Name: Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Aprende a generar células T CAR murinas CD19 mediante transducción retroviral para evaluar su eficacia terapéutica contra linfoma B A20 sinigénico en ratones BALB/c. Este protocolo permite comparar condiciones con y sin linfodepleción.

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Nos gustaría agradecer a Bloodwise por financiar esta investigación (grant 13031) y el Manchester CRUK biológica unidad, proyección de imagen y citometría y biología molecular base servicios recursos para apoyar este trabajo.

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</ol>

David Gilham trabaja para Celyad que participa en la producción de células T del coche. El resto de los autores no tienen nada que revelar.

Modelos de ratón syngeneic permiten pruebas de progresión de la enfermedad y la terapia mientras se mantiene un sistema inmune intacto. Esto es fundamental cuando se trata de terapias que interactúan con el sistema inmunitario y, en particular para los agentes inmunoterapéuticos.
El protocolo descrito aquí tiene dos flujos de trabajo fundamentales, el primero de ellos es modificar genéticamente células T de ratón para expresar coches. Esto requiere de 7 días desde el inicio a la validación de la transducción. Concomitante con la producción de células T del coche es el establecimiento de linfoma sistémico en ratones. Si la producción de células T auto no, o ser de calidad insuficiente, por lo general no hay suficiente tiempo para producir las células de reemplazo antes de ratones sucumben a linfoma. Por lo tanto es fundamental que los investigadores usando estos modelos exactamente realizan estudios de tumor de dosificación y enfermedad progresión para tiempo con éxito la producción de células T auto de administración terapéutica.
Típicas razones para la baja eficiencia de transducción de células T incluye eficiencia de transfección deficiente de las células del productor, normalmente causada por la pureza de plásmido pobre o incorrecta determinación del pH de los medios de comunicación de la transfección. Se recomienda comprobar la eficiencia de la transfección de la célula productora antes de proceder con el protocolo completo como transfección deficiente limita la eficiencia de la transducción de la célula de T. Fragmentos de fibronectina humana recombinante pueden ser recogidos y almacenaron a-20 ° C para su reutilización, sin embargo, múltiples resultado de congelar-deshiela en eficiencia de transducción reducida. Procesamiento rápido de bazos de ratón después de que colección es también importante para la obtención de altos rendimientos de células T viables.
Cabe señalar que el protocolo descrito aquí utiliza A20 células expresan luciferasa. Esto es preferido ya que le proporciona la capacidad para medir la carga del tumor sistémico por proyección de imagen de bioluminiscencia. Sin embargo, en presencia de un sistema inmune funcional, respuestas a luciferase podrían sesgar los resultados. Previamente hemos probado las reacciones inmunes de ratones con marcador los transgenes17de sobrevivir. Es clave para replicar experimentos claves A20 células libres de los transgenes a validar que estos no juegan un papel significativo en la erradicación del tumor por las células inmunes.
Mientras agentes clínicos sólo pueden ser usado en vivo en ratones deficientes inmune, el uso de células de ratón coche T contra las células cancerosas de ratón nos permite evaluar la contribución del sistema inmune a progresión de enfermedad o eficacia terapéutica. Este protocolo podría ser utilizado para la evaluación preclínica de coches dirigidos a linfoma de células B u otros coches con modificaciones tales como la secreción de IL-12 como se describe aquí. Debe ser observado que aunque la interacción entre las células inmunes puede ser evaluada en modelos de ratón syngeneic, pueden no exactamente recapitulan la interacción en los seres humanos en vivo. De particular cuenta, humano y ratón CARs puede variar en la estructura que puede tener consecuencias posteriores; activación y la célula cultura las condiciones óptimas para el crecimiento de las células T son diferentes20, distribución tisular de la expresión del antígeno objetivo puede variar entre los seres humanos y ratones y experimentado toxicidad puede ser radicalmente diferentes. Por lo tanto, es esencial utilizar ex vivo y xenogeneicos modelos para corroborar resultados.
En Resumen, el lymphoreplete modelo de linfoma y lymphodepleted syngeneic recapitulan a pacientes con y sin quimioterapia y radioterapia previa. Esto proporciona un sistema modelo en el que imitan la configuración clínica para permitir la prueba de una gama de estrategias terapéuticas que serán importantes con la próxima ola de nuevos agentes de terapia inmune.
Con el uso de acondicionamiento previo, se tendrá en cuenta que todos los ratones claro normalmente el linfoma. Con up a tasas de 90% de respuesta completa en los seres humanos, esto es representativo. Sin embargo, los retos para la terapia de células CD19 coche T dependerá evitar la alta frecuencia de recaídas observada que a menudo son CD19. Las recaídas han no se ha observado en este modelo hasta y a menudo más allá de 100 días. Modificaciones a las recaídas en la clínica podrían ayudar con los retos de futuro de la terapia de CD19 coche T-cell.

