios de cultivo para células PhGP</td></tr><tr><td>DMEM con piruvato de sodio</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Medios de cultivo para fibroblastos de la punta de la cola</td></tr><tr><td>StemSpan Medios de expansión libres de suero (SFEM)</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>9650</td><td>Medios de reprogramación&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino HyClone GE</td><td>Life Sciences</td><td>SH30071.03HI</td><td>Factor de crecimiento</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina HyClone (100x)</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SV30010</td> Aminoácidos no esenciales <td>antiboióticos</td></tr><tr><td>(100x)</td><td>Los medios Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td>SNL se complementan con este</td></tr><tr>agente de <td>disociación celular</td> <td>Trypsina HyClone (1x)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30042.01</td></tr><tr><td>Factor de Células Madre Murinas (mSCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>Añadido a los medios de reprogramación</td></tr><tr><td>Murine Recombinant Il-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td>Añadido a los medios de reprogramación</td></tr><tr><td>Eritropoyetina recombinante humana (hrEPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>Añadido a los medios de reprogramación</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>50-02-2&nbsp; &nbsp;</td><td>Añadido a la reprogramación de medios</td></tr><tr><td>Gelatina de piel de cerdo</td><td>Sigma</td><td>9000-70-8&nbsp;</td><td>Dissovled en dH2O y utilizado para el recubrimiento de placas. Asegurar la esterilidad antes de su uso.</td></tr><tr><td>Blasticidina S clorhidrato Sigma</td><td></td><td>3/9/3513</td><td>Antibiótico de selección. Afecta tanto a las células pro- como a las eucariotas</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Ge Life Sciences</td><td>SH30850.03</td><td>Utilizado para las etapas de lavado</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>Infección / Transfección&nbsp; Reactivo</td></tr><tr><td>FuGENE HD Reactivo de transfección</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Reactivo de transfección para la línea celular</td></tr><tr><td>PhGP Unidad de filtro de jeringa Millex-GP 0.22 y micro; m</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td>Se utiliza para filtrar el sobrenadante</td></tr><tr><td>de virus BD Esmeralda Jeringa hipodérmica</td><td>Becton Dickinson</td><td>SKU: 307736</td><td>Se utiliza para filtrar el sobrenadante de virus</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Placa de cultivo celular</td></tr><tr>de<td>6 pocillos</td><td>Falcon</td><td>10799541</td><td>Cell</td></tr><tr><td>Culture Pinza de joyero #5</td><td>Sklar</td><td>66-7642</td><td>Utilizado para manipulación de pequeños fragmentos de cola</td></tr><tr><td>Tijeras de iris Sklarlite</td><td>Sklar</td><td>23-1149</td><td>Se utiliza para cortar la cola en trozos pequeños</td></tr><tr><td>Kit de depleción de células de linaje, ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Para la depleción de células hematopoyéticas en cultivos de fibroblastos</td></tr><tr><td>CD117 MicroBeads, ratón</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-224</td><td>Para la depleción de células hematopoyéticas en cultivos</td></tr> <tr><td>de fibroblastosCélulas PheonixGP</td><td>ATCC</td><td>CRL-3215</td><td>línea celular de empaquetamiento retroviral</td></tr><tr><td>vector EcoPAC (pCL-Eco)&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-29540</td><td>vector auxiliar retroviral que contiene genes gag y pol</td></tr><tr><td>pMX-Gata1</td><td>Clonado en laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-Tal1</td><td>Clonado en laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-Lmo2</td><td>Clonado en laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMX-cMyc</td><td>Clonado en laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software CellSens Standard 1.6&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Software de análisis Cytospin</td></tr></tbody></table>

directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Diferenciación y compromiso de la célula eritroide proceden a través de la activación de una red transcripcional restringida linaje orquestada por un grupo de destino de la célula determinar y factores de maduración. Nos propusimos previamente para definir el conjunto mínimo de factores necesarios para instruir el desarrollo de glóbulos rojos con linaje directo la reprogramación de fibroblastos en inducido progenitores/los precursores eritroides (iEPs). Hemos demostrado que la sobreexpresión de Gata1, Tal1, Lmo2y c-Myc (GTLM) pueden rápidamente convertir murinas y humanas fibroblastos directamente al iEPs que se asemejan a las células eritroides de bona fide en términos de morfología, fenotipo, y expresión génica. Pretendemos que el iEPs proporcionará una valiosa herramienta para estudiar la regulación sino la eritropoyesis y de la célula. Aquí describimos el proceso gradual de conversión de fibroblastos de ratón cola punta en iEPs mediante transcripción basada en el factor directo linaje reprogramación (DLR). En este ejemplo, realizamos la reprogramación de fibroblastos de ratones de seguimiento del linaje eritroide que expresan la proteína amarilla fluorescente (YFP) bajo el control del promotor del gene (EpoR) receptor eritropoyetina, lo que permite la visualización de células eritroides inducción de destino sobre la reprogramación. Siguiendo este protocolo, pueden ser reprogramados fibroblastos en iEPs dentro de cinco a ocho días.
