Name: Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende a transfectar macrófagos con nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de polietilimina para entregar siRNA eficazmente in vitro e in vivo. Este método silencia genes sin comprometer la viabilidad celular.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81772308) y el nacional de investigación clave y programa de desarrollo de China (Nº 2017YFA0205502).

Todos los métodos que implican animales vivos fueron realizados según el animal cuidado y utilizan las pautas de la Universidad del sudeste, China.
1. preparación de PEI-SPIONs
<ol><li>
Preparación de SPIONs modificado con ácido oleico
	<ol>
<li>Disolver FECLAS3•6H2O y FeSO4•7H2O en el agua bajo la protección de N2.<ol>
<li>Añadir 28 g de FECLAS3•6H2O y 20 g de FeSO4•7H2O en 80 mL de agua desionizada en un vaso de precipitados. Introducir N2 en el agua a través de un conducto de vidrio y revolver hasta que se disuelva la materia sólida.</li>
			<li>Calentar la mezcla de reacción a 72 ° C a una velocidad de agitación de 800 rpm, seguido por la adición de 40 mL de agua de amoníaco (28%). Revuelva durante 5 minutos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Agregar 9 mL de ácido oleico gota a gota en la solución mencionada y revolver a 72 ° C por 3 h.</li>
		<li>Enfriar la solución resultante a temperatura ambiente (RT). Precipitar la solución mediante separación magnética.</li>
		<li>Lavar el precipitado que contiene SPIONs 3 x con alcohol etílico absoluto y, entonces, dispersar el precipitado en 100 mL de n-hexano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de SPIONs modificado con ácido dimercaptosuccínico
	<ol>
<li>Añadir 800 mg de ácido oleico (AO)-modificado SPIONs dispersadas en 200 mL de n-hexano, y 400 mg de ácido dimercaptosuccínico (DMSA) dispersos en 200 mL de acetona, a un matraz de cuello de tres en un baño de agua a 60 ° C. Nota: Para determinar la concentración de OA-modificado SPION obtenida del paso anterior, tomar un pequeño volumen (por ejemplo, 1 mL) de la dispersión de SPION, volatilizar el n-hexano y pesar el polvo resultante.</li>
		<li>Añadir 200 μL de trietilamina gota a gota en la solución mencionada con agitación a 1.000 rpm y reflujo.</li>
		<li>Después de 5 h de agitación y a reflujo, obtener un precipitado negro por separación magnética.</li>
		<li>Dispersa homogéneamente el SPIONs hidrofílicos en agua desionizada ajustando el pH de la solución usando el hidróxido de Tetrametilamonio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de PEI-SPIONs
	<ol>
<li>Añadir gota a gota solución coloidal SPION modificado de DMSA en solución de PEI (10 kDa) en un matraz de 500 mL cuello tres bajo agitación mecánica a 1.000 rpm durante 2 h (WFe: WPEI = 1:3). Nota: La carga y el tamaño de PEI-SPIONs varían dependiendo de la relación deFe de la W a WPEI. LaFede la W: WPEI relación de 1:3 puede ser un buen punto de partida para sintetizar PEI-SPIONs convenientes para la entrega de siRNA.</li>
		<li>Añadir la solución resultante en un tubo de ultrafiltración teniendo un corte de peso molecular de 100 kDa y un contenido de 15 mL; Luego, centrifugar a 5.400 x g por 10 min hasta que la solución restante es de 1 mL. Añadir agua desionizada a la solución para hacer otra vez el volumen de 15 mL y repetir el proceso anterior 10 x para obtener el producto final. A continuación, filtrar la solución con un filtro de 0,22 μm y almacenar el producto final a 4 ° C.</li>
		<li>Determinar la concentración de Fe de PEI-SPIONs por el método colorimétrico usando fenantrolina17. PEI-SPIONs de diluir con agua desionizada estéril a una concentración de 1 mg Fe/mL y almacenar a 4 ° C.</li>
		<li>Diluir 10 μL de la solución de PEI-SPION (1 mg Fe/mL) a 1 mL con agua desionizada; a continuación, probar su tamaño hidrodinámico y potencial zeta mediante un dispositivo de dispersión de luz dinámico. Nota: Preparar PEI-SPIONs en la gama de unos 30-50 nm. En este rango de tamaño, el efecto del tamaño NP en la Unión del siRNA y absorción celular parece no ser significativo. PEI-SPIONs teniendo un potencial zeta media más 37 mV puede ser tóxico en el rango de dosis de transfección, y un ensayo de citotoxicidad se debe realizar para garantizar la seguridad. La carga superficial y el tamaño hidrodinámico de las nanopartículas pueden controlarse dentro de un rango deseado ajustando el contenido del PEI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación y electroforesis del Gel de agarosa de PEI-SPION/siRNA NPs
<ol><li>SiRNA diluido con agua libre de ARNasa para obtener una concentración final de 20 μM (0,26 μg/μL).</li>
	<li>Preparar los cinco libres de Rnasa microcentrífuga tubos etiquetados 0, 1, 2, 4 y 8. Las etiquetas representan cocientes del peso de diferentes Fe: siRNA. Pipeta de 3 μL de solución de siRNA a todos los tubos (~0.8 μg de siRNA/tubo).</li>
	<li>Añadir 0, 0,8, 1,6, 3,2 y 6,4 μg de Fe en forma de PEI-SPIONs en los tubos etiquetados 0, 1, 2, 4 y 8, respectivamente. Mantenga el volumen total de la muestra de cada tubo de menos de 20 μL. Mezclar mediante pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min para permitir la formación de complejos de PEI-SPION/siRNA. Durante este período, hacen una agarosa 3% gel con agarosa de alta pureza. Nota: Adicional PEI-SPION/siRNA complejos con otras proporciones de Fe: siRNA (por ejemplo, 5 o 6) pueden ser preparados y probados.</li>
