Name: Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprende a evaluar la adherencia de leucocitos en células endoteliales derivadas de hiPSC mediante microfluidos. Este protocolo permite estudiar respuestas inflamatorias en tiempo real con imágenes vivas.

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Los autores desean reconocer las siguientes becas: Consejo Europeo de investigación (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Países Bajos iniciativa de órgano-on-Chip, un proyecto de nuevo orden mundial gravitación financiado por el Ministerio de educación, cultura y ciencia del gobierno de los países bajos (024.003.001).

1. preparación de soluciones y reactivos
<ol><li>Preparar el medio completo endotelial humana-SFM (CE-SFM completo) agregando suero de derivados de plasma pobre en plaquetas (1%), factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF, 20 ng/mL) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 50 ng/mL) a humanos endotelial-SFM (véase tabla de Materiales). Filtrar el medio a través de un filtro de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C hasta por 2 semanas.</li>
	<li>Preparar el Medio RPMI completo mediante la adición de suero fetal bovino (10%), 2-Mercaptoetanol (0.05 nM), L-glutamina (1%), penicilina-estreptomicina (25 U/mL) en Medio RPMI (véase Tabla de materiales). Almacenar a 4 ° C hasta por 3 semanas.</li>
</ol>2. capa de microfluidos Chips
<ol><li>Lugar un biochip estéril en una placa de Petri estéril de 10 cm.</li>
	<li>Preparar solución de trabajo de fibronectina por reconstituir la solución stock en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca2 +/Mg2 + a una concentración final de 50 μg/mL. Estimar 80 μl de solución de trabajo por el biochip.</li>
	<li>Inyecte 10 μl de solución de trabajo de fibronectina en cada canal de los biochips. Utilice una pipeta con pequeñas puntas de μl 10 y asegúrese de que formar un contacto apretado entre la entrada del canal y la punta de la pipeta (figura 1, izquierda).</li>
	<li>Cierre la tapa de la caja de Petri que contiene el biochip y colocarlo en una cámara humidificada (figura 2B). Guarde la cámara a 4 º C durante la noche. Para humidificar la cámara, ponga un papel limpio de tejido en la parte inferior de la cámara humidificada y añadir 5 mL de estéril de H2O.</li>
	<li>Al día siguiente, antes del ensayo, precaliente el biochip a 37 ° C en la incubadora.</li>
</ol>3. preparación de hiPSC-ECs
Nota: En el protocolo descrito aquí, hiPSC-ECs fueron distinguidos, purificadas, congelados y descongelados como se describió anteriormente8.
<ol><li>Deshielo y placa hiPSC-ECs en completa CE-SFM en un 0.1% gelatina cubierto T75 matraz tres o cuatro días antes del ensayo.</li>
	<li>La noche antes del ensayo, estimular hiPSC-ECs con TNFα mediante la adición de CE-SFM completo suplementado con TNFα de 10 ng/mL e incubar durante la noche (~ 12 h) a 37 ° C, como se describió anteriormente 7.</li>
</ol>4. hiPSC-ECs disociación y siembra en Chip de microfluidos
<ol><li>En el día de la prueba, tome el frasco de hiPSC ECs de la incubadora y examina las células bajo el microscopio. Asegúrese de que hiPSC ECs son confluentes de 80 – 100% y tienen una morfología típica de EC-como.</li>
	<li>Transferir el matraz en la campana de la cultura de célula.</li>
	<li>Aspire el medio del frasco de hiPSC-ECs.</li>
	<li>Lavar brevemente el cultivo celular mediante la adición de 10 mL de PBS sin Ca2 +/Mg2 +. Aspire el PBS.</li>
	<li>Añadir 4 mL cada frasco de enzima de la disociación de 1 x. Incubar por 5 min a temperatura ambiente (RT) (figura 1B).</li>
	<li>Detener la reacción de disociación añadir 8 mL de medio humano endotelial-SFM por frasco. Con cuidado separar y recoger la suspensión hiPSC ECs en un tubo cónico de 15 mL con una pipeta de 5 mL.</li>
	<li>Contar el número total de células en la suspensión.</li>
	<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min a TA.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en CE-SFM a una concentración final de 1,5 x 107 células/mL.</li>
	<li>Sacar la placa de Petri con el biochip de la incubadora y transferirlo a la campana de la cultura de célula.</li>
	<li>Aspirar la solución de la fibronectina de todos los canales del chip de microfluidos.</li>
	<li>Inyecte 6 μl de la suspensión celular en cada canal con una pipeta con una punta pequeña 10 μl (figura 1, medio). Asegúrese de que la suspensión de células se mezcla bien antes de la inyección y evitar la precipitación de la célula.</li>
	<li>Examinar el biochip bajo el microscopio y asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente, y la densidad celular es alta (figura 2).</li>
	<li>Incubar el biochip por 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Agregar 40 μl de SFM CE completo en los embalses medianos de ambos lados de cada canal.</li>
	<li>Incubar el biochip por 1 h a 37 ° C (figura 1, derecha).</li>
	<li>Añadir otro 50 μl de SFM CE completo en los depósitos de ambos lados de cada canal.</li>
</ol>5. preparación de leucocitos humanos
Nota: En el protocolo descrito aquí, se utilizó una línea de células monocytic comercialmente disponibles (THP-1). Como alternativa, pueden utilizar las células mononucleares de sangre periférica o neutrófilos. Aislamiento de neutrófilos y monocitos de sangre periférica se puede realizar mediante el procedimiento estándar de11. Realizar todos los pasos descritos en este párrafo en una campana de cultivo celular.