Mientras que todavía pueden introducirse mejoras al proceso, mostramos que GTLM-mediada reprogramación es un proceso rápido y directo, produciendo células con propiedades de buena fe las células progenitoras y precursoras eritroides.

Aquí presentamos un protocolo reproducible para la producción de iEPs de fibroblastos adultos usando transcripción factor-driven DLR. Evaluamos la reprogramación celular mediante citometría de flujo, formando Colonia ensayos y gen análisis de expresión. Para ayudar en la visualización de la conversión a destino de la célula eritroide, realizamos la reprogramación en fibroblastos de los ratones de seguimiento del linaje eritroide (Epor- Cre R26- eYFP) que expresan la prot...

Presentamos nuestro protocolo para producir inducida por progenitores eritroides (iEPs) de fibroblastos adultos ratón usando transcripción basada en el factor dirigen linaje reprogramación (DLR).

Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Reprogramación directa de linajes de fibroblastos a células progenitoras de eritroide. Es un nuevo método que hemos desarrollado en nuestro laboratorio con el fin de estudiar mejor los procesos de regulación transcripcional que determina el destino de las células eritroideas. La principal ventaja de utilizar la reprogramación directa del linaje para estudiar el desarrollo es que es una técnica muy sencilla.Así que en comparación con, por ejemplo, la pérdida de estudios de función dentro de ratones knockout, aquí podemos manipular muy fácilmente el factor, sobre-expresarlo en el punto de tiempo determinado, y luego obtener fácilmente suficiente material para estudiar efectos aguas abajo como modificaciones de cromatina o cambios en la expresión génica. Mientras que este método se centra en la reprogramación de fibroblastos de punta de cola de ratón a progenitores de eritroides, también se puede aplicar a otros tipos de células de fibroblastos, y a otros organismos incluyendo a los seres humanos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la medicina transfusional, ya que allana el camino hacia la producción de glóbulos rojos in vitro.Demostrando el procedimiento estará Alban Johansson de mi grupo de investigación. Comienza cubriendo la superficie de los platos con 0,1%gelatina. Incubarlos a 37 grados centígrados durante aproximadamente 20 minutos.Aspirar la solución de gelatina y dejar que los platos se sequen. Utilice tijeras para cortar en la base de la cola de un ratón eutanizado para quitarlo. Coloque la cola en DPBS con 2%FBS hasta que esté listo para usar.En una capucha de cultivo de tejido en condiciones estériles, preparar una solución diluida de trippsina de 0.02%trypsin EDTA en DPBS y añadir 5 mililitros en un plato de 10 centímetros sin recubrimiento. En una capucha de cultivo de tejido, lave la cola en suficiente 70%etanol en un tubo de 15 mililitros para cubrirla y luego en DPBS. Coloque la cola plana en un plato y use fórceps para mantenerla en su lugar.Utilice un bisturí para hacer una incisión en la cola a lo largo de su eje longitudinal desde la base hasta la punta. Usa un par de fórceps para agarrar la cola y sostenerla verticalmente y usa un segundo par para agarrar la piel junto a la incisión en la base de la cola y pelarla hacia atrás. Realice esto a ambos lados de la incisión hasta que la piel se pueda pelar tirando hacia abajo hacia la punta de la cola.Sostenga la cola pelada con fórceps sobre el plato que contiene la solución de trippsina. Utilice tijeras de disección para cortar la cola en trozos pequeños. Use tijeras para fragmentar estas piezas en la solución de la trippsina en trozos aún más pequeños y luego incubar a 37 grados Centígrados durante 10 minutos.Para apagar la tripín, añadir dos volúmenes de medio FEX, DMEM con suplementos y antibióticos. Recoger todo el contenido del plato en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet que contiene los fragmentos de cola en 10 mililitros de medio FEX fresco. Transfiera esta suspensión a un plato recubierto de gelatina. Incubar a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono y 4%oxígeno, añadiendo un medio FEX fresco cada dos días.Observar el cultivo después de cinco a siete días, en los que los fragmentos de cola se han unido en la parte inferior del plato, y los fibroblastos se están alejando de ellos. Una vez que los racimos de fibroblastos sean visibles, agita suavemente el plato para desalojar las piezas de la cola. Aspirar el medio con todos los fragmentos óseos, dejando los fibroblastos unidos a la placa.Añadir 10 mililitros de medio FEX fresco y cultivar los fibroblastos hasta que se confluen. Para asegurarse de que no haya contaminación por progenitores hematopoyéticos en el cultivo de fibroblastos, disociar las células de la placa utilizando la trippsina EDTA como se describe en el manuscrito. Añadir medio y recoger las células, y añadir cuentas magnéticas con anticuerpos.Utilice un sistema de separación magnética para eliminar las células que expresan marcadores hematopoyéticos. Incluir este paso es absolutamente vital porque elimina cualquier HSPC que pueda estar presente en la cultura y, por lo tanto, la probabilidad de falsos positivos el día del análisis FACS. Células de envasado retroviral de semillas a aproximadamente 25.000 células por centímetro cuadrado en un plato tratado con cultivo de tejido.Incubar las células en DMEM de alta glucosa