qKAT: semiautomáticos cuantitativa escribiendo de la asesino-célula inmunoglobulina-como Receptor de Genes
6 de marzo de 2019
Cuantitativa la célula de asesino inmunoglobulina-como receptor (KIR) semiautomático escribir (qKAT) es un método simple, de alto rendimiento y rentable para copiar número genes KIR de tipo para su aplicación en estudios de Asociación de población y enfermedades.
Este método puede responder preguntas clave sobre la genética de los receptores de células NK, como la diversidad del haplototipo y cómo esto se relaciona con la enfermedad. La demostración visual de este método ayudará a establecer el protocolo en su laboratorio, incluido el proceso de automatización y el análisis de datos. Las principales ventajas de esta técnica son que, a diferencia de los métodos convencionales, qKAT, que significa escritura automatizada KIR cuantitativa, es de alto rendimiento y proporciona el número de copia genética.
qKAT puede proporcionar información sobre la asociación de enfermedades. Las implicaciones de esta técnica pueden ser útiles para la terapia para infecciones virales como el VIH y la hepatitis C, en el cáncer, en el trasplante de células madre y los trastornos del embarazo. qKAT también se puede aplicar en el estudio de la genética de la población, así como explorar la expresión y las interacciones funcionales entre las moléculas kir y HLA.
qKAT consta de 10 reacciones multiplex que se dirigen específicamente a exones de los dos genes KIR y un gen de referencia. En este protocolo, las imprimaciones específicas están diseñadas para detectar los alelos del gen dado y los resultados de la PCR en amplicons cortos. Después de esto, las sondas de hidrólisis específicas de doble etiqueta se utilizan para monitorear la amplificación de PCR en tiempo real.
El análisis de números de copia utiliza la cuantificación relativa de los genes KIR objetivo a un gen de referencia. qKAT está diseñado y configurado para ser una técnica de alto rendimiento. Por lo tanto, cada reacción se puede realizar en poco menos de 1.000 muestras.
Los siguientes pasos muestran los pasos involucrados en la preparación y chapado de cada placa de ADN de 96 pozos. Para empezar, después de cuantificar el ADN, diluir el ADN en una placa de pozo profundo de 96 pozos. Incluya al menos un ejemplo de control con un número de copia conocido y un control que no sea de plantilla.
Centrifugar la placa a 450 gs durante dos minutos. A continuación, dispensar cada muestra en cuadrúplica en placas qPCR de 384 pozos. Después de esto, seque al aire el ADN en un área limpia a temperatura ambiente durante 24 horas.
Para configurar una reacción qKAT para 10 placas de 384 pozos, primero, descongele el búfer qPCR, la imprimación y las alícuotas de sonda a cuatro grados centígrados. Prepare la mezcla maestra sobre hielo de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, utilice una pipeta multicanal para distribuir la mezcla maestra uniformemente a través de una placa de pozo profundo de 96 pozos.
Dispensar 9,5 microlitros de la mezcla maestra en cada pozo de la placa con las muestras de gDNA secas. Después de esto, selle la placa con papel de aluminio e inmediatamente guárdela a cuatro grados centígrados. Recuerde realizar un lavado corto de agua para limpiar las agujas del sistema de manipulación de líquidos si dispensa la mezcla maestra en más de una placa de ADN de 384 pozos.
Centrifugar la placa con las muestras de gDNA a 450 gs durante tres minutos. Luego, incuba la placa a 4 grados celsius para resuspender el ADN y disipar cualquier burbuja de aire. Después de incubar la placa durante la noche, repita la centrifugación para disipar cualquier burbuja de aire.
A continuación, coloque la placa en el muelle de almacenamiento refrigerado. Conecte la máquina qPCR a un controlador de microplacas. A continuación, programe el controlador de microplacas de acuerdo con el protocolo de texto.
Una vez completada la carrera, pida al robot que recoja la placa de la máquina qPCR y colóquela en el muelle de descarte. Después de completar la amplificación, abra el software qPCR. En la pestaña Navegador, abra el archivo de experimento de reacción guardado para una placa.
