Name: Inmunización de Alpacas (Lama pacos) con antígenos de la proteína y la producción de anticuerpos de dominio único antígeno específico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprenda a producir anticuerpos de dominio único en alpacas mediante inmunización con antígenos y aislamiento de linfocitos. Este método permite generar anticuerpos específicos contra hasta cinco proteínas distintas en un solo animal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (P30GM103486).

<ol><li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunopharmacology+and+Immunotoxicology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li>
<li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li>
<li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpaca+%28Lama+pacos%29+as+a+convenient+source+of+recombinant+camelid+heavy+chain+antibodies+%28VHHs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs).</a> Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+Nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).</li>
<li>Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+M13+phage+display%3A+M13+phage+display+in+identification+and+characterization+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).</li>
<li>Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+phage+display+and+affinity+selection+using+recombinant+protein+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50685(2014).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).</li>
<li>Muyldermans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camelid+immunoglobulins+and+nanobody+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Camelid immunoglobulins and nanobody technology.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23495938">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).</li>
<li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments%3A+the+superfluous+luxury+of+paired+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody-derived+nanobiotechnology+tool+kits+for+diverse+biomedical+and+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).</li>
<li>Van Saun, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+assessing+nutritional+status+in+camelids%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).</li>
<li>Jones, M., Boileau, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19460638">Camelid herd health.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).</li>
<li>Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+monoclonal+antibodies+in+functional+and+comparative+investigations+of+heavy-chain+immunoglobulins+in+new+world+camelids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).</li>
<li>Romao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Useful+Nanobodies+by+Phage+Display+of+Immune+Single+Domain+Libraries+Derived+from+Camelid+Heavy+Chain+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).</li>
<li>Henry, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+TGF-beta-neutralizing+single-domain+antibodies+of+predetermined+epitope+specificity+using+next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).</li>
<li>Burg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Structural+basis+for+chemokine+recognition+and+activation+of+a+viral+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor.</a> Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).</li>
<li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies%3A+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li>
</ol>

Los doctores Whiteheart y Hersh en la Universidad de Kentucky y funcionan un núcleo en el centro de Medicina Molecular que produce anticuerpos de dominio único en alpaca como un cargo por servicio.

Como se señaló, la alta afinidad y especificidad de anticuerpos de dominio único, combinado con su fácil expresión y estabilidad, hacen reactivos ideal para las aplicaciones en la investigación biomédica, como reactivos bioquímicos críticos, herramientas de diagnóstico, o agentes terapéuticos18. Para aplicaciones comerciales, hay alguna propiedad intelectual relacionados con las cuestiones que debe considerarse. Además, anticuerpos de dominio único pueden ser diseñados para contener marcadores específicos o etiquetas que pueden usarse como reporteros en ensayos celulares o en el diagnóstico. La clave para estos usos es la capacidad de producir anticuerpos de dominio único específicos contra los antígenos de interés. Un método se describe aquí para producir anticuerpos de dominio único con alpacas, que produce una respuesta inmune robusta contra una amplia variedad de antígenos de la proteína. Se describen las consideraciones para el manejo de animales y el cumplimiento. Estas son clave para el éxito en esta parte del proceso.
Hay otras estrategias para la producción de anticuerpos de dominio único que no requieren la vacuna, pero en su lugar, utilice las bibliotecas semisintéticas con diferentes sistemas para la selección y optimización iterativo de afinidades19,20 . Sin embargo, la ventaja de usar bibliotecas derivadas animales vacunados es la capacidad de aislar confiablemente anticuerpos de dominio único altamente enriquecido, diversa y alta afinidad. Además, no sólo se observan variaciones de secuencia significativa, pero una mayoría significativa de anticuerpos de dominio único específico aislado tenía únicas inserciones y canceladuras, particularmente en CDR3.
Dominio adicional, solo los anticuerpos se pueden producir mediante un proceso sencillo que sólo requiere pequeñas inyecciones del antígeno y después de este proceso, los animales pueden devolverse a la manada. De nota, el animal puede utilizar libremente para la producción de fibra, pero debe excluirse del uso como carne (cadena de alimento humana) debido al uso de la prueba de antígenos y adyuvantes aprobados FDA no para la producción de anticuerpos de dominio único. Cuando haya completado el procedimiento, los animales deben ser supervisados para una semana, dado un examen veterinario y luego pueden ser regresó a su hogar granja o descansados durante seis meses antes de otra ronda de producción de anticuerpos de dominio único.