a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante la noche. A la mañana siguiente, retire el medio y agregue la mitad del volumen utilizado para cultivar durante la noche de DMEM sin aditivos. Por la tarde, revise las celdas para 70 a 80% de confluencia requerida para la transfección.Comience la transfección preparando una mezcla de dos a uno de seis microgramos del vector de expresión PMX y tres microgramos del vector auxiliar que contiene los genes Gag, Pol y envelope para cada factor de reprogramación. A continuación, para cada factor de reprogramación, agregue 300 microlitros de DMEM de temperatura ambiente en un tubo de poliestireno estéril. A continuación, añada cuidadosamente 27 microlitros de reactivo de transfección comercial a temperatura ambiente directamente en el medio para evitar el contacto con la pared del tubo.Añadir la mezcla de plásmido en el reactivo de transfección que contiene el tubo. Vortex brevemente e incubar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente. Vórtice la mezcla de ADN del reactivo de transfección de nuevo.Añádalo por gota a las células de envasado retroviral para que se extienda uniformemente sobre el cultivo e incubar a 37 grados centígrados. 24 horas después de la transfección, retirar el medio y añadir DMEM con 20%FBS y 100 unidades por mililitro penicilina estreptomicina. 48 horas después de la transfección, recoger el sobrenadante y filtrarlo a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros tamaño poro.Comience la transducción sembrando los fibroblastos de la punta de la cola a 10.000 células por centímetro cuadrado en 0.1%gelatina platos pre-recubiertos en medio FEX. Incubar a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al llevar a cabo este paso, es importante añadir los cuatro sobrenadantes retrovirales a la misma proporción para garantizar que los cuatro transgenes contribuyan por igual al proceso de reprogramación.Al día siguiente, preparar una mezcla de transducción añadiendo primero un volumen de sobrenadante viral para cada factor de reprogramación complementado con cuatro microgramos por mililitro de reactivo de infección retroviral a seis volúmenes de medio FEX. Después de eso, aspirar el medio FEX del cultivo de fibroblastos y añadir la mezcla de transducción. Incubar la reacción de transducción durante cuatro horas a 37 grados centígrados en condiciones hipoxiales con un 5% de dióxido de carbono y un 4% de oxígeno.Después de cuatro horas, aspirar la mezcla de transducción y añadir un nuevo medio de reprogramación. Incubar a 37 grados centígrados en condiciones hipoxiales durante ocho días, añadiendo un nuevo medio de reprogramación cada dos días. Observe la reprogramación exitosa con racimos producidos de células desprendidas de la placa.Para cosechar las células reprogramadas del plato para su posterior análisis, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo y luego recoja las células. Después de la reprogramación exitosa de iEP, las células positivas de YFP son observables tan pronto como cinco días después de la transducción. Se vuelven redondos, se levantan de la superficie de la placa, comienzan a formar racimos y muestran una morfología similar a un precursor de los eritroides.La hemoglobinización de algunas células es evidente por la tinción positiva de benzidina. Una pequeña fracción expresa el marcador de superficie específico de eritroide TER-119. Para el octavo día, se pueden ver grandes clústeres positivos de YFP.Los iEP de día ocho tienen un fenotipo eritroid más diferenciado que el cinco iEP del día. Son significativamente más pequeños, han acumulado más hemoglobina, y muestran una mayor expresión de TER-119. El análisis de la expresión génica por qPCR de iEP recogidos en el día ocho muestra que casi han apagado la expresión de genes de fibroblastos y han regulado al máximo muchos genes eritroides.Después de realizar ensayos formadores de colonias de BFU-e en las células reprogramadas, el día ocho iEP forman dos tipos de colonias, claramente rojas y no visiblemente rojas. Mientras que las células de las colonias rojas mostraban morfología eritroblasta, las células de colonias no rojas no lo hacían. Aproximadamente una de cada 1.000 días cinco iEPs formaron colonias rojas, mientras que sólo aproximadamente una de cada 10.000 colonias se formó a partir del día ocho iEPs.La eficiencia de reprogramación de fibroblastos o TTF de la punta de cola está influenciada por el número de pasaje. Los TTF que habían sido contados nueve veces mostraron una reducción dramática en la capacidad de producir grupos de iEP en comparación con las células que habían sido pasajes tres veces. Además, las diferentes condiciones de cultivo pueden afectar a la eficiencia de la reprogramación.Los TTF transducidos cultivados en la normoxia son mucho más lentos de reprogramar y los grupos del IEP se observan después de 10 días en lugar de cinco a ocho días. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar métodos como ensayos formadores de colonias, análisis qPCR y FACS para determinar el estado de diferenciación celular. Desde su desarrollo, esta técnica está allanando el camino para los investigadores en el campo de la eritropoyesis en la comprensión del cambio entre las células eritroides primitivas y definitivas en el ratón y el ser humano.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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