	<li>Añadir 1 μL de 6 x de buffer de carga de ADN por muestra 5 μL y mezclar con cuidado. Todas las muestras de la carga y correr la electroforesis a 5 V/cm hasta que el azul de bromofenol emigra hasta dos tercios de la longitud del gel. Tinción del gel con bromuro de etidio (EB) durante 15-20 min. Nota: Deben utilizarse solución EB y tampón de electroforesis recién preparada.</li>
	<li>Visualizar bandas siRNA bajo UV sistema de imagen. Comprobar las proporciones de Fe: siRNA en que complejos de formas de siRNA con PEI-SPIONs y, como resultado, las bandas que representan gratis siRNA son retrasados o no detectable.</li>
</ol>3. transfección de 264.7 macrófagos In Vitro
<ol><li>Cultura ratón macrófagos 264.7 células en un plato de 10 cm con DMEM completan medio con 10% suero bovino fetal (FBS) por 100 U/mL de penicilina por 100 estreptomicina μg/mL a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .</li>
	<li>Un día antes de la transfección, aspirar el medio de las células y enjuagarlos con solución salina con tampón fosfato (pH 7,4). Añadir 1 mL de tripsina 0.25% al plato de 10 cm. Trypsinize 264.7 células para unos 5-10 min a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .</li>
	<li>Cuando la mayoría de las células ha separado (después de 5-10 minutos), añadir 5 mL de medio completo DMEM al plato para hacer inactivo de la tripsina. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para dispersar a los racimos de célula en las células.</li>
	<li>Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL estéril. Centrifugue lo a 300 x g durante 3 min a RT. eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células con 5 mL de medio completo DMEM fresco y contar las células.</li>
	<li>Placa 9 x 104 células por bien en una placa de 6 pozos con 2 mL de medio DMEM completo e incuban a 37 ° C en un incubador 5% CO2 por cerca de 24 horas. Nota: Si utiliza una placa de un tamaño diferente, ajustar la densidad celular plateado en proporción a la superficie relativa para que las células lleguen a confluencia del 80% en el momento de la transfección.</li>
	<li>Cuando confluencia celular es del 80%, retire el medio de las células y reemplazar con 1 mL de medio completo DMEM por pozo. Vuelva la placa a la incubadora hasta que PEI-SPION/siRNA complejos se han preparado y están listos para su uso (30 minutos).</li>
	<li>Preparar PEI-SPION/siRNA complejos: calcular la cantidad de complejos de PEI-SPION/siRNA para un experimento de transfección. En un tubo de microcentrífuga de libre de Rnasa de 1,5 mL, mezclar una cantidad adecuada de PEI-SPIONs con siRNA en una proporción determinada Fe: siRNA. Por ejemplo, para preparar el PEI-SPION/siRNA NPs que contiene 100 μg de Fe en una relación de Fe: siRNA de 4, añada 100 μl (1 mg Fe/mL) de PEI-SPIONs a 96 μL de siRNA (0,26 μg/μL), seguir mezclando suavemente con una micropipeta. Incubar durante 30 min a TA. Nota: Preparar un volumen de PEI-SPION/siRNA complejo que es el 10% superior a la masa final total para tener en cuenta las pérdidas incidentales. Hacer complejos de PEI-SPION/siRNA en proporciones bajo Fe: siRNA, bajo el cual las moléculas de siRNA están completamente cargadas en PEI-SPIONs y, por lo tanto, pequeñas cantidades de PEI-SPIONs se pueden utilizar para minimizar la potencial citotoxicidad. Experiencias piloto (análisis del retraso del gel) para la optimización de la relación Fe: siRNA son necesarios.</li>
	<li>Sacar la placa de 6 pozos de la incubadora (paso 3.7). Añadir un volumen requerido de PEI-SPION/siRNA complejo gota a gota a cada pocillo y la placa con cuidado para asegurar una distribución uniforme del remolino. Vuelva la placa a la incubadora hasta la evaluación de la celular absorción o gene precipitación eficiencia (d 1-3). Nota: Los macrófagos transfectar con PEI-SPION/siRNA en una concentración de ~ 15 μg Fe/mL pueden maximizar la eficiencia de transfección minimizando el potencial citotoxicidad.</li>
</ol>4. sistémico entrega de siRNA a macrófagos en ratas con artritis Experimental
<ol><li>Obtener ratas de Wistar machos libre de patógenos específicas que son 7 semanas de edad. Habituar a las ratas para 7 d antes de su uso y proporcionarles agua y alimentos adecuados. Inducir la artritis adyuvante (AA) en las ratas como se describió anteriormente18.</li>
	<li>Preparar PEI-SPION/siRNA complejos como se describe en el paso 3.8.</li>
	<li>Inyecte el NPs de PEI-SPION/siRNA (0,3 mg de siRNA/kg) en la AA las ratas a través de la vena de la cola. Evaluar la absorción celular mediante, por ejemplo, citometría de flujo, tejido biodistribución a través, por ejemplo, una fluorescencia en tiempo real, sistema de la proyección de imagen o efectos terapéuticos basan en, por ejemplo, clínicos, histologic y radiográficos Análisis en el tiempo deseado puntos18. Nota: Para estudios de biodistribución de celular y el tejido, tratar a las ratas con una sola inyección de la NPs deseado; para estudios terapéuticos, se inyectan las ratas con el NPs probadas 1 x por semana por tres semanas consecutivas.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los macrófagos son refractarios a transfectar por enfoques nonviral utilizados, tales como especies de lípidos, liposomas catiónicos y electroporación. Aquí describimos un método confiable y eficiente para transfectar macrófagos con ARNsi. Mediante el presente Protocolo, sobre 90% de macrófagos RAW 264.7 células (figura 2B) y de los macrófagos peritoneales de rata18 puede ser transfectado con siRNA sin deterioro significativo de la viabilidad celular. Este método depe...