Alpacas y otros miembros de la familia de los camélidos, se han convertido en una fuente popular para generar anticuerpos para investigación biomédica1,2,3. Camélidos tienen un sistema inmunológico único que producen anticuerpos normales así como de la pesado-cadena sólo los anticuerpos que permiten la producción de anticuerpos de dominio único mucho más pequeños, manteniendo alta especificidad y alta afinidad. Anticuerpos de camélidos ofrecen un reactivo versátil útil para una variedad de propósitos. Aquí se describe un método para inmunizar alpaca y producir anticuerpos de dominio único a una variedad de antígenos de la proteína. Estos anticuerpos se pueden producir en camélidos a través de un proceso relativamente sencillo que sólo requiere la inmunización a través de pequeñas inyecciones de la proteína diana (antígeno) y un drenaje de sangre4. Posteriormente, construcción de biblioteca, M13 phage display5 y panorámica frente el antígeno recombinante6 se utiliza para aislar y producir anticuerpos de dominio único con las características deseadas. Porque el proceso toma ventaja del poder de la tecnología de visualización de fagos, cinco o más antígenos se pueden utilizar simultáneamente por animal, reduciendo el número de animales utilizados y los costes asociados.
Típico mamíferos anticuerpos o inmunoglobulinas son moléculas grandes que consisten en dos tipos de cadenas (2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras), que se unen por enlaces disulfuro. Estos anticuerpos son relativamente grandes, que los pesos moleculares de ~ 140-190 kDa para la especie más abundante de IgG de los seres humanos, ratones, cabras y conejos. Debido a su estructura de multi-subunidades, alto peso molecular y enlaces disulfuro, las inmunoglobulinas pueden ser algo difíciles de producir en grandes cantidades, haciendo su costo alto. En la década de 1990, se descubrió que hacen camélidos, que incluyen camellos, llamas y alpacas, además de la inmunoglobulina de tipo mamífero típico, una forma nueva de la inmunoglobulina que es más simple en estructura, que poseen cadenas pesadas solamente7. Estos anticuerpos únicos camélidos poseen la misma capacidad para atar específicamente sustancias extrañas con alta afinidad, pero sólo se componen de una proteína de cadena8. Además, camélidos anticuerpos pueden truncarse experimentalmente a un fragmento de unidad la VHH aún más pequeño, que también se llama un dominio único anticuerpo9. Debido a su pequeño tamaño, anticuerpos de dominio único son útiles para una amplia gama de aplicaciones de la investigación biomédica y están disponibles en una variedad de fuentes académicas y comerciales1,10. Una excepción parece ser el borrar occidental ya que anticuerpos de dominio único más a menudo dirigidos contra epitopos dependiente de conformación, que generalmente se pierden en las condiciones de desnaturalización en manchas blancas /negras occidentales.
Puesto que se componen de una cadena polipeptídica única, anticuerpos de dominio único específico pueden ser seleccionados y producidos fácilmente en cantidades grandes como proteínas recombinantes en bacterias. Anticuerpos de dominio único también pueden ser genéticamente modificados para contener marcadores específicos o etiquetas que pueden ser utilizadas como "grupos de reportero" para diagnosticar enfermedades11. Esta facilidad de manipulación junto con su flexibilidad de uso hace anticuerpos de dominio único un recurso importante para los investigadores en universidades y otros lugares.
Como parte de un Instituto Nacional de salud base, los métodos existentes se han adaptado a producir anticuerpos de dominio único de alpacas3,4. Alpacas tienen ventajas significativas en tanto facilidad de manejo en relación con los más grandes miembros de la familia camélidos así como accesibilidad. Alpacas se crían extensamente para la fibra y carne y así pueden obtenerse regionalmente de los agricultores locales de alpaca, que pueden ser identificados a través de sus sitios web o a través de asociaciones de criadores de estado. Existen dos razas de alpacas Suri y Huacaya. Huacaya son más comunes y utilizados para este protocolo, pero el protocolo es generalmente aplicable a cualquiera de los dos razas y también más ampliamente aplicable a otros camélidos.

