Purificación de proteínas de histona H4, H3 y la cuantificación de las marcas acetilado histonas en las células y el tejido cerebral
30 de noviembre de 2018
El propósito de este artículo es proporcionar a una guía completa y sistemática a la purificación eficiente de las histonas H3 y H4 y la cuantificación de residuos de histona acetilado.
Este método permite la cuantificación precisa de las histonas de núcleo H3 y H4 y sus modificaciones post-traduccionales de extractos celulares y tisulares, lo que conduce a la generación de resultados reproducibles de alta calidad. La técnica presentada tiene tres ventajas principales. En primer lugar, conserva las modificaciones nativas post-traduccionales de las histonas.
En segundo lugar, omite los costosos métodos de bajo rendimiento. Por último, es totalmente compatible con las aplicaciones de rendimiento medio posterior. Demostrando el procedimiento será Karolina Janczura una talentosa estudiante de posgrado de mi laboratorio que optimizó completamente este protocolo y empleó la técnica para responder a preguntas importantes sobre la regulación epigenética en la enfermedad de Alzheimer.
Para comenzar a platear las células en platos tratados con cultivo de tejido de 10 centímetros con los medios de cultivo celular apropiados de acuerdo con el protocolo de texto. Permita que las células crezcan hasta que alcancen alrededor del 90% de confluencia. Después de que las células hayan alcanzado la confluencia deseada aspirar suavemente los medios de cultivo y lavar las células dos veces con medios precalificados libres de suero.
Después de esto, retire los medios libres de suero de las células y coloque los platos de 10 centímetros sobre hielo. Agregue un mililitro de tampón de extracción en frío a cada plato. Usando un rascador de células de plástico recoger las células en el tampón de extracción y transferirlas a un tubo etiquetado de 1,5 mililitros.
A continuación, coloque los tubos sobre hielo. Si se utiliza tejido congelado, coloque el tejido en un tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros y descongelarlo brevemente sobre hielo. A continuación, homogeneizar el tejido cerebral con un homogeneizador de mano utilizando la cantidad recomendada de tampón de extracción y el número de accidentes cerebrovasculares.
La homogeneización es completa cuando no hay fragmentos de tejido visibles y la solución adquiere un aspecto lechoso. Después de esto, utilice una pipeta de 1.000 microlitro de un solo canal para transferir el homogeneato a un tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros y coloque los tubos sobre hielo. Coloque el tubo que contiene los licatos celulares y el tejido cerebral homogeneizado en una plataforma giratoria girando a 15 RPM a cuatro grados centígrados.
Después de esto, centrifugar el tubo a la velocidad máxima durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo pre-enfriado de 1,5 mililitros y deseche el pellet. A continuación, neutralice las histonas con un volumen de 1/4 de búfer de neutralización, y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Utilice tiras de pH para comprobar el pH de la mezcla y ajuste aún más el pH con el tampón de neutralización si es necesario. Si las histonas ácidas no se neutralizan durante este paso, no se unirán a la membrana de la columna correctamente, pasarán a través de ella y se detectarán en el flujo a través. Agregue 37,5 microlitros de la muestra a 12,5 microlitros de tampón de muestra.
Después de una breve desnaturalturación de la centrifugación la mezcla a 99 grados centígrados durante 10 minutos. Después de esto, coloque los tubos sobre hielo y gírtelos brevemente para recoger el condensado. Cargue la muestra en un gel SDS-PAGE y ejecute el gel a 100 voltios durante una hora.
Luego tiñe el gel durante la noche. Y detenerlo durante tres lavados consecutivos. Primero agregue 500 microlitros de búfer de equilibrio a cada columna de giro.
Centrifugar la columna durante tres minutos. Deseche el flujo y repita la centrifugación una vez más. Después de esto agregue 500 microlitros de la muestra a la columna.
Centrifugar la columna durante tres minutos y recoger el flujo a través. A continuación, analice el flujo de columna como se describió anteriormente. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado a la columna.
Centrifugar la columna durante tres minutos y recoger el flujo a través. Transfiera la columna a un nuevo tubo etiquetado de 1,5 mililitros. Agregue 50 microlitros de búfer de elución de histona a la columna.
Después de centrifugar la columna, guarde el flujo a través que contiene proteínas histonas. Bajo una capucha química añadir ácido perclórico a las histonas purificadas para lograr una concentración final de 4%ácido perclórico. Pipetear arriba y abajo seis veces para mezclar.