Los macrófagos son un tipo de células inmunes innatas distribuidos en todos los tejidos del cuerpo, aunque en diferentes cantidades. Produciendo una variedad de citoquinas y otros mediadores, que desempeñan papeles críticos en la defensa del huésped contra los invasores patógenos microbianos, en reparación de los tejidos posterior a la lesión y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido1. Debido a su importancia, los macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación. Sin embargo, a pesar de su prevalencia en estudios de la función y Regulación génica, silenciamiento génico mediado por siRNA es menos probable que tenga éxito en macrófagos porque estas células — particularmente, los macrófagos primarios — son a menudo difíciles transfectar. Esto se puede atribuir a un relativamente alto grado de toxicidad asociado con enfoques de transfección más bien establecidos en la cual la membrana celular es químicamente (por ejemplo, con polímeros y lípidos) o físicamente (p. ej., por electroporación y pistolas de genes) interrumpen dejó siRNA moléculas cruzan la membrana, reduciendo así drásticamente viabilidad2,3 de macrófagos. Además, los macrófagos son los fagocitos dedicados ricos en enzimas degradativas. Estas enzimas pueden dañar la integridad de los siRNA, debilitando su eficacia silenciar aunque específicos de genes siRNA se ha entregado en la célula3,4. Por lo tanto, un sistema de envío eficaz orientada a macrófago siRNA necesita proteger la integridad y estabilidad del siRNA durante el plazo de expedición4.
Es cada vez más evidente que los macrófagos disfuncionales están implicados en la iniciación y la progresión de ciertos trastornos clínicos comunes como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Por esta razón, modulando la función del macrófago con, por ejemplo, siRNA, ha ido surgiendo como una metodología atractiva para el tratamiento de estos trastornos5,6,7. Aunque se ha progresado mucho, un gran reto de la estrategia de tratamiento basada en el siRNA es la especificidad celular pobre de siRNA sistémico administrado y la siRNA insuficiente captación por los macrófagos, que por lo tanto dar lugar a efectos secundarios indeseados. En comparación con la terapéutica de ácido nucleico libre que generalmente carecen de selectividad óptima de la célula y a menudo conducen a efectos adversos, cargado de droga nanopartículas (NPs), debido a su propensión espontánea de ser capturado por el sistema reticuloendotelial, fuera del objetivo puede diseñarse para apuntar pasivo a macrófagos en vivo, lo que permite mayor eficacia terapéutica con efectos secundarios mínimos8. NPs actuales para la entrega de las moléculas de ARN son nanocarriers inorgánicos y liposomas varios polímeros9. Entre ellos, polietilamina (PEI), un tipo de polímeros catiónicos capaces de atar y condensación de los ácidos nucleicos en NPs estabilizados, muestra el ARN más alta entrega capacidad9,10. PEI protege los ácidos nucleicos de la degradación enzimática y nonenzymatic media a su transferencia a través de la membrana celular y promueve su liberación intracelular. Aunque inicialmente introducido como un reactivo de entrega ADN, PEI fue demostrado posteriormente para ser una plataforma atractiva para en vivo siRNA entrega, ya sea local o sistémicamente9,10.
Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIONs) han demostrado gran promesa en biomedicina, debido a sus propiedades magnéticas, biocompatibilidad, tamaño comparable a objetos biológicamente importantes, alta relación superficie-área-volumen y se adapta fácilmente superficie para bioterrorismo anexo11. Por ejemplo, debido a su utilidad potencial como un agente de contraste y una rápida captación por los macrófagos, SPIONs han surgido como una herramienta clínica favorita a imagen de los macrófagos de tejido12. SPIONs también se han estudiado ampliamente como ácido nucleico entrega vehículos11,13,14,15, a nuestro conocimiento, la literatura contiene algunos informes de SPIONs como un portador para el entrega de siRNA dirigidos a macrófagos. Para la entrega del gene de SPIONs, su superficie es generalmente cubierta con una capa de polímeros catiónicos hidrofílicos en que cargado negativamente los ácidos nucleicos puede ser electrostático atraídos y atados. Aquí, presentamos un método para sintetizar SPIONs cuya superficie se modifica con bajo peso molecular (10 kDa), ramificado PEI (PEI-SPIONs). Estos nanoplatforms magnéticas se emplean entonces para condensar siRNA, formando complejos de PEI-SPION/siRNA que permiten transporte de siRNA en las células. Razón fagocitosis espontánea de SPIONs por las células del sistema reticuloendotelial16, junto con la capacidad fuerte de la Unión y condensación de los ácidos nucleicos por PEI, hace conveniente para el transporte eficiente de siRNA en PEI-SPIONs macrófagos. Los datos aquí presentados apoyan la viabilidad de silenciamiento del gen PEI SPION/siRNA-mediada por macrófagos en cultivo como en vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>cálido en 37 grados; C Baño de agua antes de usar</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>A31608-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (1,5 ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo MTS a base de tetrazolio</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>Para el análisis de citotoxicidad</td></tr><tr><td>Línea celular RAW 264.7</td><td>Banco de células de la Academia China de Ciencias, Shanghái, China</td><td>TCM13</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos (6 pocillos)</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos (10 cm)</td>Tubos sin RNasa <td>430167</td><td></td> <td>Corning</td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td>Tubos de centrífuga <td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>(15 ml)</td><td>Tripsina</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Ratas Wistar</td><td>Centro de Animales Experimentales de Shanghái de la Academia de China </td><td></td><td></td>Ciencias</tr><tr><td>Bacillus Calmette&ndash; Gu&eacute; polvo liofilizado de rin</td><td>Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos, China</td><td></td><td>para inducir artritis adyuvante en ratas</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>GenePharma (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-siRNA</td><td>RiboBio (Guangzhou, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietileneimina (10 kDa)</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>E107079</tr><tr><td>Agua de amoníaco</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A112077</tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Aladdin Reactivo químico Co., Ltd.</td><td></td><td></td>O108484</tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Aladdin Reactivo Químico Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D103272</tr><tr><td>FeSO4&toro; 7H2O</td><td>Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&bull; 6H2O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10011918</td><td></td></tr><tr><td>Ácido dimercaptosuccínico</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D107254</tr><tr><td>tubo de ultrafiltración</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>solución de hidróxido de tetrametilamonio</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>T100882</tr><tr><td>Analizador de tamaño de partícula y potencial zeta</td><td>Malvern, Inglaterra</td><td>Nano ZS90</td><td></td></tr></tbody></table>

nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de arn interferente pequeño a los macrófagos in vitro e in vivo

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Debido a su papel fundamental en la regulación de la respuesta inmune, macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación y representan una prometedora diana terapéutica en muchos trastornos, como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Silenciamiento génico mediado por RNAi es un valioso enfoque de elección para probar y manipular la función del macrófago; sin embargo, la transfección de macrófagos con siRNA se considera a menudo ser técnicamente difícil, y, en la actualidad, existen metodologías pocos dedicados a la transferencia de siRNA a macrófagos. Aquí, presentamos un protocolo del uso de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético revestido polietilamina (PEI-SPIONs) como un vehículo para la entrega específica de siRNA a los macrófagos. PEI-SPIONs son capaces de atascamiento y condensación completamente siRNA cuando la relación de peso de Fe: siRNA alcanza 4 y arriba. In vitro, estas nanopartículas pueden brindar de manera eficiente siRNA primarios macrófagos, así como de la línea celular RAW 264.7 de macrófago-como, sin comprometer viabilidad celular en la dosis óptima para la transfección, y, en última instancia, inducen objetivo mediado por siRNA silenciamiento génico. Además de ser utilizados para la transfección en vitro siRNA, PEI-SPIONs son también una herramienta prometedora para la entrega de siRNA a macrófagos en vivo. Teniendo en cuenta sus características combinadas de propiedades magnéticas y la capacidad de silenciamiento génico, sistémico administradas partículas PEI-SPION/siRNA se espera que para modular la función de macrófagos, pero también para activar macrófagos ser fotografiada y seguimiento. En esencia, PEI-SPIONs representan una plataforma sencilla, segura y eficaz nonviral para entrega de siRNA a macrófagos in vitro e in vivo.

El tamaño y la zeta potencial de PEI-SPIONs preparado con este protocolo estaban en la gama de 29-48 nm (índice de polidispersidad: 0.12 - 0,23) y 30-48 MT, respectivamente. Eran estables en el agua a 4 ° C por más de 12 meses sin evidente agregación. Para evaluar su siRNA vinculante capacidad, PEI-SPIONs se mezclaron con siRNA en diferentes proporciones de peso de Fe: siRNA. La figura 1 muestra que cuando la relación de peso de Fe: siRNA alcanza 4 y superior...

Se describe un método de usar polietilamina (PEI)-recubierto de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas para transfectar macrófagos con ARNsi. Estas nanopartículas pueden administrar siRNA a macrófagos in vitro y en vivo y silencio blanco genes.

Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

Esta medida puede ayudar a responder preguntas clave. En el campo de la humanología. Esa respuesta en la función de los macrófagos bajo el fin fisiológico de las condiciones patológicas.La principal ventaja de esta técnica es que la polietilenimina recubierta puede en vitro eficientemente sin comprometer la célula. Bajo dosis óptimas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de muchos trastornos inflamatorios crónicos y cánceres.Donde los macrófagos juegan un papel esencial en la patogénesis. Demostrar el procedimiento será Na Jia. Un estudiante graduado de mi laboratorio.Y Kaixuan Wang un estudiante graduado del laboratorio del Dr.Xiaohua. Para preparar nanopartículas de óxido de hierro súper paramagnéticas modificadas por ácido allí, o las primeras de SPION añadir 28 gramos de cloruro de pharas hexahidrato. Y 20 gramos de heptahidrato autoate pharas a un vaso de precipitados que contiene 80 mililitros de agua desionizada.Y utilice un conducto de vidrio para introducir nitrógeno en la solución. Revolviendo hasta que la materia sólida se haya disuelto. Calienta la mezcla de reacción a 72 grados Celsius con agitación a 800 rotaciones por minuto.Y añadir 40 mililitros de 28% de agua de amoníaco al vaso de precipitados. Después de cinco minutos añadir nueve mililitros de ácido allílico gota sabia. Y mantener la mezcla a 72 grados Centígrados durante tres horas con agitación continua.Al final de la incubación enfriar la solución resultante a temperatura ambiente. Y precipitar la mezcla a través de la separación magnética de acuerdo con los protocolos estándar. A continuación, lave el SPION que contenga precipitado tres veces con alcohol etílico absoluto.Y aspers el precipitado en 100 mililitros de n-hexano. Para preparar el ácido acrílico dimercapto modificado SPION añadir 800 miligramos del ácido allí modificado SPION. Dispersos en 200 mililitros de n-hexano y 400 miligramos de dimercapto ácido acrílico dispersos en 200 mililitros de acetona en un matraz de tres cuellos en un baño de agua a 60 grados centígrados.A continuación, añadir 200 microlitros de trietilamina gota sabia al matraz con agitación a 1000 rotaciones por minuto y reflujo. Un precipitado negro se puede obtener por separación magnética después de cinco horas. A continuación, utilice hidróxido de tetrametilammonio para ajustar el pH de la solución para dispersos homogéneos de los SPION hidrófilos en agua desionizada.La polietilenimina degenerada recubierta de SPION añade el ácido acrílico dimercapto modificado la solución coloidal de SPION caer sabiamente en una solución de polietilenimina de 10 kilodalton. En un matraz de tres cuellos de 500 mililitros bajo agitación mecánica a 1000 rotaciones por minuto durante dos horas. Al final de la incubación añadir la solución resultante a un tubo de ultrafiltración con un peso molecular cortado de 100 kilodaltones y un contenido de 15 mililitros.Centra la muestra hasta que la solución restante alcance un volumen de un mililitro. Añadir agua desionizada a la solución para devolver el volumen a 15 mililitros. Y centra y rehidrata la solución diez veces más como se acaba de demostrar.A continuación, filtre la solución a través de un filtro de 22 micras para almacenarla a cuatro grados centígrados. Para preparar primero las nanopartículas de siRNA agregue tres microlitros de 20 soluciones de siRNA micromolar recién preparadas a cinco tubos de microcentroafusión libres de ARN etiquetado. Y agregue 0, 8, 1.6, 3.2 y 6.4 microgramos de polietilenimina SPION a tubos etiquetados con cero, uno, dos, cuatro y ocho respectivamente.Después de mezclar con pipeteo suave, incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de siRNA de polietileno SPION. Y prepara un gel de agarosa del tres por ciento con agarosa de pureza. Al final de la incubación añadir un microlitro de 6X Tampón de carga de ADN por cinco microlitros de muestra a cada tubo y mezclar cuidadosamente.A continuación, cargue todas las muestras en el gel. Y ejecuta electroforesis a cinco voltios por