<table><tbody><tr><td>GERBU FAMA adyuvante</td><td>Biotechnik, Heidelberg, Alemania&nbsp;</td><td>3003,6001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de extracción de suero</td><td>Becton Dickinson</td><td>367983</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de extracción de sangre</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer Set de extracción de sangre</td><td>Becton Dickinson</td><td>368652</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp Placas inmunológicas</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG anti-llama de cabra conjugado con HRP&nbsp;</td><td>Bethyl Labs</td><td>A160-100P TMB reactivo</td><td></td></tr><tr><td>cromogénico peroxidasa sustrato&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-76-03</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Spectramax</td><td>M5</td><td>Cualquier lector compatible con UV/VIS es aceptable</td></tr><tr><td>Tubo de separación de linfocitos Uni-SepMAXI+</td><td>Novamed</td><td>U-17</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>QIAcolumna de trituración</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV transcriptasa inversa&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>solución AEBSF</td><td>Biosynth</td><td>A-5440</td><td></td></tr><tr><td>TG1 visualización de fagos células competentes</td><td>Lucigen</td><td>60502</td><td></td></tr></tbody></table>

inmunización de alpacas (lama pacos) con antígenos de la proteína y la producción de anticuerpos de dominio único antígeno específico

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

En este manuscrito, un método para la inmunización de alpaca y el uso de métodos de biología molecular para producir anticuerpos de dominio único antígeno-específica es descrito y demostrado. Camélidos, alpacas y llamas, se han convertido en un recurso valioso para la investigación biomédica ya que producen un nuevo tipo de anticuerpo sólo cadena pesado que puede utilizarse para producir anticuerpos de dominio único. Porque el sistema inmune es altamente flexible, anticuerpos de dominio único se pueden hacer a muchos antígenos proteicos diferentes y hasta diferentes conformaciones del antígeno, con un alto grado de especificidad. Estas características, entre otros, hacen anticuerpos de dominio único una herramienta invaluable para la investigación biomédica. Se divulga un método para la producción de anticuerpos de dominio único de alpacas. Se describe un protocolo para la vacunación, recolección de sangre y aislamiento de células B. Las células de B se utilizan para la construcción de una biblioteca inmunizada, que se utiliza en la selección de anticuerpos de dominio único específico vía panorámica. Anticuerpos de dominio único específico supuesto obtenidos vía panorámica son confirmados por pull-down, ELISA y ensayos de cambio de gel. Los anticuerpos de dominio único que pueden utilizarse directamente o como parte de un reactivo de ingeniería. El uso de anticuerpos de dominio único y regentes basados en anticuerpos de dominio único incluye aplicaciones estructurales, bioquímicas, celulares, en vivo y terapéuticas. Anticuerpos de dominio único se pueden producir en grandes cantidades como proteínas recombinantes en sistemas de expresión procariotas, purificados y utilizados directamente o pueden ser diseñados para contener marcadores específicos o etiquetas que pueden usarse como reporteros en estudios celulares o en diagnóstico.