Terapia de células T antígeno quimérico del receptor (CAR) ha demostrado sorprendente éxito clínico en el tratamiento de CD19+ tumores malignos lleva a la aprobación de tisagenlecleucel para la leucemia linfoblástica aguda recidivante1 y axicabtagene ciloleucel para grandes progresiva de células B linfoma non-Hodgkin2 en 2017.
La importancia de las interacciones entre el cáncer y el sistema inmune en la progresión de la enfermedad y mecanismos terapéuticos se está convirtiendo en cada vez más reconocida3,4,5. Por ejemplo, está bien documentado que el microambiente del tumor (TME) es inundada con los factores que pueden suprimir las funciones efectoras de las células inmunes6,7,8. Alternativamente cebado de células inmunes endógenas y epitopo puede ser clave en la erradicación del tumor y la resistencia de largo plazo a tumor reto9,10. Ambos de estos fenómenos no se puede evaluar en los modelos xenogeneicos que carecen de un sistema inmune. Asimismo, sistemas de utilización de las proteínas transgénicas no reflejan con precisión el desafío de romper la tolerancia inmunológica necesaria para el epitopo que se separa de11,12. Por lo tanto, un modelo syngeneic con un sistema inmune completamente funcional es fundamental para el modelado de estos aspectos importantes de cáncer enfermedad progresión e inmune terapéutica.
Una advertencia importante de la terapia de coche T-cell es lymphodepleting acondicionamiento previo necesario para el éxito terapéutico13,14. Esto se consigue normalmente en los pacientes mediante la administración de quimioterapia antes de la infusión de las células de T de coche15,16. Como un método estándar, con el fin de imitar lymphodepletion utilizado en el entorno del paciente, administrar 5 Gy de irradiación de cuerpo entero (TBI) para lograr la lymphodepletion antes de la administración de células T auto terapéuticas ratones sistémico linfoma A20.
Lymphodepleting acondicionamiento previo no es un problema para la mayoría de los pacientes, toxicidad que viene con agentes quimioterapéuticos significa que pacientes del estado de bajo rendimiento no son elegibles para la terapia del coche T-cell. Para crear un sistema de prueba que representa a los pacientes elegibles para lymphodepletion, hemos establecido un modelo de ratón syngeneic de lymphoreplete en que modelo de terapia de coche T-cell del linfoma. En este modelo, demostró que la secreción de IL-12 desde dentro de las células de T automóvil podría conducir a la erradicación del linfoma establecido con una tasa de éxito de ~ 25%17. Por otra parte, demostramos que las células inmunes endógenas estaban involucradas en la erradicación del cáncer.
Aquí describimos en detalle el protocolo para la producción de células de ratón coche T, establecimiento de linfoma en ratones syngeneic y tratamiento del linfoma de células T de coche con o sin el uso de lymphodepleting acondicionamiento previo. Esto puede utilizarse para los estudios de combinación de células de T automóvil con otros agentes, prueba las células de T automóvil con otros transgenes o para el uso de otras estrategias de terapia o inmunoterapia celular adoptiva contra linfoma.