<ol><li>Recoger los leucocitos en un tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Lave los leucocitos con 10 mL de PBS sin Ca2 +/Mg2 +. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente (figura 1).</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con tinte DiOC6 (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5, 000). Incubar las células en la oscuridad durante 10 min a TA.</li>
	<li>Lave los leucocitos con 10 mL de PBS sin Ca2 +/Mg2 +. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min a RT. repetir el paso de lavado una vez más.</li>
	<li>Contar el número total de células en la suspensión.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en Medio RPMI completo a una concentración final de 2.5 x 106 células/mL.</li>
</ol>6. preparación de la bomba de la microfluídica
<ol><li>Montar la bomba de microfluidos con el múltiple de 8 canales.</li>
	<li>Conecte la bomba a un PC con el software operativo instalado.</li>
	<li>Inicie el software de microfluidos y el protocolo de carga haciendo clic en el Protocolo abierto y navegar en el PC para seleccionar el protocolo de microfluidos.</li>
	<li>Conecte la bomba y el software seleccionando la carpeta de instalación y haga clic en Ejecutar Análisis de paso.</li>
	<li>Definir la geometría de los canales para el control de la tasa de flujo correcto: seleccione Actualización de geometría en la carpeta de Configuración de la geometría y haga clic en Ejecutar Análisis de paso. Nota: Asegúrese de que los datos de la geometría coincide con la jeringa y canales que se utilizarán (geometría ID = 1, número de canales = 8, ancho de canal = 800.0 μm, profundidad de canal = 120.0 μm, volumen de la jeringa = 250 μL) y la viscosidad de la muestra (líquido viscosidad = 1.0).</li>
	<li>Lave la bomba colocando el cable de entrada (naranja) en el tubo cónico de 50 mL con etanol al 80%. Coloque el cable de salida (verde) en el tubo vacío cónico de 50 mL (contenedor de residuos).</li>
	<li>Seleccione la carpeta de Lavado bomba de lavado y haga clic en Ejecutar paso de análisis (volumen de lavado = 2000 μl, paso de volumen de lavado = 250 μl, dirección de lavado = salida). Repita el paso de lavado una vez más.</li>
	<li>Repita la bomba lavado pasos (pasos 6.6-6.7) y agua de grado cultivo celular, medio de cultivo endotelial humana-SFM.</li>
	<li>Continúe con el paso del lavado de los colectores.</li>
	<li>Abrir manualmente la válvula entre la jeringa y el colector poniendo el adaptador de 3 vías en la posición correcta (indicador apagado se gira a la izquierda).</li>
	<li>Seleccione Canal actual o abrir paso en la carpeta de Colector de lavado lavado y haga clic en Ejecutar análisis paso para abrir todas las válvulas del colector.</li>
	<li>Lavar el colector manualmente presionando 5 mL de etanol al 80% de la jeringa, seguida por 5 mL de agua de grado cultivo celular.</li>
	<li>Lavar el colector presionando 5 mL de medio de cultivo endotelial humana-SFM de la jeringa.</li>
	<li>Eliminar todas las burbujas de aire que están atrapadas en el colector. Para ello, coloque el adaptador del pin 8-bien en los 10 cm placa de Petri con el medio y realizar empujando/tirando con la jeringa hasta que hayan desaparecido todas las burbujas grandes de aire (burbujas pequeñas no son un problema).</li>
	<li>Seleccione paso Cerca de canal actual en la carpeta de Colector de lavado lavado y haga clic en Ejecutar Análisis de paso para cerrar todas las válvulas del colector.</li>
	<li>Conecte el cable verde de salida de la bomba al adaptador múltiple.</li>
	<li>Cambiar la válvula de 3 vías a la posición OFF para cerrar la jeringa.</li>
	<li>Seleccione Cable lavado lavado carpeta y haga clic en Ejecutar análisis paso para lavar cada puerto con Medio RPMI individualmente, asegurando que todas las burbujas se quitan de cada cable (volumen de descarga = 100 μL). Nota: Cada válvula del colector abierto uno por uno, 1 a 8 y 100 μL del medio se distribuye a través de cada canal individual mientras que los otros canales de mantener cerraron. Asegúrese de que el líquido entra de cada pin. Si no hay ningún líquido que sale, es una indicación de una burbuja de aire o un estorbo.</li>
</ol>7. preparación del Chip de microfluidos para vivir imágenes
<ol><li>Asegurar que las configuraciones de microfluídica están listas y la sala de proyección de imagen vivo es previamente equilibrada a 37 ° C y el nivel de CO2 alcanza el 5% (Figura 3A, B).</li>
	<li>Tomar el biochip de la incubadora y coloque en el soporte del chip de microscopio. Monte el soporte del chip en el microscopio de fase (figura 3).</li>
	<li>Para conectar el biochip para la bomba a través de los colectores, coloque el adaptador de 8 pines cerca de los embalses de la salida de la viruta y profundizar todos los pines en el medio (pero no conecte completamente).</li>