El protocolo presentado aquí fue utilizado para generar anticuerpos de dominio único contra una variedad de antígenos de la proteína. Se utilizaron cinco antígenos por alpaca. Vigilancia inmune indica que la mayoría de los antígenos demostraron principio respuesta robusta en tres semanas (figura 1). Sangrados de la producción y la construcción de la biblioteca después de aproximadamente seis semanas da el mejor balance para los animales tienen múltiples antígenos inyectados. Dos rondas de bateo fueron realizadas para cada antígeno y aisladas colonias proyectadas (figura 2). La secuencia de las colonias positivas había identificado diversos dominio único anticuerpo secuencias para los antígenos diferentes. Por ejemplo, tres únicos clones fueron aislados para el antígeno de referencia maltosa vinculante proteínas (MBP) (Figura 3A). Como se observa con frecuencia, los anticuerpos de dominio único contienen diversidad de secuencia significativa o altamente variable CDR3 longitud (figura 3). Estas características son especialmente importantes en las interacciones antígeno anticuerpo de dominio solo como se ve en la referencia solo dominio anticuerpo/CX3CL1 complejo17 (figura 3B).
La mayoría de las secuencias de anticuerpos de dominio único larga duración puede ser expresada y purificada en 1-10 mg/L de cultivo (Figura 4A). Debido a la diversidad de longitud CDR3, anticuerpos de dominio único diferentes muestran ligera variación en peso molecular. Confirmación de enlace directo y performance específico de las aplicaciones es fundamental. Por ejemplo, después de dos rondas de selección contra el antígeno B, un panel de dominio solo anticuerpos fueron identificados (figura 2). Se identificaron varias secuencias idénticas, y los anticuerpos de dominio único fue producido y purificado. Luego fue había probado mediante extracción directa hacia abajo con la resina de afinidad antígeno y mostró robusto enlace dependiente de la dosis (Figura 4B). Lo importante, los anticuerpos de dominio único no demostraron vinculante para el control de la resina. Estos datos demuestran una interacción directa de la Unión y que está bien adaptado para la captura de afinidad en formato desplegable y basada en ELISA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> Figura 1 : Vigilancia inmune representativas de dos antígenos diferentes que muestran la significativa respuesta inmune específica a antígenos distintos en el mismo animal. Muchos antígenos muestran una robusta respuesta tan pronto como tres semanas después de comenzar la inmunización, con la mayoría que muestran respuesta máxima después de seis semanas. Seis semanas también permite la maduración de la afinidad y es el tiempo recomendado para la purga de la producción y el aislamiento de células B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> Figura 2 : Confirmación basada polimerización en cadena de los clones positivos. Imprimaciones abarcan el MCS del vector pMES4, y un clon nanobody positiva produce un amplicón de ~ 500 bp (marcados con *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> Figura 3 : Secuencias específica de antígeno destacan diversidad de anticuerpos de dominio único alpaca. (A) alineación de seleccionar dominio único anticuerpo secuencias aisladas a MBP con un solo dominio referencia anticuerpo 4XT1, con marco y regiones determinantes de complementariedad (Kabat) destacadas a continuación. (B) estructura de alpaca 4XT1 de anticuerpos de dominio único limitado a CX3CL1 (PDB 4XT1), destacando el papel fundamental de CDR variable bucles en el atascamiento del antígeno específico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> Figura 4 : Purificación y validación de anticuerpos de dominio único. (A) SDS-PAGE de anticuerpos de dominio único IMAC purificada, comparación de anticuerpos de dominio único diversos. Distintos pesos moleculares son principalmente debido a la diversa duración del bucle CDR3. También se observan diferentes niveles de expresión, con una minoría de anticuerpos de dominio único con bajos rendimientos de proteína purificada. (B) verificación de enlace directo con afinidad antígeno hacia abajo. Unión de anticuerpos robusto dominio único dependiente de la dosis se observa con la resina de acoplamiento antígeno pero no con resina de control. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Un método para la producción de anticuerpos de dominio único de alpacas, incluyendo vacunación, recolección de sangre, células B aislamiento y selección se describe.

Inmunización de Alpacas (Lama pacos) con antígenos de la proteína y la producción de anticuerpos de dominio único antígeno específico