<table><tbody><tr><td>0,2 y micro; m filtro de jeringa</td><td>Appleton Woods</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro; m filtro de jeringa</td><td>Appleton Woods</td><td>FC122</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mortero y microtubo</td><td>VWR</td><td>431-0098</td><td></td></tr><tr><td>100X penicilina-estreptomicina-glutamina (PSG)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de blasticidina S</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de la parte superior de la botella (0.2 y micro; m)</td> <td>Suministros de laboratorio científico</td><td>FIL8192</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 anti-ratón CD8a Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>100759</td><td>dilución de tinción de 1 en 100. Clon 53-6.7</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 anti-ratón Anticuerpo CD4 BioLegend</td><td></td><td>100552</td><td>dilución de tinción 1 en 100. Clon RM4-5</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de recuento de células &ndash; CountBright cuentas de conteo absoluto</td><td>Sondas moleculares</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células 100&mu; m</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Ciclofosfamida Monohidrato</td><td>Merck</td><td>239785-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM) - Alta Glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-03</td><td>Vendido por Sigma-</td></tr><tr><td>Aldrich Citómetro de flujo - LSR Fortessa x20</td><td>BD Biosciences</td><td>658222R1</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Appleton Woods</td><td>HC001</td><td></td></tr><tr><td>Solución HEPES</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H0887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-12 p70 Kit de ELISA sin recubrimiento para ratón</td><td>Invitrogen</td><td>88-7121-76</td><td></td></tr><tr><td>IL2, Proleukin</td><td>Novartis</td><td>PL 00101/0936</td><td></td></tr><tr><td>in vivo sistema de imagen de bioluminiscencia &ndash; sistema de imagen in vivo xtreme II</td><td>Bruker</td><td>T149094</td><td></td></tr><tr><td>Ionomicina Sal de Calcio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Mancha viva/muerta - Zombie Violet Fixable Kit de Viabilidad BioLegend</td><td></td><td>423114</td><td>1 en 100 dilución de tinción</td></tr><tr><td>Luminómetro - Lumistart Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>415-301</td><td></td></tr><tr><td>Murine IFN-&gamma; Kit ELISA</td><td>Diaclone</td><td>861.050.010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP229540</td><td></td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Platinum E línea celular</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td>(RRID:CVCL_B488)</td></tr><tr><td>Hámster Hámster Puro Anti-Ratón CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td>Clon &nbsp; 37.51</td></tr><tr><td>Hámster purificado NA/LE Anti-Ratón CD3&épsilon;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>553057 Clon &nbsp; 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>dilución de tinción 1 en 100. Clon 2.4G2</td></tr><tr><td>Dihidrocloruro de Puromicina</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Fragmento de fibronectina humana recombinante - Reactivo RetroNectin</td><td>TaKaRa</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Ratón recombinante IL-7 (libre de portadores)</td><td>BioLegend</td><td>577806</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>eBioscience</td><td>004-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medio</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina - Solución de EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T3924&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo con ratones syngeneic células b linfoma de evaluación preclínica de las células de t automóvil cd19

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

El sorprendente éxito clínico de CD19 antígeno quimérico del receptor (CAR)-terapia con linfocitos T ha llevado a la aprobación de los receptores de antígeno quimérico de generación de dos segundos (coches) para el linfoma de la leucemia linfoblástica aguda (toda) andnon-Hodgkin (NHL). El foco del campo está ahora en emular estos éxitos en otras neoplasias hematológicas donde se observan menos impresionantes tasas de respuesta completa. Más ingeniería de las células de T automóvil o administración simultánea de otras modalidades del tratamiento puede superar con éxito obstáculos para la terapia acertada en otras configuraciones de cáncer.
Por lo tanto se presenta un modelo en el que otros pueden llevar a cabo pruebas pre clínicas de células CD19 coche T. Resultados en este modelo bien probado de linfoma de células B están probable que sean informativa terapia de coche T-cell en general.
Este protocolo permite la producción reproducible de ratón células de T de coche a través de la transfección del fosfato de calcio de las células de productor Plat-E con construcciones retrovirales MP71 y pCL-Eco plásmido de embalaje seguido de colección de partículas retrovirales secretadas y transducción de señales mediante centrifugación y fragmento de la fibronectina humana recombinante. Validación de transducción retroviral y confirmación de la capacidad de las células de T automóvil matar objetivo linfoma células ex vivo, mediante citometría de flujo, luminometry y enzima-ligado del inmunosorbente ensayo (ELISA), también se describe.
Protocolos para las pruebas de coche T células en vivo en lymphoreplete y ratones syngeneic lymphodepleted, linfoma sistémico, establecido se describen. Actividad contra el cáncer se controla por en vivo bioluminiscencia y enfermedad la progresión. Mostramos resultados típicos de la erradicación del linfoma de células B establecido al utilizar 1st o 2nd generación coches en combinación con acondicionamiento previo de lymphodepleting y una minoría de ratones lograr remisiones de largo plazo al utilizar coche T células que expresan IL-12 en ratones lymphoreplete.
Estos protocolos pueden utilizarse para evaluar las células CD19 coche T con diferentes modificaciones adicionales, combinaciones de células T de coche y otros agentes terapéuticos o adaptados para el uso de las células de T automóvil contra antígenos diferentes.