	<li>Seleccione el derrubio de | Conectar con Chip carpeta y haga clic en Ejecutar análisis paso a dispensar Medio RPMI antes de conectar el chip (volumen de descarga = 30 mL). Una vez que el medio se dispensa, inserte el adaptador de 8 pines en la salida de los biochips. Nota: Durante este paso, todos los canales se establecen en (abierta) y 30 μL del medio se distribuye a través de cada canal y a continuación se establecen los canales en Off (cerrado). Esto no asegura que ningún aire burbujas se introducirá en los canales del chip de microfluidos.</li>
	<li>Manualmente aspirar el medio de todos los depósitos de entrada de los biochips con una pipeta.</li>
	<li>Seleccione el derrubio de | Derrubio de la viruta carpeta y haga clic en Ejecutar análisis paso a perfusión 40 mL de medio completo de CE-OFS a través de cada uno de los canales uno por uno para eliminar las células muertos/restos del canal (volumen de lavado = 40 μl, esquileo de lavado máximo = 40 dinas/cm2).</li>
</ol>8. flujo de ensayo de adherencia y la adquisición de la imagen
<ol><li>Manualmente aspirar el medio de la reserva de la entrada del canal de interés con una pipeta.</li>
	<li>Añada 100 μl de los leucocitos de paso 5.6 para el depósito de entrada del canal de interés. Nota: Mezclar suavemente las células para hacer una suspensión unicelular.</li>
	<li>En el ensayo de células de | Paso descripción carpeta, seleccione Descripción corriente de canal/paso y, en la lista de canales, seleccione sólo el canal actual de interés y establece on (abierto) y otros siete canales en Off (cerrado).</li>
	<li>Seleccionar el ensayo de células de | Paso descripción carpeta y haga clic en Ejecutar Análisis de paso. Nota: Asegúrese de que Variable flujo tasa de dosificación se aplica presión negativa constante a la suspensión de leucocitos de la reserva de entrada a través del canal durante 5 minutos (conjunto del esquileo = constante, esfuerzo cortante =-0,50 Dina/cm2, duración = 00:05:00, SCAN delay = 00:00:00). El valor negativo de la tensión de esquileo asegura la dirección correcta del flujo.</li>
	<li>Aspire los leucocitos restantes del depósito de entrada.</li>
	<li>Añada 100 μl de Medio RPMI completo en el depósito de entrada. Seleccione carpeta de Descripción de la célula ensayo/paso y haga clic en Ejecutar análisis paso para inundar el canal durante 5 minutos con Medio RPMI para lavar todos los leucocitos no adherente (conjunto del esquileo = constante, esfuerzo cortante =-0,50 Dina/cm2, duración = 00: 05:00, análisis demora = 00:00:00).</li>
	<li>Adquirir imágenes de al menos tres o cuatro posiciones del canal a la imagen los leucocitos adheridos (para asegurar que las zonas representativas son capturadas).</li>
	<li>Repita los pasos 8.1 – 8.7 para valoración funcional del resto de los canales. Nota: Es posible ejecutar varios canales a la vez. Para ello, Abra todos los canales de interés durante el paso 8.3. y realizar los mencionados pasos 8.4 –8.7 para múltiples canales de interés.</li>
</ol>9. completar el análisis y limpieza de la bomba de la microfluídica
<ol><li>Después de completar el experimento, exportar y guardar todas las imágenes en formato RAW.</li>
	<li>Al guardar los resultados, ejecute la bomba microfluídicos y el colector protocolo de limpieza.</li>
	<li>Para la bomba de microfluidos, ejecute primero la carpeta de la Bomba de lavado lavado por perfundiendo 4 mL de agua de grado cultivo celular, seguido por 4 mL de 80% etanol como se describe en pasos de 6.6 – 6.7 seco la bomba funcionando aire durante varios minutos.</li>
	<li>Para limpiar el colector, ejecute paso de Colector de lavado lavado con la jeringa. Siga los pasos para abrir la jeringa y el colector de válvulas como se describe en pasos 6.10-6.11 lavado primero con etanol al 80% y el próximo con agua de grado cultivo celular. Seque el colector por empujar el aire a través de la jeringa. Cierre la válvula de la jeringa y las válvulas múltiple como se describe en pasos 6.10 y 6.15.</li>
</ol>10. recuento de leucocitos adherentes
<ol><li>Descargar e instalar el software14 de http://cellprofiler.org de procesamiento de imágenes. Nota: Procesamiento de imágenes en este estudio se realizan utilizando el software versión 2.1.1. Si utiliza una versión más reciente, la tubería podría requerir menor adaptación.</li>
	<li>Descargar la tubería Count_leukocytes.cpipe. Haga clic en archivo de | Importación | Tubería desde el archivo y navegar en el PC para seleccionar la tubería Count_leukocytes.cpipe.</li>
	<li>Arrastrar y soltar una carpeta de imágenes adquiridas de los leucocitos adherentes a la ventana de lista de archivo en los módulos de entrada | Imágenes sección para el análisis.</li>