A continuación, abra la ventana Crear nuevo análisis y seleccione la configuración adecuada para el 2do método Derivative Max. A continuación, seleccione Filter Comb y asegúrese de que los datos recopilados para STAT6 están seleccionados. Seleccione la compensación de color adecuada.
Haga clic en Calcular y, a continuación, haga clic en Guardar archivo. Para analizar los datos con el método Puntos de ajuste, abra la ventana Crear nuevo análisis y seleccione la configuración adecuada para el método Puntos de ajuste. A continuación, seleccione los filtros y las compensaciones de color correctos para STAT6.
Establezca la banda de ruido para excluir el ruido de fondo. Después de esto, abra la pestaña Análisis y establezca los puntos de ajuste en tres y seleccione Mostrar puntos de ajuste. Guarde los cambios y repita los pasos con la configuración adecuada para el análisis de punto de ajuste y 2o derivado para los genes KIR.
Abra la pestaña Navegador en el software qPCR y seleccione Exportación por lotes de resultados. A continuación, abra la carpeta que contiene los archivos del experimento y transfiéralos al lado derecho de la ventana. Haga clic en Siguiente y seleccione el nombre y la ubicación del archivo de exportación.
Después de esto, seleccione el tipo de análisis de interés y haga clic en Siguiente. Asegúrese de que el nombre del archivo, la carpeta de exportación y el tipo de análisis son correctos antes de hacer clic en Siguiente para iniciar el proceso de exportación. Cuando el estado de exportación cambia a Aceptar, la pantalla se moverá automáticamente al siguiente paso.
Asegúrese de que todos los archivos seleccionados se han exportado correctamente y haga clic en Listo. A continuación, utilice los scripts en el protocolo de texto para dividir las placas exportadas en reacciones individuales y para convertir los archivos en un software legible por software de análisis de números de copia. A continuación, abra el software de análisis de números de copia y seleccione Importar archivo de resultados de PCR en tiempo real para cargar los archivos de texto creados por los scripts.
Por último, seleccione Analizar y realice el análisis seleccionando Número de copia de muestra más frecuente. En este protocolo, se utilizó la escritura semiautomática, o qKAT, para copiar genes KIR de tipo numérico. El número de copia más frecuente para KIR2DL4 era de dos copias, mientras que el número de copia más frecuente para KIR3DS1 era cero.
Al intentar este procedimiento, es extremadamente importante asegurarse de que el ADN se cuantifica con precisión, para llevar a cabo todos los pasos sobre el hielo, y para asegurarse de que los reactivos están cubiertos de luz. También es importante realizar controles exhaustivos de los datos sin procesar de las muestras que no se ajustan a las reglas de LD conocidas para los genes KIR. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la secuenciación para responder preguntas adicionales, por ejemplo, la presencia de genes de fusión, o la identificación de nuevos alelos.
Después de su desarrollo, este método allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inmunogenética exploraran el papel de la KIR en la biología celular NK, la resistencia a las enfermedades y la reproducción humana.
Descripción general
El tipaje cuantitativo de receptores tipo inmunoglobulina de células asesinas (KIR) mediante técnica semiautomatizada (qKAT) es un método de alto rendimiento para la tipificación de genes KIR. Esta técnica contribuye a comprender la genética de los receptores de células NK y sus implicaciones en diversas enfermedades.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunogenética
- Genética de poblaciones
- Biología celular
Antecedentes
- Los genes KIR desempeñan un papel crucial en la respuesta inmunitaria.
- Comprender la diversidad de haplotipos es importante para los estudios de asociación con enfermedades.
- Los métodos convencionales suelen tener baja capacidad de procesamiento y ser costosos.
- qKAT proporciona de manera eficiente información sobre el número de copias génicas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de alto rendimiento para la tipificación genética de KIR.
- Explorar la relación entre la genética de KIR y las enfermedades.