centímetro. Hasta que el colorante azul bromofenol migra dos tercios de la longitud del gel.Un día antes de la transfección lavar un microfago de ratón como RAW264.7 cultivo celular con PBS. Y tratar las células con un mililitro de 25% de trippsina durante cinco a diez minutos a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono cinco por ciento. Cuando la mayoría de las células se han desprendido.Inactivar la trippsina con cinco mililitros de DMEN completo. A continuación, pipte la solución varias veces para dispersar cualquier clúster de celdas. Transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros de conackel para centrifugación.Luego re suspenda las células en cinco mililitros de DMEN completo fresco para contar. Diluir las células a una 4,5 veces diez a las cuartas células por mililitro de concentración completa de DMEN. Y añadir dos mililitros de medio a cada pozo de un plato de seis pozos para una incubación de 24 horas en la incubadora de cultivo celular.Al día siguiente preparar la proporción adecuada de nanopartículas de siRNA de polietilenimina SPION en un tubo de microcentrífuga de flujo de ARN de 1,5 mililitros con mezcla suave como se acaba de demostrar. Y añadir el volumen adecuado de polietilenimina SPION siRNA complejo de nanopartículas a cada pozo que ha sido reemplazado por un mililitro de medio fresco. Preparar complejos de polietilenimina SPION si.en este caso se pueden utilizar muchos más meses de polietilenimina SPION minimizando así su toxicidad potencial. A continuación, gire la placa cuidadosamente para lograr una distribución uniforme de las nanopartículas a través de los fondos de los pozos. Devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular hasta que se actualice la actualización celular posterior o se anule el análisis de deficiencia de desencamiento genético.Los SPION de polietilenimina con un potencial zeta de 30,5 y 37 milivoltios no presentan una toxicidad aparente del cito a concentraciones de hasta 30 microgramos de hierro por mililitro. Que es aproximadamente dos veces contratada que la concentración normalmente utilizada para la transfección celular. El potencial zeta de polietilenimina SPION de 48 milivoltios sin embargo son tóxicos.Incluso a la dosis más baja examinada. Según lo analizado por la citometría de flujo, más del 90% de las células pueden ser transfectadas con complejos de siRNA SPION de polietileno con etiqueta fluorescente a 15 microgramos de hierro por mililitro. La evaluación de los efectos de las concentraciones de siRNA de polietilenimina SPION en la internalización celular mediante el aplastamiento de la tinción azul revela una tinción mínimamente detectable a 7,5 microgramos de hierro por mililitro.Pero manchas claramente visibles a 15 microgramos de hierro por mililitro que no aumentan a mayores concentraciones de hierro probablemente debido a la saturación de absorción de siRNA de polietilenimina SPION. Los macrófagos peritoneales trans infectados con el SIRNA específico de polietilenimina SPION presentan una disminución significativa en los niveles de ARNm de targe en comparación con el siRNA no específico. Sugiriendo que el siRNA puede escapar de las vesículas endocíticas en el citoplasma para llegar a la maquinaria de interferencia de ARN.Después de la inyección intravenosa de una dosis única de complejos de nanopartículas DE polietileno SPION siRNA, el análisis flocentimétrico de células CD11b positivas y CD3 positivas revela una absorción más eficiente de las nanopartículas por CD11b expresando macrófagos que por células positivas CD3 en cualquier momento en todos los órganos examinados. Al intentar este procedimiento es importante recordar preparar la polietilenimina SPION con un potencial de datos promedio no superior a 37 milivoltios y preparar los complejos de siRNA DE SIRNA de polietilenimina SPION en las proporciones bajas de hierro a siRNA. Esta técnica compara la necesidad de que los investigadores exploren el potencial terapéutico de apuntar a los macrófagos en motores animales de enfermedades humanas como el cáncer.