	<li>Especificar el tamaño típico de los leucocitos mediante módulos de análisis | IdentifyPrimaryObjects. Especificar el diámetro mínimo y máximo de los leucocitos adherentes en píxeles.</li>
	<li>Seleccione los criterios de filtrado mediante módulos de análisis | FilterObjects. Especificar el área mínima aceptado de objetos en píxeles.</li>
	<li>Iniciar el análisis pulsando el botón de analizar imágenes . Nota: Se procesarán todas las imágenes RAW, y los resultados se guardarán en una carpeta de salida predeterminada. El archivo Image.txt contiene los números de leucocitos adherentes en cada imagen procesada (cada número corresponde a una imagen, es decir, cada campo visual adquirida).</li>
</ol>

<ol><li>Vestweber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+leukocytes+cross+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">How leukocytes cross the vascular endothelium.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).</li>
<li>Hajishengallis, G., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+modulators+of+inflammatory+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment.</a> Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).</li>
<li>Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+endothelial+responsiveness+to+cytokines%2C+molecular+causes%2C+and+pharmacological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+thrombosis+and+hemostasis%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences.</a> Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cell+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cell Heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429(2012).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).</li>
<li>Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation%2C+Evaluation%2C+and+Application+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).</li>
<li>Halaidych, O. V., Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Responses+and+Barrier+Function+of+Endothelial+Cells+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. , (2018).</li>
<li>Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li>
<li>Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionality+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+human+pluripotent+stem+cells+demonstrated+in+cultured+vascular+plexus+and+zebrafish+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).</li>
<li>Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow+Adhesion+Assay+to+Study+Leucocyte+Recruitment+to+Human+Hepatic+Sinusoidal+Endothelium+Under+Conditions+of+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).</li>
<li>Muller, W. A., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+transendothelial+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Assays of transendothelial migration in vitro.</a> Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Umbilical+Vein+Endothelial+Cells+and+Their+Use+in+the+Study+of+Neutrophil+Transmigration+Under+Flow+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).</li>
<li>Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+Flow-based+Assays+to+Investigate+Leukocyte+Recruitment+on+Cultured+Vascular+Cells+and+Adherent+Platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe la caracterización del tratamiento CE hiPSC con estímulos proinflamatorios, como el TNFα, evaluación funcional de la adherencia del leucocito a hiPSC-ECs en el análisis del flujo usando proyección de imagen de vivo y automatizado de conteo de los leucocitos adherentes.
La estimulación de hiPSC-ECs con TNFα resultados en el aspecto alargado que normalmente indica un fenotipo pro-inflamatorias activado en ECs. Durante la etapa de optimización, expresión niveles de l-selectina, ICAM-1, VCAM-1 deben ser verificados por FACs7,8y la vena umbilical humana primaria ECs (HUVECs) son recomendables para ser incluidos como controles positivos.
Disociación de óptima hiPSC-ECs y densidad de siembra deben alcanzarse para lograr una monocapa confluente sin formar grumos de células y obstrucciones del canal. Es fundamental para volver a suspender el derecho de leucocitos antes de perfusión para evitar la precipitación de la célula y mantener una concentración constante cuando ensayando cada canal. Leucocitos de sangre periférica, tales como monocitos y neutrófilos pueden ser utilizados, o líneas de célula monocítica, establecieron como THP-1 o HL-60 podría ser utilizado como una alternativa.
Durante el montaje de la instalación de microfluidos y durante el análisis del flujo, es fundamental para evitar burbujas de aire de quedar atrapado en la tubería de microfluidos y canales ya que en el desprendimiento de hiPSC ECs o leucocitos adherentes. Interfaz de líquido a líquido o incorporación de los pasos de lavado adicional durante la preparación de la configuración de microfluidos podría ayudar a prevenir las burbujas de aire.
