Estimación del número de Nefrona en riñón entera utilizando el método de maceración ácida

El método de maceración ácida puede ayudar a responder preguntas clave sobre el riñón y cómo los genes específicos contribuyen o influyen en el desarrollo de nefronas, así como cómo las condiciones específicas, como la diabetes o la hipertensión, afectan el número de nefronas. Esto es importante ya que un número total de nefronas con las que un individuo nacido se determina durante el desarrollo fetal y la pérdida de nefronas se ha asociado con la patología renal. Las principales ventajas del método de maceración ácida son que es más rápido, más reproducible, barato y consume menos tiempo que otros métodos de recuento de nefronas, como la resonancia magnética.

Esta técnica facilita la correlación del impacto en el número de nefronas en la función renal, lo que es importante para promover nuestra comprensión de cómo los genes específicos influyen en la función y el desarrollo de la nefrona. El estudio de genes o factores que influyen en el número global de nefronas será fundamental en el desarrollo de enfoques farmacológicos o genéticos diseñados para limitar la pérdida de nefrona asociada a la enfermedad. Con una buena técnica y práctica experimental, los individuos nuevos en este método deben obtener fácilmente el dominio del método de maceración ácida permitiendo estimaciones confiables y reproducibles de números de nefronas renales enteras.

Comience usando tijeras quirúrgicas finas para abrir la cavidad abdominal del ratón a lo largo de la línea media. Desplazar cuidadosamente los intestinos y la adiposa reproductiva al lado derecho del animal. Usando la disección bruta, aísle el riñón izquierdo y corte la arteria renal izquierda y la vena para extraer cuidadosamente el riñón colocando el órgano en un bote de pesaje adecuadamente etiquetado de PBS.

Recoger el riñón derecho de la misma manera y colocar ambos riñones en una gasa quirúrgica pre-humedecida con PBS. Retire rápidamente cualquier tejido no renal adherente y las cápsulas renales. Luego pondera cada riñón individualmente registrando el peso del órgano izquierdo y derecho por separado.

Después del pesaje, vuelva a colocar cada riñón en un bote de pesaje debidamente etiquetado sin PBS y utilice una cuchilla de afeitar limpia para cortar cada órgano por la mitad a lo largo. Coloque cada lado medio cortado y corte cada mitad en trozos de dos milímetros o más pequeños. Con la misma cuchilla de afeitar, transfiera cuidadosamente las piezas de riñón picadas a un tubo cónico de 15 mililitros debidamente etiquetado.

En una campana de humo bien ventilada, agregue cinco mililitros de seis molares de ácido clorhídrico a cada tubo. A continuación, agita suavemente las mezclas de ácido renal antes de colocar los tubos en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 90 minutos. Al final de la maceración ácida, coloque una aguja de calibre 18 en una jeringa de cinco mililitros por riñón y retire cuidadosamente los émbolos de la jeringa.

Coloque las jeringas en tubos cónicos individuales de 50 mililitros en la campana de humos y vierta las soluciones renales en el extremo abierto de cada jeringa dejando a un lado los tubos vacíos en un portatubos de ensayo. A continuación, sustituya cuidadosamente los émbolos para la extrusión lenta de cada solución a través de las agujas en los tubos de 50 mililitros. Lave los tubos cónicos de 15 mililitros con cinco mililitros de solución PBS por tubo que gira el PBS para solubilizar cualquier tejido renal restante.

Extruya el contenido del lavado en el tubo de 50 mililitros apropiado como se acaba de demostrar. Después de extruir el tercer lavado, equipe cada jeringa con una aguja de calibre 21. Extruir el contenido de los tubos de 50 mililitros en un segundo conjunto de tubos de 50 mililitros a través del lavado de aguja de diámetro más pequeño y extruyendo el primer contenido de tubo de 50 mililitros tres veces con PBS fresco como se ha demostrado.

Después del tercer lavado y extrusión, lleve el volumen total en cada tubo hasta 50 mililitros con PBS adicional y coloque los tubos en un bastidor en una placa basculante a cuatro grados centígrados durante la noche. Dentro de los cinco días posteriores al procesamiento, coloque una rejilla que contenga 16 secciones separadas en la parte inferior de seis pozos de una placa de 12 pozos. Invierta suavemente los tubos de la solución renal varias veces para resuspender los tejidos peletizado.

Añadir cuidadosamente tres alícuotas de 500 microlitros de cada solución homogeneizada por riñón a cada uno de los tres pozos de la placa de 12 pozos. Diluir el contenido de cada pozo con un volumen igual de PBS. Coloque la placa en la etapa de un microscopio invertido.

Identificar los glomérulos por su estructura esférica, tono rojizo, y las arterias pre o post unidas a los cuerpos de los glomérulos individuales. Contar el número de glomérulos por cada sección cuadriculada para sumar el recuento por cuadrícula para el cálculo del número total de glomérulos por pozo. Luego multiplique el número de glomérulos por pozo por 100 para obtener el número promedio de glomérulos por riñón.

En este experimento representativo, el número total de nefronas en ratones infundidos con vehículo durante 14 días fue de unos 12.500 nefronas por riñón. Sin embargo, la angiotensina dos infusión aumentó la presión auricular en aproximadamente 40 milímetros de mercurio y se asoció con una reducción significativa de casi el 26% en el número total de nefronas. En este modelo genético de agenesia renal de rata, se calculó que los animales nacidos con dos riñones contenían alrededor de 27.500 nefronas por riñón después de la maceración ácida como se demostró, mientras que las ratas nacidas con un riñón solitario tenían un número total de nefronas significativamente más bajos.

Las estimaciones de ambos experimentos fueron consistentes con los rangos previamente reportados en ratas. El método de maceración ácida es ideal para estimar el número de nefronas en riñones enteros, especialmente en laboratorios no equipados con técnicas más intensivas en mano de obra y prohibitivas de costos para contar nefronas, como el método de fraccionador de disector o la resonancia magnética. Este método permite una estimación de alto rendimiento, eficiente y reproducible del número de nefronas renales enteras que están dentro del 5% de los números determinados por imágenes por resonancia magnética.

La evaluación del número de nefronas es de relevancia clínica, ya que el número reducido de nefronas se ha asociado con un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular, como la enfermedad renal crónica. No olvide que trabajar con ácido clorhídrico puede ser extremadamente peligroso y que se deben tomar precauciones, como usar guantes, gafas protectoras y un abrigo de laboratorio.