Para la transducción de alta eficiencia de células T, es necesario obtener partículas retrovirales frescas. Transfección de la línea celular de Plat-E con pCL-Eco productor plasmid y plásmido de retrovirus pMP71 da lugar a la secreción de partículas retrovirales en el sobrenadante de la célula. Cuando un gen marcador fluorescente, como mCherry, está codificado en los retrovirus, exitosa transfección puede confirmarse por microscopía de fluorescencia (figura 1). Sobrenadante que contiene el virus de células transfected Plat-E se utiliza para transducir las células T a través de 2 rondas de spin-fection de fibronectina fragmento recubierto de placas. La eficiencia de transducción puede determinarse 4 días post transducción mediante citometría de flujo. Con éxito transduced las células expresan el gen marcador codificado en los retrovirus (figura 2). Eficiencia de transducción entre ~ 50-90% de eficiencia con los receptores de primera generación a ~ 10-40% con el coche se construye cerca de la capacidad de empaquetado retroviral. Mientras que la expresión del gen marcador muestra transducción retroviral exitoso, es fundamental para mostrar la funcionalidad de las células de T de coche en relación con las células eso antígeno objetivo expresa en su superficie. Líneas de celulares objetivo modificadas para luciferase expres pueden utilizarse en luciferase ensayos para probar el grado de matar células por coche T las células directamente (Figura 3A). La liberación de citoquinas efectoras de las células de T de coche en co-cultivo con células blanco, determinadas por ELISA, también puede ser utilizada como una medida indirecta de la citotoxicidad de células T auto (figura 3B y 3C).
Las células de T automóvil producidas en el presente Protocolo pueden evaluarse en ratones lymphoreplete estableciendo sistémico linfoma A20 con una dosis de 100 mg/kg de ciclofosfamida (inyectado por vía intravenosa), 1 día antes de la inyección IV de las células 5 x 105 A20 (figura 4). Inyección de IP con captura de imagen y luciferin utilizando a un toner de bioluminiscencia en vivo puede utilizarse para monitorear la carga del tumor usando un tiempo de retorno de la inversión y la exposición constante a lo largo (figura 5A-C). Las células de T automóvil modificadas que expresa IL-12 son capaces de erradicar el linfoma sistémico con lymphodepleting acondicionamiento previo dando supervivencia libre de enfermedad en aproximadamente el 25% de los ratones (figura 5). Lymphodepleting preacondicionamiento, alcanzado por 5 Gy TBI 1 día antes de la administración IV de células T auto mejora considerablemente el engraftment (figura 6). En este modelo, las células de T automóvil de primera generación son capaces de erradicar el linfoma A20 sistémico, por lo general inducen la supervivencia libre de enfermedad en el 100% de los ratones (figura 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig1.jpg"> Figura 1. Confirmación de la exitosa transfección de células Plat E. PLAT-E las células transfected con retroviral construir coches y pMP71 y ADN de plásmido pcl-Eco packaging vector. Expresión del gen marcador fluorescente mCherry demuestran exitosa transfección. A) microscopía de campo brillante, B) microscopía de fluorescencia y C) se muestran imágenes combinadas. Magnificación = 50 X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig2.jpg"> Figura 2. Determinar la eficacia de transducción mediante citometría de flujo. Citometría de flujo se utiliza para determinar la eficiencia de la transducción de las células de ratón T el día 4 post de transducción, usando a UV Zombie vivo/muerto, mCherry, BV711 y BV785 para la detección de la vida, auto construir, las células CD4 y CD8, respectivamente. Resultados representativos de A) no-transduced, B) mCherry.