- Facilitar la investigación en inmunogenética y estudios poblacionales.
Métodos Utilizados
- Diseño de cebadores específicos para la detección del gen KIR.
- Uso de reacciones multiplex dirigidas a los genes KIR y a un gen de referencia.
- PCR en tiempo real para monitorear la amplificación.
- Análisis de datos mediante software especializado para la evaluación del número de copias.
Resultados Principales
- qKAT puede procesar casi 1.000 muestras en un solo ensayo.
- Se identificaron los números de copia más frecuentes para KIR2DL4 y KIR3DS1.
- El método demostró fiabilidad al cuantificar los números de copia génica de KIR.
- Facilitó la exploración adicional del papel de KIR en enfermedades.
Conclusiones
- qKAT es una herramienta valiosa para investigadores en inmunogenética.
- Mejora la comprensión de las funciones de los genes KIR en la salud y la enfermedad.
- El método puede adaptarse para diversas aplicaciones en genética de poblaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La genotipificación precisa de loci polimórficos de receptores inmunitarios como KIR es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en la investigación inmunológica y de trasplantes. qKAT permite un análisis de alto resolución del número de copias en grandes cohortes, lo que favorece conocimientos mecanicistas sobre la resistencia de las células NK a las enfermedades y la respuesta terapéutica. Esta capacidad refuerza la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular la variación genética con resultados funcionales en modelos de enfermedades.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la variación en el número de copias del gen KIR para aclarar la diversidad de haplotipos y su impacto en la función del receptor de células NK.
- Valor operativo: Proporciona genotipificación semiautomatizada y de alto rendimiento, compatible con formatos de 96 y 384 pocillos, para el procesamiento escalable de muestras.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles sobre el número de copias de todos los genes KIR mediante PCR en tiempo real multiplex con sondas de hidrólisis.
- Valor operativo: Facilita la estandarización del ensayo mediante la normalización con genes de referencia y flujos de trabajo de análisis predefinidos (máximo de la segunda derivada, puntos de ajuste).
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la exploración de las interacciones KIR-HLA en contextos de enfermedad como infecciones virales, cáncer y trasplantes.
- Valor operativo: Genera datos informativos sobre haplotipos que pueden utilizarse en secuenciación posterior o ensayos funcionales para el descubrimiento de nuevos alelos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
qKAT se integra en el continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica, especialmente en aquellos casos en los que los mecanismos efector inmunitarios influyen en la eficacia terapéutica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la vinculación del número de copias de KIR con la actividad de las células NK en fenotipos asociados a enfermedades.
- Detección: Permite sistemas biológicos listos para usar, con genotipos de KIR definidos, para la cribado de compuestos en modelos mediados por la inmunidad.
- Análisis: Genera datos de cuantificación relativa adecuados para la determinación del número de copias y comparaciones estadísticas entre grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta el perfilado genético con la continuidad preclínica en modelos de reconstitución inmunitaria o enfermedad del injerto contra el huésped.
- Reutilización Empresarial: Diseñado como una plataforma de genotipado reutilizable, aplicable en carteras de inmunología, oncología y salud reproductiva.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas inmunitarias mediante el perfilado genético de alta resolución de loci polimórficos.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante el manejo estandarizado de reactivos, la preparación de mezclas maestras en cadena fría y el procesamiento automatizado de placas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la estratificación genética a gran escala en estudios de fase temprana.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo mediante la identificación de haplotipos KIR asociados con respuestas diferenciales al tratamiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el montaje de PCR en tiempo real, diseño de cebadores/sondas y software de análisis de número de copias.
- Depende de instrumentación de qPCR compatible con placas de 384 pocillos y manipuladores de microplacas para automatización.
- Necesita estandarización entre equipos en la cuantificación de ADN, consistencia en el pipeteo y controles de contaminación.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a modelos no humanos o genes de referencia alternativos.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de cuantificación precisa de ADN, reactivos protegidos de la luz y control de calidad de datos brutos para cumplir con la norma LD.
