Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs)

Este protocolo paso a paso proporciona una descripción detallada de la disposición experimental y análisis de datos para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs y el análisis de la adherencia del leucocito bajo flujo fisiológico.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de células madre pluripotentes humanas sobre la funcionalidad y las respuestas inflamatorias de las células endoteliales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una descripción detallada de la configuración experimental y el análisis de datos para la evaluación de la adhesión de leucocitos a las células endoteliales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre. Para el recubrimiento de viruta microfluídica, coloque un biochip estéril en un plato petri estéril de 10 centímetros y utilice una punta de pipeta de 10 microlitros para inyectar 10 microlitros de solución de trabajo de fibronectina recién preparada en cada canal del biochip.

Cubra el plato de Petri y colóquelo en una cámara humidificada durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, precalentar el biochip en una incubadora de 37 grados Celsius, y re-suspender células endoteliales inducidas por humanos derivadas de células madre recolectados de un cultivo celular de 80 a 100% confluente a la concentración deseada en un medio fresco libre de lípije de células endoteliales. A continuación, aspirar la solución de fibronectina de todos los canales del chip microfluídico, y mezclar a fondo las células para obtener una suspensión celular homogénea antes de utilizar una punta de pipeta de 10 microlitros para inyectar seis microlitros de células en cada canal.

Examine el biochip bajo el microscopio para confirmar que las células se distribuyen uniformemente con una alta densidad celular. Después de 15 minutos a 37 grados Celsius, agregue 40 microlitros de medio medio libre de suero de células endoteliales FULL en los depósitos medios a ambos lados de cada canal. Y devuelve el biochip a la incubadora durante una hora.

Luego, agregue otros 50 microlitros de medio libre de suero de células endoteliales FULL en los reservorios a ambos lados de cada canal. Para obtener imágenes en vivo de las células sembradas, confirme que las configuraciones microfluídicas están listas, que la cámara de imágenes en vivo está equilibrada a 37 grados centígrados y que el nivel de CO2 ha alcanzado el 5% Coloque el biochip en el soporte del chip del microscopio y monte el soporte del chip en la etapa de imagen del microscopio. Para conectar el biochip a la bomba a través del colector, coloque el adaptador de ocho pines cerca de los depósitos de salida del chip y profundice todos los pines en el medio sin conectar los pines por completo.

En el software de bomba microfluídica, seleccione Washout/Connect to chip y haga clic en Ejecutar paso de ensayo para dispensar 30 microlitros de medio RPMI a través de cada pin. A continuación, inserte el adaptador de ocho pines en la salida del biochip. Utilice una pipeta para aspirar manualmente el medio de todos los depósitos de entrada del biochip, y seleccione Washout/Chip Washout and Run Assay Step para perfundir un canal a la vez con 40 microlitros de medio libre de suero de células endoteliales Full para eliminar las células muertas y los desechos.

Una vez lavados todos los canales, sustituya el medio del depósito de entrada del canal de interés por 100 microlitros de leucocitos humanos diluidos a 2,5 veces 10 a las seis células por mililitro de concentración en EL medio RPMI. Haga clic en Descripción de ensayo/paso de celda y establezca la descripción del canal/paso actual y establezca el canal de interés en Activado y los otros siete canales en Desactivado.

Sustituya los leucocitos restantes en el depósito de entrada por 100 microlitros de medio RPMI completo. Y haga clic en Descripción del paso de ensayo de celda y Ejecutar paso de ensayo para perfundir el canal durante cinco minutos con el medio RPMI para eliminar cualquier leucocitos no adherente. A continuación, adquiera imágenes de al menos tres a cuatro posiciones diferentes en el canal para visualizar los leucocitos adheridos.

Para cuantificar los leucocitos adherentes, abra el software de procesamiento de imágenes CellProfiler e importe el archivo Count Leukocytes Pipeline. En Módulos de entrada, seleccione Imágenes y arrastre y suelte la carpeta con las imágenes sin procesar de los leucocitos adherentes a la ventana de lista Archivo. En Módulos de análisis, seleccione Identificar objetos primarios e indique los diámetros mínimos y máximos de los leucocitos adherentes en píxeles.

En Módulos de análisis, seleccione FilterObjects. A continuación, seleccione los criterios de filtrado e introduzca el área mínimamente aceptada de los objetos en píxeles y haga clic en Analizar imágenes para comenzar el análisis. La disociación óptima de células endoteliales derivadas de células madre inducidas por el hombre debe dar lugar a una suspensión de una sola célula libre de grumos celulares.

Típicamente, 15 minutos después de la inyección las células endoteliales se unen a la parte inferior del canal y comienzan a extenderse. Dentro de una hora después de la inyección, las células endoteliales deben formar una monocapa bien distribuida a través del canal, momento en el que están listas para su uso en el ensayo Flow. El uso del software gratuito de procesamiento de imágenes de código abierto como se ha demostrado permite filtrar los objetos identificados en función de un área mínima y la exclusión de objetos identificados falsamente, como desechos celulares, autofluorescencia o cualquier otra señal fluorescente no específica.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar la estimulación con citoquinas proinflamatorias e incluir las células endoteliales de venas umbilicales humanas primarias como un control positivo. No olvide que trabajar con líneas celulares y celulares de mamíferos primarios puede ser extremadamente peligroso y que las precauciones como el uso de abrigo de laboratorio, guantes y protección ocular siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.