Es recomendable que el protocolo está a cargo de dos operadores donde uno prepara las células y el segundo prepara el ensayo de flujo y sistema de microfluidos. Esto asegura que el ECs se platean en chips de microfluídica dentro de un intervalo de tiempo constante antes del procesamiento y mejora la precisión y la reproducibilidad de los resultados. Además, también permite establecer experimentos ciegos para evitar sesgos en los resultados.
Para la detección de acertado de la célula con la canalización de proceso de imagen automatizada, es importante para adquirir imágenes en foco con un alto cociente signal-to-noise y evitar autofluorescence de objetos inespecíficos, tales como grupos de células. De crucial importancia es la correcta especificación de los límites mínimos y máximos del tamaño típico de los leucocitos adherentes que necesitan ser identificadas. Uno puede estimar el tamaño típico de los leucocitos en una herramienta de medición de línea de ImageJ. Por ejemplo, en nuestro análisis, hemos utilizado el rango de 9 – 15 píxeles que se corresponde con el tamaño físico de 10.3 – 17,1 μm (figura 4). Cuando se utiliza un rango de mal, por ejemplo, 3 – 15 pixeles (3.4-17,1 μm), se identifica un solo leucocito no como una célula, sino más bien sus subpartes se identifican como objetos separados (figura 4). Esto conduce al falso número de objetos a ser identificado.
Muchos objetos de baja intensidad y menor área de superficie de leucocitos pueden detectarse mediante el método de umbralización adaptativa proporcionada. Esto puede tomar lugar por autofluorescencia o cualquier otras señales fluorescentes no específicos. Sin embargo, estos objetos no específica, si su área es menor que el área típica de un leucocito solo, pueden ser filtrados por definir la superficie mínimamente aceptada (figura 4).
El análisis de flujo se describe aquí permite la evaluación directa de la adherencia del leucocito a una monocapa de CE, dilucidar la interacción de estas dos células tipos, pero no toma en cuenta otros tipos, como pericitos que se presentan en la pared vascular y puede también participar en la regulación de la extravasación de leucocitos15. Integración de un microambiente cultura 3D con otros tipos de células podría mejorar la importancia fisiológica del sistema. A pesar de estas limitaciones, el análisis del flujo para la evaluación de las respuestas inflamatorias descrito aquí proporciona una valiosa herramienta para enfermedad y caracterización básica aplicaciones de modelado de hiPSC-ECs.

La inflamación juega un papel fundamental en muchas condiciones patológicas, incluyendo cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas, sepsis y respuestas adversas (ADRs). Las células endoteliales (ECs) juegan un papel esencial en la regulación de las respuestas inflamatorias a través de la inducción de receptores Pro-adhesivos, como la molécula 1 de adhesión E-selectina, intercelular (ICAM-1) y vasculares de la célula molécula 1 de adhesión (VCAM-1) en su superficie 1 , 2. ECs microvascular en diferentes tejidos se sabe que presentan heterogeneidad en las respuestas inflamatorias3,4. Además, antecedentes genéticos o ciertas condiciones genéticas podrían dar lugar a las diferencias en las respuestas inflamatorias entre individuos; por lo tanto es importante tener acceso a ECs de diferentes individuos. Más recientemente, humanas pluripotentes inducidas células (hiPSCs)5, que se pueden derivar de cualquier individuo, fueron demostrados para servir como una fuente confiable y renovable de ECs6,7,8, 9. por lo tanto, la evaluación de las respuestas inflamatorias y reclutamiento leucocitario en hiPSC-ECs es valiosa, no sólo para el modelado de ciertos trastornos genéticos, sino también para proporcionar indicios de variabilidad interindividual y utilizar como una herramienta para medicina personalizada en el futuro.
Análisis de flujo proporcionan una herramienta útil para estudiar la interacción leucocito endotelial. Los avances en dispositivos microfluídicos permiten la reproducción de las condiciones de flujo de fluidos fisiológicos con un control preciso de los niveles de tensión de esquileo de específicos de la cama vascular. En proyección de imagen permite el control de la cascada de eventos de captura del leucocito, rodar, gatear, adhesión y transmigración. Se han desarrollado varios ensayos de flujo al estudio de la interacción de leucocitos endoteliales, sin embargo, todos ellos utilizan primaria ECs10,11,12,13. Aquí describiremos en detalle el análisis para la evaluación de la adherencia del leucocito humano a hiPSC-ECs bajo flujo fisiológico. En este procedimiento, se describen condiciones optimizadas de estimulación CE hiPSC con estímulos proinflamatorios, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), disociación, siembra en un chip de microfluidos con ocho canales paralelos. Describir un protocolo paso a paso para la perfusión de ECs hiPSC con la suspensión de leucocitos fluorescencia etiquetadas en chips de microfluídica, vivimos la proyección de imagen de la célula y automatizado de recuento de leucocitos adherentes.