Si las histonas de la muestra están muy concentradas, la solución se nublará después de la adición de ácido perclórico. Después de esto, incubar el tubo a cuatro grados centígrados durante 24 horas. Si la precipitación de histona durante la noche es exitosa, un pequeño pellet blanco será visible en la parte inferior del vial después del paso de centrifugación.
Al lavar el pellet en los pasos consecutivos asegúrese de que el pellet no se perturba, ya que puede separarse fácilmente del fondo del vial. Al día siguiente centrifugar las muestras durante 75 minutos en tubos de microcentrífuga preenfriados. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y añadir 500 microlitros de ácido perclórico helado a la muestra peletizadora.
Después de centrifugar la muestra durante 10 minutos a la velocidad máxima, aspire el sobrenadante. Agregue 500 microlitros de acetona helada a la muestra teniendo cuidado de no molestar el pellet. A continuación, retire el sobrenadante y deje que los tubos se sequen sin acocar sobre hielo durante 30 minutos.
A continuación, retire los tubos del hielo y deje que la muestra se seque a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de que el pellet se resuspenda en 30 microlitros de agua estéril. Tapa los tubos y deja que las histonas se reconstituyen sobre hielo durante 30 a 50 minutos.
Después de comprobar que el pellet se resuspended, recapitula los tubos y retírelos del hielo. En este protocolo se purificaron las histonas de células BV-2 microgliales humanas y se analizó la composición del extracto. El gel teñido demuestra que los tiempos de extracción entre 15 minutos y 24 horas no afectaron a la composición general de los extractos de histona cruda.
La eficiencia de la unión de histona a la matriz de la columna se analizó mediante la tinción del gel. La eficiencia de la columna fue aproximadamente del 100%, como lo demuestra la ausencia de proteínas histonas detectables en el flujo de la columna. Independientemente de la duración del tiempo de extracción, es decir.
15 minutos, dos horas o 24 horas. lavado de primera columna elimina la mayor cantidad de proteínas no histonas del extracto. Las fracciones de proteína histona purificadas del grupo de extracción de 24 horas contenían más histonas H3 y H4 en comparación con los tiempos de extracción de 15 minutos y dos horas.
La primera elución de columna fue aproximadamente 100%eficiente como lo demuestra la falta de proteínas histonas en el segundo eluido. Luego se extrajeron histonas crudas de todo el cerebro del ratón y se midieron modificaciones post-traduccionales. En respuesta al inhibidor de HADC de acción amplia, tributilrina, acetilación H4K12 aumentó en el extracto.
Sin embargo, la especificidad del anticuerpo disminuyó debido a la presencia de impurezas en el extracto crudo. El protocolo de purificación de histona se completó con la corteza prefrontal de ratones triples transgénicos A/D tratados con el inhibidor de la HDAC de Clase I e IIb, M344, y se evaluó la fracción de histona de núcleo puro única para cambios en la acetilización H4K12. Se detectaron histonas totales y se observó un aumento significativo de la acetilación H4K12 en respuesta a M344.
Al intentar este procedimiento es importante recordar realizar los múltiples puntos de control descritos dentro del protocolo para validar la purificación exitosa de la histona durante todo el proceso. Siguiendo este procedimiento, se pueden abordar preguntas adicionales sobre la fosforilación de histona y el estado de metilación. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para que los investigadores de nuestro laboratorio analizaran los mecanismos genéticos involucrados en la enfermedad de Alzheimer.
Sin embargo, se puede utilizar en una variedad de modelos de enfermedad donde la modificación de la cromatina se presume para desempeñar un papel significativo.
Descripción general
Este artículo presenta un método sistemático para la purificación de las histonas H3 y H4, junto con la cuantificación de sus residuos acetilados. El protocolo, optimizado por un estudiante de posgrado, está diseñado para preservar las modificaciones postraduccionales nativas y es compatible con aplicaciones de mediano rendimiento, lo que lo hace adecuado para investigaciones en áreas como la regulación epigenética.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Biología celular
- Epigenética
Antecedentes
- Las histonas son cruciales para el empaquetamiento del ADN y la regulación de la expresión génica.
- Las modificaciones postraduccionales de las histonas son importantes para diversos procesos biológicos.
- Se necesitan métodos eficientes de purificación para estudiar directamente estas modificaciones.
- Este estudio tiene como objetivo abordar las limitaciones de los métodos existentes de bajo rendimiento.
Objetivo del estudio
- Proporcionar una guía integral para la purificación de las histonas H3 y H4.
- Cuantificar residuos de histonas acetilados a partir de extractos celulares y tisulares.
- Generar resultados de alta calidad y reproducibles para facilitar estudios sobre la regulación epigenética.
Métodos Utilizados
- Cultivo celular y extracción utilizando tampones fríos con hielo.