αmCD19.mCD3z y C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 se muestra con compuerta de 1) 2 camisetas) vivir células 3) CD4 y CD8 4) y 5) evaluación de las células positivas mCherry expresando su coche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig3.jpg"> Figura 3. Validación de la actividad de células T auto. ΑmCD19 coche T células eran Co cultivadas con células de linfoma A20 modificadas para luciferase expres (1 x 104: 1 x 104) durante 16 horas en una placa de fondo U 96 pocillos. Después de co-cultivo, las células fueron peleteadas y se recogió el sobrenadante. A) las células se resuspendió en PBS y luminometry se utilizó para evaluar la viabilidad de las células diana. Sobrenadante de cocultivo se evaluó la presencia de IFNγ (B) y la IL-12 (C). Deben optimizarse la relación de coche T cell a las células diana y duración del período de la cultura de construir para cada coche y línea celular de destino. PMA y ionomycin tratamiento puede utilizarse como control positivo para confirmar la calidad de células T y su capacidad para responder. Barras de error indican SD. estadístico análisis se realizaron mediante ANOVA unidireccional. p &lt; 0,001). Esta figura ha sido modificada desde17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig4.jpg"> Figura 4. Establecimiento de linfoma A20 sin lymphodepletion. Ciclofosfamida puede aumentar la eficacia de la inducción de linfoma sin causar lymphodepletion. A) cuentas de sangre de los ratones BALB/c 6-8 semanas de edad después de la entrega IV de 100 mg/kg de ciclofosfamida. Barras de error indican SD B) carga de linfoma de ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad después de la entrega IV de 100 mg/kg de ciclofosfamida o solución salina en el día -1 y IV entrega de las células 5 x 105 A20 en el día 0 medidos con un luminómetro. C) la supervivencia de ratones en B). Barras de error indican SD. estadístico análisis se realizaron mediante ANOVA de 2 vías. ** p &lt; 0.01, *** p &lt; 0.001). Esta figura ha sido modificada de Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig5.jpg"> Figura 5. Monitoreo de carga de linfoma y la supervivencia. Ratones con linfoma A20 expresan luciferasa reciben 100 μl intraperitoneal (IP) inyecciones de luciferin 30 mg/mL y fueron reflejadas mediante una bioluminiscencia en vivo sistema de imagen. A) ratones fueron expuestos durante 1 min en el lado ventral e inmediatamente volcó a imagen dorsal para recoger a las masas de tumor en ambos lados de los cuerpos (B). C) resultados representativos de la carga de linfoma de ratones BALB/c recibir diferentes células de coche T αmCD19 sin lymphodepletion. Barras de error indican SEM. D) tasa de supervivencia de los ratones de la misma. Esta figura ha sido modificada de Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig6.jpg"> Figura 6. Efectos de lymphodepletion. A) cuentas de sangre de los ratones BALB/c 6-8 semanas de edad después de recibir 5 Gy TBI en una dosis de 0,02 Gy/min; barras de error Mostrar estadística SD. análisis por ANOVA de dos vías. p &lt; 0.05, ** p &lt; 0.01, *** p &lt; 0.001. B) monitoreo de CD4+ y CD8 de las células en la sangre periférica de ratones+ T coche por citometría de flujo para la mCherry marcador gen 7 días post administración. Barras de error indican SD Esta figura ha sido modificada de Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig7.jpg"> Figura 7. Actividad de las células de T automóvil con acondicionamiento previo del lymphodepleting. Resultados típicos que muestran el efecto de 5 Gy TBI el día antes de la administración de coche T-cell. A) proyección de imagen y (B) muestra gráfica de la proyección de imagen de ratones después de 100 μl intraperitoneal (IP) las inyecciones de luciferin 30 mg/mL usando una bioluminiscencia en vivo sistema de imagen. Barras de error indican SEM. C) la supervivencia de los ratones de la misma. Esta figura ha sido modificado fromKueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig7large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para la producción y los ensayos preclínicos murinas CD19 coche de células de T por transducción retroviral y utilización como terapia contra establecido syngeneic A20 linfoma en ratones BALB/c con o sin lymphodepleting acondicionamiento previo.

Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la terapia inmunitaria de células T CAR, como la modificación genética de las células T CAR y la combinación con otras terapias inmunitarias. La principal ventaja de esta técnica es que permite comparaciones entre el Linfo repleto y los entornos de Lympho agotados. Esto nos permite ver el papel de las células inmunitarias endógenas tanto en la progresión de la enfermedad como en su interacción con células T de CAR terapéuticas.La implicación de esta técnica como 10 a la terapia en el diagnóstico de tumor sólido porque las lecciones aprendidas en este modelo se pueden traducir directamente a la casa de caramelos con otras dianas como CEA. Para comenzar este procedimiento. En primer lugar, prepare todos los medios y celdas necesarios como se describe en el protocolo de texto. En el primer día en DMEM completo a 15 centímetros cuadrados platos de cultura. Semilla 7,5 millones de células electrónicas de platino en estos platos e incubar durante la noche a 37

a-syngeneic-mouse-b-cell-lymphoma-model-for-pre-clinical-evaluation

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

En este video, que demuestre el procedimiento de activación CD40-y la expansión de las células B murinas a partir de esplenocitos de ratones C57BL / 6, que puede ser utilizado como un modelo de célula presentadora de antígeno (APC) para estudiar la inducción de la inmunidad.

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Este video muestra un ensayo in vitro para validar la actividad de las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR). Las células de linfoma de células B que expresan el antígeno CD19 y la luciferasa citoplasmática se cultivan conjuntamente con células CAR-T específicas de CD19. La unión de CAR a CD19 en un tumor induce a las células CAR-T a liberar citocinas y toxinas que causan citotoxicidad en las células tumorales. La actividad de las células CAR-T se evalúa cuantificando la citocina...

Ensayo in vitro para evaluar la actividad antitumoral de las células CAR-T específicas de tumores

La diseminación metastásica del cáncer es la principal causa de muerte por cáncer. Proporcionamos una descripción en profundidad de nuestra metodología de la cirugía de supervivencia para el establecimiento de un sistema de modelo de ratón singénico "-paciente como" ortotópico para el estudio de los mecanismos de la metástasis en tumores de órganos sólidos.

Un &quot;paciente-Like&quot; ortotópico Singénico modelo de ratón de carcinoma hepatocelular Metástasis

La aplicación de un modelo ortotópico de carcinoma de células renales en ratones inmunocompetentes proporciona el investigador un sistema clínicamente relevante definido por la presencia de una metástasis de tumores primarios de pulmón y renales en el mismo animal. Este sistema puede ser utilizado para probar preclínicamente una variedad de tratamientos in vivo.

Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

Describimos un enfoque para generar de forma fiable células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) y probar su diferenciación y función in vitro e in vivo.

Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

Este artículo describe un protocolo para la generación de células T CD8 específicas de antígenos, y su expansión in vitro, con el objetivo de producir un alto número de células T funcionales para su uso in vitro e in vivo.

Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

Aquí, describimos un protocolo en el que se utiliza un modelo de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda como estrategia para evaluar y monitorear las toxicidades asociadas a las células T del receptor de antígeno quimérico dirigido a CD19.

Evaluación de los efectos tóxicos asociados a las células T del receptor de antígeno quimérico mediante un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda

Este protocolo agiliza la producción de vectores retrovirales y la transducción de células T murinas, lo que facilita la generación eficiente de células CAR-T de ratón.

Generación eficiente de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) murino

Aquí, describimos un método para crear gotas de doble emulsión que encapsulan una célula T y una célula diana cancerosa para examinar la muerte celular a nivel de una sola célula. Este método permite la cuantificación dual de las moléculas citotóxicas y la apoptosis de las células diana dentro de una gran población de células T.

Ensayo de citotoxicidad basado en gotas para evaluar las células T receptoras de antígenos quiméricos a nivel de una sola célula

Dados los modelos de xenoinjerto limitados disponibles para estudiar las interacciones entre CART humano y células mieloides, establecimos modelos in vitro e in vivo para comprender los impactos de los macrófagos humanos en las células CART. Los hallazgos pueden generalizarse potencialmente para evaluar las funciones de los macrófagos en el microambiente tumoral y probar inmunoterapias dirigidas a macrófagos.

Estudio de las interacciones entre las células mieloides y las células T con CAR in vitro e in vivo

Aprende a generar células T CAR murinas CD19 mediante transducción retroviral para evaluar su eficacia terapéutica contra linfoma B A20 sinigénico en ratones BALB/c. Este protocolo permite comparar condiciones con y sin linfodepleción.

Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19

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