Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del ARN sobre el mecanismo y la función de la localización de ARN polarizado. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización en tiempo real del tráfico endógeno de ARN en tejidos vivos. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de enfermedades relacionadas con el ARN porque tiene un potencial para descubrir nuevas dianas terapéuticas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los procesos de ARN en la cámara de huevo de mosca de la fruta, también se puede aplicar a otros sistemas como en peces cebra o células de cultivo. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán debido a los desafíos asociados con el diseño y la entrega de los accesorios de la baliza molecular. Para la microinyección de baliza molecular, seleccione el objetivo de aceite 40X y monte un cubreobjetos con la cámara de huevo diseccionada en la etapa del microscopio.

Localice una cámara de huevo en la etapa de desarrollo media tardía y tardía que esté correctamente orientada para la microinyección. A continuación, configure un microinyector con las presiones de inyección y compensación adecuadas. Con el joystick del micromantenerador, baje suavemente una aguja cargada con un microlitro de solución de baliza molecular en la gota de aceite.

Ponga la punta en el foco hacia la periferia del campo de visión. Realice una función limpia para extraer el aire de la punta de la aguja y asegurarse de que haya flujo de la aguja y llevar la aguja a la posición de inicio. Concéntrese en la cámara de óvulo que se va a inyectar microinyecía y vuelva a enfocar la aguja cerca del borde de la cámara de huevo.

Realice un ajuste fino de la posición z del objetivo de manera que la membrana que separa las células del folículo de las células de la enfermera esté enfocada. Inserte la aguja en una célula de enfermería para la inyección de las balizas moleculares durante un período de dos a cinco segundos. Para asegurar el éxito reproducible de la microinyección, concéntrese cuidadosamente en la membrana que separa las células del folículo y las células de la enfermera que se inyectarán mientras se en foco la punta de la aguja con el micro manipulador.

Cuando se hayan inyectado todas las balizas moleculares, retire suavemente la aguja y retírela a la posición principal. Cambie el objetivo a la ampliación deseada para la adquisición de imágenes. A continuación, concéntrese en la cámara de huevos bajo el nuevo objetivo y comience la adquisición de la imagen.

Para la detección de manchas de las balizas moleculares, abra las imágenes en La imagen J.Utilice la herramienta Convertir a ICY para convertir las imágenes a ICY. Una barra de escala se superpuesta automáticamente a la pila. Edite la barra de escala a través de la ventana del inspector según sea necesario.

A continuación, desactive el icono de ojo de la barra de escala debajo de la pestaña de capa para eliminar la barra de escala de la pila original. Seleccione la detección y el seguimiento, la detección y el detector de puntos, y confirme que la detección de entrada de secuencia de corriente y el canal cero se seleccionan para los parámetros de entrada y preprocesamiento, respectivamente. Para el detector, seleccione detectar puntos brillantes sobre el fondo oscuro utilizando el uso de fuerza de longitudes de onda 2D para 3D solo si no hay suficientes cortes z en las pilas para realizar el análisis.

Seleccione escalas y sensibilidad para cada escala agregando más escalas para puntos más grandes y confirme que la región de interés de la secuencia está establecida para la región de interés. Para filtrar, confirme que no se ha establecido ningún filtrado y seleccione el formato de archivo adecuado en la salida. Si los resultados del detector de puntos se van a utilizar para realizar un seguimiento del análisis, seleccione Exportar a piscina.

Para el análisis de colocación, repita la detección de puntos para el otro canal. Para realizar un seguimiento de las manchas de baliza molecular, seleccione la detección y el seguimiento, el seguimiento, el seguimiento de puntos y ejecute el detector de puntos utilizando los mismos parámetros que para la detección de puntos. Haga clic en estimar parámetros y seleccione el movimiento de destino deseado en la ventana emergente de estimación de parámetros.

A continuación, haga clic en Ejecutar seguimiento. Para visualizar las pistas, seleccione detección y seguimiento, seguimiento y gestor de seguimiento. Para el procesador de pistas de color, seleccione habilitar y seleccione un color para las pistas.

En Agregar procesador de pistas, seleccione el clip de tiempo del procesador de seguimiento. En la ventana de la pinza de verificación, introduzca el número de detecciones que se mostrarán antes y después del punto de tiempo actual. Guarde la información de la pista como un archivo de pista XML y utilice el icono de la cámara para obtener una captura de pantalla de los resultados.

Para proyectar la pila a lo largo de la dirección z, utilice la barra de búsqueda para encontrar el complemento y seleccione la proyección máxima en el menú desplegable. En la ventana del inspector, seleccione la pestaña de secuencia, el lienzo y la rotación para ajustar la imagen a la orientación deseada y obtener una captura de pantalla de la imagen girada. A continuación, seleccione la región de interés, la región 2D de interés, elija la forma de región de interés y seleccione la región de interés de la imagen para recortar.

Instale el plugin de superposición de marca de tiempo y agregue una marca de tiempo siguiendo las instrucciones en la ventana emergente para obtener instrucciones sobre cómo colocar y formatear la marca de tiempo. Para cambiar o agregar el intervalo de tiempo, haga clic en editar en la ventana de propiedades de secuencia. Active el icono de ojo para volver a añadir la barra de escala debajo de la pestaña de capa en la ventana del inspector.

A continuación, obtenga una captura de pantalla de los resultados con marca de tiempo y guarde la imagen en formatos TIFF y AVI. Utilizando este método como se ha demostrado, es posible visualizar los patrones de transporte y localización de los mRNas endógenos a través de balizas moleculares en varias etapas de la oogénesis y, en particular, en y después de la oogénesis media. Cuando se inyecta individualmente en las cámaras de huevo de la misma etapa, diferentes balizas moleculares específicas de oskar presentan el mismo patrón de localización.

Las balizas moleculares inyectadas en el citoplasma de una célula de enfermería se difunden libremente en las células de enfermería adyacentes, así como en el citocito. Por lo tanto, las balizas son capaces de hibridirse con sus objetivos y generar señales de fluorescencia en otros sitios que no sean el sitio de microinyección. En las cámaras de óvulos transgénicas Oskar GFP a mediados de la oogénesis, el análisis de los datos de adquisición muestra una colocación extensa para la señal de fluorescencia de GFP genéticamente diseñada etiquetada con arnm de oskar con la señal de fluorescencia detectada mediante balizas moleculares.

Además, las pilas 5D se pueden analizar más a fondo para determinar las trayectorias de ARNm de oskar para el transporte de larga distancia tanto en células de enfermera como en citoplasma de citocícito. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN exploraran el transporte endógeno del ARNm materno y la localización en la cámara de óvulos de Drosophila.