Este protocolo es útil para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs en detección de drogas, modelos de enfermedad y medicina regenerativa personalizada.

<table><tbody><tr><td>Vena8 Endothelial+ biochip</td><td>Cellix Ltd</td><td>V8EP-800-120-02P10</td><td></td></tr><tr><td>Mirus Evo Nanopump</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-EVO-PUMP</td><td>1 x bomba de jeringa; 1 x Software de ensayo VenaFlux; 1 x kit de tubos; fuente de alimentación y cables.</td></tr><tr><td>Colector de 8 canales MultiFlow8</td><td>Cellix Ltd</td><td>MIRUS-MULTIFLOW8</td><td></td></tr><tr><td>Caja humidificada</td><td>Cellix Ltd</td><td>HUMID-BOX</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen de fluorescencia Leica AF6000</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara con dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100</td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad biológica/campana de flujo laminar</td><td>Cleanair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hitachi</td><td>himac-CT6EL</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de mano (P-10 (10 mL), P-200 (200 y micro; L), P-1000 (1.000 y micro; L)</td> <td>Gilson internacional</td><td>4807 (10&micro; l), 4810 (200&micro; l), 4809 (1000 y micro; l)</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de plástico estéril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180 (5 ml), 607180 (10 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR/ Duran Group</td><td>391-0860</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo (75 cm2</td><td>)CELLSTAR</td><td>658,170</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga (15 mL)</td><td>CELLSTAR</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina, tipo A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina (plasma bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>Endotelial Humano-SFM</td><td>Life Tecnologías</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>VEGF humano 165 IS, grado premium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-386</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2 humano, grado premium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-842</td><td></td></tr><tr><td>Suero derivado del plasma pobre en plaquetas, bovino</td><td>Tecnologías biomédicas</td><td>BT-214</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha humano recombinante;</td><td>Tebu-bio</td><td>300-01A-A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Life Technologies</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6(3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium Life Technologies</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (50 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (5.000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>Life Technologies</td><td>15230-089</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Merck</td><td>1.00983.2500</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1</td><td>R& Sistemas D</td><td>FAB5649P</td><td></td></tr><tr><td>E-Selectin</td><td>R& Sistemas D</td><td>BBA21</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D systems</td><td>BBA20</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Versión de software</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Cellrofiler</td><td>CellProfiler</td><td>2.1.1</td><td></td></tr><tr><td>VenaFluxAssay Software</td><td>Cellix Ltd</td><td>2.3.a</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de pluripotent inducidas humanas (hipsc-ecs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Las células endoteliales (ECs) son esenciales para la regulación de las respuestas inflamatorias por limitar o facilitar el reclutamiento de leucocitos en tejidos afectados por una cascada bien caracterizado de receptores Pro-adhesivos que alza en el superficie de la célula del leucocito a la activación inflamatoria. Las respuestas inflamatorias difieren entre individuos de la población y el fondo genético puede contribuir a estas diferencias. Las células madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSCs) han demostrado ser una fuente confiable de ECs (hiPSC-ECs), lo que representa una fuente ilimitada de células que captan la identidad genética y cualquier variantes genéticas o mutaciones del donante. hiPSC ECs por lo tanto pueden utilizarse para el modelado de las respuestas inflamatorias en células de donantes específicos. Las respuestas inflamatorias se pueden modelar mediante la determinación de adherencia del leucocito a las ECs hiPSC bajo flujo fisiológico. Este protocolo paso a paso proporciona una descripción detallada de la disposición experimental y análisis de datos para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs y el análisis de la adherencia del leucocito bajo flujo fisiológico.

En primer lugar, la respuesta de ECs hiPSC a la estimulación con agente proinflamatoria TNFα debe ser examinado, como se ha descrito7. Tratamiento de TNFα por 12 h activa la regulación al alza de E-selectina con el pico a las 6 h después de comenzar el tratamiento. Además, ICAM-1 es upregulated 6-12 h tras el tratamiento. Aunque no observamos la regulación al alza esperada de VCAM-1, se observa típicamente en las células endoteliales de vena umbilical humana primaria (HUVECs). Se encontraron durante la noche (12 h) TNFα del tratamiento más conveniente para el ensayo de adherencia del leucocito.
Disociación de óptima hiPSC-ECs debe resultar en una suspensión unicelular de grupos celulares. Figura 2 ilustra la densidad óptima hiPSC-CE justo después de la inyección. Normalmente, 15 minutos después de la inyección, hiPSC-ECs fije a la parte inferior del canal y empiezan a difundir (Figura 2D). 1 h después de la inyección, ECs hiPSC forman una monocapa difundida por el canal y estará listos para comenzar el análisis del flujo (Figura 2E).
