En Vivo Específica la expresión de proteínas de Optogenetic usando películas de seda/AAV

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia de sistemas. Tal como cómo la actividad de los conjuntos neuronales apoya el procesamiento sensorial y cognitivo en el cerebro. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la focalización precisa de proteínas optogenéticas como Chan rhodopsin y GCaMP a las regiones cerebrales de interés, sin necesidad de un procedimiento de inyección de virus separado.

La demostración visual de este método es crítica, ya que la deposición de seda y virus a pequeños implantes ópticos puede tomar alguna práctica para lograr resultados reproducibles. En primer lugar, mezcle el AAV descongelado y el fibrono de seda acuoso de cinco a siete puntos en una proporción de uno a uno en un tubo de PCR de 200 microlitros. Pipetear suavemente la solución varias veces para mezclar a fondo el AAV y la fibroína.

Para depositar la seda/AAV, cargue una pipeta de inyección con la cantidad de solución necesaria para el número de implantes de fibra que se están realizando, más aproximadamente un 30 por ciento adicional para acomodar las pérdidas debidas a la obstrucción de la pipeta. A continuación, monte un soporte de férula en un aparato estereotaxico equipado con un microinyector. Coloque el soporte de la férula por encima del microinyector y aplique la mezcla de seda/AAV desde abajo.

Maniobrar la pipeta de inyección hasta que esté tocando o casi tocando el centro de la superficie de fibra óptica, y expulse de 10 a 20 nanolitros de solución de seda/AAV. A continuación, retire la pipeta. A continuación, observe el bolo de seda/AAV en la superficie plana que aparece como una cúpula líquida que se seca a una película plana en aproximadamente un minuto.

Repita los pasos anteriores hasta que se deposite la cantidad deseada de seda/AAV. Al preparar varios implantes, aplique la solución de seda/AAV a un implante y luego pase a cubrir otros implantes, antes de volver al primero. Después de una hora de secado, coloque todo el soporte de la férula en una cámara de vacío y deseces al vacío durante la noche a aproximadamente 125 torr y cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, evalúe la forma y la posición de la película de seda resultante bajo un microscopio de alta potencia. Asegúrese de que las películas estén confinadas a la punta de la superficie de fibra óptica, relativamente delgadas y simétricas. Para el recubrimiento de fibras ópticas cónicas, coloque la pipeta de inyección de seda/AAV contra el lado de la fibra óptica al principio de la cónica, asegurándose de que la pipeta esté tocando la fibra óptica.

Expulse 20 nanolitros de seda/AAV para iniciar el proceso de recubrimiento, asegurando que la gota se adhiere a la fibra óptica y permanece en la interfaz de la fibra y la pipeta. Mecha suavemente la gota hacia el extremo de la punta de fibra a medida que la seda/ AAV se seca, y mantener la pipeta de inyección en contacto con la gota de secado para evitar obstruir la punta de la pipeta. Cuando el primer bolo se haya secado casi por completo, expulse otros 20 nanolitros y continúe absorbiendo la gota a lo largo de la cónica.

Repita el paso anterior expulsando pequeñas cantidades de seda/AAV y secando gradualmente la solución por el lado de la cónica. Después del secado, evalúe la forma y la posición de la película de seda resultante bajo un microscopio de alta potencia. Para recubrimiento de implantes de lentes GRIN, deposite seda/AAV en una sola inyección en un implante de lente GRIN.

Después del secado, evalúe la forma y la posición de la película de seda resultante bajo un microscopio de alta potencia para asegurarse de que la película cubre la superficie de la lente. Para el recubrimiento de ventanas craneales de vidrio, pipetee a mano una gota de cinco microlitros de seda/AAV sobre la superficie de un resbalón de cubierta redonda de tres milímetros para que la gota se esparza para cubrir toda la superficie de vidrio. Después del secado, almacene las fibras ópticas recubiertas de seda/AAV en un desecador de vacío enfriado a 125 torr y cuatro grados Celsius antes de implantar los dispositivos.

Las imágenes de fluorescencia de proteínas optogenéticas etiquetadas con fluoróforo proporcionaron una medida del grado de expresión de las películas de seda/AAV, y las fibras ópticas típicas pueden acomodar fácilmente 200 nanolitros de seda/AAV. Con la práctica, los experimentadores pueden lograr una expresión altamente confiable alrededor de la punta de las fibras implantadas. Dos posibles problemas con las ventanas craneales recubiertas son la expresión insuficiente, y las películas de seda que no se disuelven y oscurecen el campo de visión.

Para aumentar la expresión, se puede realizar una durectomía antes de implantar la ventana y/o aumentar la cantidad de virus en la película. La mejor expresión se logró utilizando una mezcla de uno a cuatro mezclas de seda y AAV de stock-titer, respectivamente. La cantidad de seda en ventanas recubiertas es de 10 a 100 veces más que en los implantes de fibra, y la película está menos incrustada en el tejido, y por lo tanto no puede estar expuesta a los mismos niveles de actividad proteolítica que pueden disolver las películas de seda.

Sin embargo, la presencia de algo de seda es esencial para lograr su expresión debajo de las ventanas, probablemente porque una película hecha de virus por sí sola es arrastrada por líquido intersticial durante la cirugía. Al intentar este procedimiento, es importante preparar y almacenar implantes recubiertos de seda de la manera que describimos. El almacenamiento incorrecto puede cambiar las propiedades de las películas de seda o disminuir la eficacia de los vectores de expresión viral.

Esta técnica puede ser de gran utilidad para los investigadores en el campo de la neurociencia de sistemas para explorar cómo la actividad neuronal impulsa el procesamiento sensorial y cognitivo en los cerebros de mamíferos como ratones, ratas, o incluso primates no humanos. No olvide que trabajar con vectores de expresión viral puede ser peligroso y el equipo de protección personal, como guantes, gafas y abrigos de laboratorio, siempre debe usarse mientras se trabaja con el virus asociado a Adeno.