- Purificación de histonas mediante cromatografía en columna y electroforesis SDS-PAGE.
- Neutralización de histonas para una correcta unión y recuperación en la columna.
- Procedimientos escalonados que implican homogenización, centrifugación y elución para un aislamiento óptimo de histonas.
Resultados principales
- El protocolo logra una eficiencia cercana al 100 % en la unión e purificación de histonas.
- Los tiempos de extracción afectan los rendimientos de histonas, siendo una extracción más prolongada la que produce una mayor recuperación de H3 y H4.
- La purificación completa permite el análisis de histonas acetiladas en el contexto de estudios epigenéticos.
Conclusiones
- Este método demuestra una estrategia eficaz para la purificación de histonas que conserva sus modificaciones nativas.
- La técnica es adaptable para análisis de throughput medio, mejorando las capacidades de investigación en estudios epigenéticos.
- Las implicaciones para comprender las modificaciones de histonas en diversos modelos de enfermedades son significativas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la cuantificación confiable de marcas de histonas acetiladas a partir de extractos celulares y de tejido cerebral, lo que apoya la validación de objetivos en el descubrimiento de fármacos epigenéticos. Al preservar las modificaciones post-traduccionales nativas, mejora la reducción de riesgos mecanicistas en estudios preclínicos de enfermedades neurodegenerativas. La compatibilidad del protocolo con flujos de trabajo de throughput medio mejora la confianza predictiva en campañas de identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la acetilación de histonas como biomarcador mecanicista de la regulación transcripcional en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona un aislamiento reproducible de las histonas centrales H3 y H4 para la evaluación funcional de dianas.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación de la eficacia de inhibidores de la HDAC mediante lecturas cuantitativas de acetilación.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera sustratos de histonas purificados adecuados para ensayos de acetilación basados en anticuerpos o en espectrometría de masas.
- Valor operativo: Alcanza una eficiencia de unión a la columna cercana al 100 %, asegurando una entrada consistente para la cuantificación posterior.
- Escalabilidad: Compatible con aplicaciones de throughput medio, lo que permite el cribado de bibliotecas de compuestos dirigidos a modificadores epigenéticos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Facilita la alineación de biomarcadores mediante la cuantificación de cambios en la acetilación inducidos por la enfermedad en tejido cerebral.
- Relevancia del Modelo Preclínico: Demuestra utilidad en modelos transgénicos de Alzheimer tratados con inhibidores de la HDAC.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite la evaluación objetiva del acoplamiento al blanco y la modulación de vías antes de los estudios in vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase de descubrimiento temprano hasta la preclínica, apoyando la verificación de hipótesis, la preparación de ensayos y la toma de decisiones basada en datos en programas de dianas epigenéticas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación funcional de la acetilación de histonas como un nodo regulador en la remodelación de la cromatina.
- Tamizaje: Proporciona extractos cuantitativos y reproducibles de histonas para evaluar los efectos de compuestos sobre las marcas de acetilación.
- Análisis: Permite la medición precisa de residuos acetilados, proporcionando lecturas críticas para la modulación del blanco.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con modelos preclínicos mediante la purificación consistente de histonas a partir de células y tejidos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada y reutilizable para la cuantificación de biomarcadores epigenéticos en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en el mecanismo del blanco al conservar las PTM nativas durante la purificación.
- Valor operativo: Elimina la variabilidad de los métodos de bajo rendimiento, mejorando la reproducibilidad del ensayo.
- Valor estratégico: Reduce la incertidumbre biológica en la selección de blancos epigenéticos, mejorando la calidad de las decisiones de avance o interrupción.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización estratificada por riesgo de modificadores epigenéticos basada en datos cuantitativos de modulación del blanco.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en bioquímica de proteínas y análisis epigenético.
- Depende del acceso a instrumentación para centrifugación, electroforesis y cromatografía en columna.
- Necesita protocolos estandarizados de neutralización y extracción para garantizar la recuperación de histonas.
- Debe tener en cuenta variables específicas del tejido al adaptarse a diversos modelos preclínicos.
- Limitado por la necesidad de un manejo cuidadoso para prevenir la degradación de histonas durante los pasos de precipitación ácida.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Preparation of the Sample Extract
2:38
Preparation of the Crude Histone Extract
3:33
Evaluation of the Presence of Histone and/or Non-histone Protein in Histone Extract
4:14
Purification of Core Histones
5:13
Precipitation of Core Histones
7:02
Results: Human Microglial BV2 Histone Purified and Quantification in Wild Type and Transgenic Mouse Brain
9:02
Conclusion