Etiquetado de leucocitos con trazador fluorescente es beneficioso para fase automatizada de imágenes de contraste en cuantificación de imagen, ya que facilita el paso de identificación de la célula, sobre todo porque los leucocitos se adhieren a la monocapa de ECs y a menudo es difícil software distinguir diferentes tipos de células.
Gratis imagen de la abrir-fuente software de procesamiento es muy útil para la cuantificación automatizada de los leucocitos adherentes. La tubería que se describe en el protocolo aquí se basa en la identificación de objeto primario mediante umbralización adaptativa de imágenes fluorescentes de leucocitos (Figura 4A). Filtrado de identifica objetos basados en un área mínima además filtra objetos falsamente identificados como restos celulares, autofluorescencia o cualquier otro no específica señal fluorescente (figura 4 C, D).
Un chip de microfluidos con ocho canales paralelos permite la comparación de dos grupos independientes, por ejemplo, ECs distinguen de hiPSCs independientes, tales como donantes sanos o pacientes con trastornos genéticos. Controles adicionales, como ECs sin tratamiento o tratamiento previo con un anticuerpo bloqueo de ICAM-1 pueden ser incluidos como bien10,11. Dos a tres virutas de microfluidos pueden procesarse a la vez. Para la robustez de las conclusiones, se recomienda un mínimo de tres experimentos biológicos independientes realizados en días independientes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig1.jpg"> Figura 1 : Preparación de hiPSC-ECs y leucocitos para el análisis del flujo. (A) pretratamiento de hiPSC-ECs con el estímulo proinflamatorias (TNFα). (B) representación esquemática de la disociación enzimática hiPSC-ECs, centrifugación y resuspensión. (C) representación esquemática de la capa de los canales (C, izquierda), la inyección de la suspensión hiPSC-CE (C media) y de la célula además de medio de cultivo después de accesorio hiPSC ECs en el chip de microfluidos. (D) representación esquemática del paso del leucocito lavado, etiquetado con colorante fluorescente DiOC6 y resuspensión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig2.jpg"> Figura 2 : Chip de microfluidos con hiPSC ECs. Chip de microfluidos (A) en una placa de Petri de 10 cm. (B) la cámara humidificado utilizada para la incubación. (C, D, E) Imágenes representativas de hiPSC-ECs en la microfluídica canalizan 0 min (C), 15 min (D), (E) de 1 h después de la inyección. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig3.jpg"> Figura 3 : Montaje experimental del celular directo imágenes y leucocito perfusión ensayo. (A, B) Representación de la foto (A) y esquema (B) de la disposición experimental del ensayo celular directo imágenes y flujo: bomba de microfluídica de la - microscopio fluorescente invertido con montado directo de cámara (5% CO2, 37 ° C, humidificado), (2) - (1), (3) - Canal 8 múltiple, (4) - PC para microscopio de imagen y control adquisición, (5) - PC para el control de la bomba de microfluidos. Chip de microfluidos (C) con el tubo insertado del múltiple de 8-canal fijado en un sostenedor de la placa y en la etapa motorizada del microscopio. (D) representación esquemática de los principales pasos del análisis de flujo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58678/58678fig4.jpg"> Figura 4 : Análisis y detección automatizada de los leucocitos adherentes de la imagen. (A) la ventana de diálogo de la imagen de proceso de software con la configuración especificada para la identificación de leucocitos. (B) la ventana de diálogo del software de procesamiento de imagen con filtrado especificado criterios de los objetos identificados en base mínimamente aceptaron superficie (SAmin = 70 px). (C) ejemplo de la correcta identificación de los leucocitos y el filtrado de objetos inespecíficos de la pequeña área superficial (SA) (diámetro típico en píxel (Min, Max) = (9, 15); Filtrado de criterios SAmin = 70 px). Aceptados los objetos están representados en verde y objetos descartados son representados en violeta. (D) ejemplo de incorrecta identificación de los leucocitos debido a la gama incorrecta del diámetro típico (diámetro típico en píxel (Min, Max) = (3, 15); Filtrado de criterios SAmin = 70 px). Aceptados los objetos están representados en verde y objetos descartados son representados en violeta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58678/58678fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo paso a paso proporciona una descripción detallada de la disposición experimental y análisis de datos para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs y el análisis de la adherencia del leucocito bajo flujo fisiológico.

Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de células madre pluripotentes humanas sobre la funcionalidad y las respuestas inflamatorias de las células endoteliales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una descripción detallada de la configuración experimental y el análisis de datos para la evaluación de la adhesión de leucocitos a las células endoteliales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre. Para el recubrimiento de viruta microfluídica, coloque un biochip estéril en un plato petri estéril de 10 centímetros y utilice una punta de pipeta de 10 microlitros para inyectar 10 microlitros de solución de trabajo de fibronectina recién preparada en cada canal del biochip.Cubra el plato de Petri y colóquelo en una cámara humidificada durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, precalentar el biochip en una incubadora de 37 grados Celsius, y re-suspender células endoteliales inducidas por humanos derivadas de células madre recolectados de un cultivo celular de 80 a 100% confluente a la concentración deseada en un medio fresco libre de lípije de células endoteliales. A continuación, aspirar la solución de fibronectina de todos los canales del chip microfluídico, y mezclar a fondo las células para obtener una suspensión celular homogénea antes de utilizar una punta de pipeta de 10 microlitros para inyectar seis microlitros de células en cada canal.Examine el biochip bajo el microscopio para confirmar que las células se distribuyen uniformemente con una alta densidad celular. Después de 15 minutos a 37 grados Celsius, agregue 40 microlitros de medio medio libre de suero de células endoteliales FULL en los depósitos medios a ambos lados de cada canal. Y devuelve el biochip a la incubadora durante una hora.Luego, agregue otros 50 microlitros de medio libre de suero de células endoteliales FULL en los reservorios a ambos lados de cada canal. Para obtener imágenes en vivo de las células sembradas, confirme que las configuraciones microfluídicas están listas, que la cámara de imágenes en vivo está equilibrada a 37 grados centígrados y que el nivel de CO2 ha alcanzado el 5% Coloque el biochip en el soporte del chip del microscopio y monte el soporte del chip en la etapa de imagen del microscopio. Para conectar el biochip a la bomba a través del colector, coloque el adaptador de ocho pines cerca de los depósitos de salida del chip y profundice todos los pines en el medio sin conectar los pines por completo.En el software de bomba microfluídica, seleccione Washout/Connect to chip y haga clic en Ejecutar paso de ensayo para dispensar 30 microlitros de medio RPMI a través de cada pin. A continuación, inserte el adaptador de ocho pines en la salida del biochip. Utilice una pipeta para aspirar manualmente el medio de todos los depósitos de entrada del biochip, y seleccione Washout/Chip Washout and Run Assay Step para perfundir un canal a la vez con 40 microlitros de medio libre de suero de células endoteliales Full para eliminar las células muertas y los desechos.Una vez lavados todos los canales, sustituya el medio del depósito de entrada del canal de interés por 100 microlitros de leucocitos humanos diluidos a 2,5 veces 10 a las seis células por mililitro de concentración en EL medio RPMI. Haga clic en Descripción de ensayo/paso de celda y establezca la descripción del canal/paso actual y establezca el canal de interés en Activado y los otros siete canales en Desactivado.Sustituya los leucocitos restantes en el depósito de entrada por 100 microlitros de medio RPMI completo. Y haga clic en Descripción del paso de ensayo de celda y Ejecutar paso de ensayo para perfundir el canal durante cinco minutos con el medio RPMI para eliminar cualquier leucocitos no adherente. A continuación, adquiera imágenes de al menos tres a cuatro posiciones diferentes en el canal para visualizar los leucocitos adheridos.Para cuantificar los leucocitos adherentes, abra el software de procesamiento de imágenes CellProfiler e importe el archivo Count Leukocytes Pipeline. En Módulos de entrada, seleccione Imágenes y arrastre y suelte la carpeta con las imágenes sin procesar de los leucocitos adherentes a la ventana de lista Archivo. En Módulos de análisis, seleccione Identificar objetos primarios e indique los diámetros mínimos y máximos de los leucocitos adherentes en píxeles.En Módulos de análisis, seleccione FilterObjects. A continuación, seleccione los criterios de filtrado e introduzca el área mínimamente aceptada de los objetos en píxeles y haga clic en Analizar imágenes para comenzar el análisis. La disociación óptima de células endoteliales derivadas de células madre inducidas por el hombre debe dar lugar a una suspensión de una sola célula libre de grumos celulares.Típicamente, 15 minutos después de la inyección las células endoteliales se unen a la parte inferior del canal y comienzan a extenderse. Dentro de una hora después de la inyección, las células endoteliales deben formar una monocapa bien distribuida a través del canal, momento en el que están listas para su uso en el ensayo Flow. El uso del software gratuito de procesamiento de imágenes de código abierto como se ha demostrado permite filtrar los objetos identificados en función de un área mínima y la exclusión de objetos identificados falsamente, como desechos celulares, autofluorescencia o cualquier otra señal fluorescente no específica.Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar la estimulación con citoquinas proinflamatorias e incluir las células endoteliales de venas umbilicales humanas primarias como un control positivo. No olvide que trabajar con líneas celulares y celulares de mamíferos primarios puede ser extremadamente peligroso y que las precauciones como el uso de abrigo de laboratorio, guantes y protección ocular siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.

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Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs) (Video) | JoVE Journal

Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs)

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