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Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

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En este protocolo, describimos métodos para transfectar eficientemente líneas celulares de macrófagos murinos con siRNAs utilizando el sistema de lanzadera Amaxa Nucleofector de 96 pocillos, estimular los macrófagos con lipopolisacáridos y monitorear los efectos sobre la producción de citoquinas inflamatorias.

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Aquí, entregamos imitaciones exógenas de miARN sintetizadas artificialmente al riñón a través de la inyección de venas de cola de un vector no viral y nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal. Esto condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en el riñón, lo que resultó en una progresión inhibida de la enfermedad renal en varios modelos de ratón.

Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal

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Monitorización de la acumulación de nanofármacos en metástasis de cáncer de mama murino

La barrera hematoencefálica es un obstáculo importante en la administración de terapias para el glioblastoma, una enfermedad para la que no hay cura. Aquí, reportamos una nano plataforma terapéutica de óxido de hierro guiada por imágenes in vivo que puede eludir esta barrera fisiológica en virtud de su tamaño y acumularse en el tumor.

Entrega de nanopartículas de una carga útil de oligonucleótidos en un modelo animal de glioblastoma multiforme

Aprende a transfectar macrófagos con nanopartículas de óxido de hierro recubiertas de polietilimina para entregar siRNA eficazmente in vitro e in vivo. Este método silencia genes sin comprometer la viabilidad celular.

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Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

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