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Los métodos que describimos aquí fueron adoptados por nuestro NIH COBRE patrocinado, University of Kentucky Protein Core Facility para ayudar a los investigadores a producir anticuerpos de un solo dominio en alpacas. Los anticuerpos de un solo dominio son una herramienta importante que se utiliza para responder a preguntas clave en la investigación biomédica. La principal ventaja de las técnicas que demostramos es que permite la producción de anticuerpos de un solo dominio a hasta cinco proteínas distintas en una sola alpaca.Las implicaciones de esta técnica se extienden a la salud humana y al tratamiento de enfermedades, ya que estos anticuerpos de un solo dominio pueden utilizarse como terapias, como vacunas y como diagnósticos. El obstáculo más significativo para la mayoría de los investigadores biomédicos establecidos es el manejo de animales grandes, como la alpaca. La demostración visual del manejo de una alpaca, la inyección de antígenos y la acumulación de sangre son fundamentales para la producción exitosa de anticuerpos de un solo dominio en estos camélidos.Demostrando el procedimiento estarán el Doctor Jeff Smiley, Veterinario De la Universidad, la Sra. Kathy Boaz, Técnico Veterinario, y la Sra. Erin Jones, Técnico de Animales de Laboratorio. El manejo de la sangre será demostrado por el Doctor Martin Chao, Investigador Asociado. Las historias reales de esta producción son Blue Eyes, Big Boy, o cariñosamente conocido como el Gorila, y Freddie, nuestras alpacas de Kentucky.Para empezar, sujeta al animal con un halter y plomo. Luego recorta el cabello de la alpaca con cortadoras eléctricas en un patrón lunar creciente a lo largo de la base de su cuello, de hombro a hombro. Sostenga cuidadosamente la alpaca por la cabeza y el cuello, e inyecte lentamente los antígenos por vía subcutánea con una aguja de calibre 22 a lo largo de la base del cuello, cerca de los ganglios linfáticos del arco.Realizar cinco inyecciones de aproximadamente 200 microlitros cada uno, a unos cinco centímetros de distancia. Después de esto, monitoree al animal durante unos 20 minutos en busca de signos de anafilaxia. Inspeccione el lugar de inyección en busca de inflamación localizada en los lugares de inyección semanalmente.Para extraer sangre, corta el cabello de la alpaca y desinfecta el sitio de recolección con hisopos de alcohol. Sujeta la alpaca suavemente, asegurándote de que el cuello esté erguido y recto. Usando las proyecciones ventrales del proceso transversal de las vértebras como un punto de referencia, ocluir la vena aplicando presión sólo medial al proceso ventral.A continuación, inserte la aguja en un ángulo de 45 grados, ligeramente medial a la proyección, hacia el centro del cuello. Manipule la aguja hasta que fluya la sangre. Primero, diluir 15 mililitros de sangre recolectada con cinco mililitros de PBS.Luego, pipetea sangre en un tubo de separación de linfocitos para aislar linfocitos sanguíneos periféricos, o PBL, a través de la centrifugación de gradiente de densidad. Retire suavemente la capa plasmática superior, guardándola en un tubo separado. A continuación, retire suavemente la capa PBL y transfiérala a un tubo estéril de 50 mililitros.Agregue 45 mililitros de PBS preenfriados a los PBL y gire el tubo durante 20 minutos a 800 veces G y cuatro grados Centígrados. Retire el sobrenadante con una pipeta, dejando el pellet que contiene los linfocitos. Lave el pellet dos veces más con cinco mililitros de PBS pre-refrigerados para preparar los PBL para el aislamiento de ARN.Con este protocolo, se generaron anticuerpos de un solo dominio contra una gama de antígenos proteicos. El monitoreo inmune indicó que la mayoría de los antígenos mostraron una respuesta robusta a partir de las tres semanas, y que el momento óptimo para obtener sangre es en seis semanas. La secuenciación de las colonias positivas identificó diversas secuencias de anticuerpos de un solo dominio para diferentes antígenos.Por ejemplo, tres colonias únicas se aislaron a la proteína de unión a la maltosa del antígeno de referencia. Generalmente, los anticuerpos de un solo dominio contenían una diversidad de secuencia significativa y una longitud muy variable de bucles de unión a antígenos. Estas características son particularmente importantes en las interacciones de antígenos de anticuerpos de un solo dominio.Este procedimiento permite la producción de anticuerpos de un solo dominio para hasta cinco antígenos por animal. Una sola colección de sangre, y la construcción de la biblioteca, se utiliza para cada animal. Con la selección basada en la pantalla del fago utilizada para identificar anticuerpos de cadena única específicos del antígeno.Mientras se hacen las inyecciones de antígeno y el muestreo de sangre, es importante mantener las alpacas en un grupo, lo que los mantiene más tranquilos. Esto se puede hacer usando halters y leads, y atando en las proximidades durante los procedimientos.

immunization-alpacas-lama-pacos-with-protein-antigens-production

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Ciertas cepas de ratón son capaces de resistir la inducción de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) con proteína básica de mielina. Aquí se describe es un protocolo de inmunización simple que invierte la falta de respuesta e induce la enfermedad paralítica en varios típicas manchas de EAE de ratón resistentes.

Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

La vacunación profiláctica y terapéutica a menudo falla para estimular respuestas inmunes fuertes debido a la semana de drenaje de la vacuna a los ganglios linfáticos y en consecuencia pobres implicación de células inmunes. Por inyección directa de la vacuna a los ganglios linfáticos, así llamada inyección intralinfática, eficacia de la vacuna puede ser fuertemente mejorada y dosis de la vacuna se puede reducir.

Intralinfática inmunoterapia y vacunación en ratones

Se presenta un protocolo optimizado para la generación de anticuerpos monoclonales basado en la tecnología de hibridomas. Los ratones fueron inmunizados con un inmunoconjugado. Las células del bazo se fusionaron mediante PEG y un impulso eléctrico con células de mieloma inmortal. Las células de hibridoma productoras de anticuerpos se seleccionaron mediante HAT y ELISA específico de antígeno.

Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación y evaluación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales para su uso en inmunoensayos diferentes. Este procedimiento incluye vacunación, fusión celular, indirecta ELISA competitivo para clon positiva proyección y preparación de hibridomas monoclonal. También se proporcionan las especificaciones para la caracterización de anticuerpos mediante MALDI-TOF-MS y los análisis de ELISA.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

Descrito es la preparación de nanopartículas liposómicos antigénicas y su uso en estimular la activación de células B en vitro e in vivo. Respuestas de anticuerpos consistente y robusto condujeron al desarrollo de un nuevo modelo de la alergia del cacahuete. El protocolo para la generación de liposomas antigénicas puede ampliarse a los diferentes antígenos y vacunas.

Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

El desarrollo de la prueba de interferón-gamma ELISpot para conejillo de Indias PBMCs permite la caracterización de las respuestas de células T en este modelo altamente relevante para el estudio de las enfermedades infecciosas. Hemos aplicado el ensayo para medir las respuestas de células T asociadas con entrega intradérmica de vacunas de ADN.

Optimizado de interferón-gamma ELISpot análisis a las respuestas de la célula de T de medida en el modelo de conejillo de Indias después de la vacunación

El ensayo de adhesión a opsono es un método alternativo al ensayo de muerte opsonótico-fagocítico para evaluar las funciones opsónicas de los anticuerpos en el desarrollo de vacunas.

Ensayo de adhesión a Opsono para evaluar anticuerpos funcionales en el desarrollo de vacunas contra la antrasis bacillus y otros patógenos encapsulados

Este artículo describe y demuestra la administración de vacunas intranasales y la colección de leche de los conejos lactantes (Cuniculus de Oryctolagus) como medios de evaluar inmunidad de la mucosa en un modelo traslacional apropiado de la inmunización maternal.

Inmunización intranasal y recolección de leche en estudios de inmunización materna en conejos blancos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)

La proteína de anticuerpo recombinante expresada en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y anticuerpos monoclonales producidos utilizando la tecnología tradicional de hibridoma puede reconocer y unirse a la proteína N aminopeptidasa porcina (APN).

Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina

Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) 35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.

Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Aprenda a producir anticuerpos de dominio único en alpacas mediante inmunización con antígenos y aislamiento de linfocitos. Este método permite generar anticuerpos específicos contra hasta cinco proteínas distintas en un solo animal.

Inmunización de Alpacas (Lama pacos) con antígenos de la proteína y la producción de anticuerpos de dominio único antígeno específico (Video) | JoVE Journal

Inmunización de Alpacas (Lama pacos) con antígenos de la proteína y la producción de anticuerpos de dominio único antígeno específico

Explorar más videos