Name: Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprende a preparar rebanadas de tronco encefálico de roedores neonatales para registrar la red respiratoria medular mediante electrofisiología. Este método captura el complejo pre-Botzinger con reproducibilidad.

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S.B.C. es un receptor de una beca de investigación en pregrado Loma Linda Universidad de verano.

<ol><li>Hilaire, G., Duron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+the+Mammalian+Respiratory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Maturation of the Mammalian Respiratory System.</a> Physiological Reviews. 79, 325-360 (1999).</li>
<li>Pinkerton, K. E., Joad, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mammalian+Respiratory+System+and+Critical+Windows+of+Exposure+for+Children%27s+Health%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">The Mammalian Respiratory System and Critical Windows of Exposure for Children's Health.</a> Environmental Health Perspectives. 108, 6(2000).</li>
<li>Smith, J. C., Ellenberger, H. H., Ballanyi, K., Richter, D. W., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B%C3%B6tzinger+complex%3A+a+brainstem+region+that+may+generate+respiratory+rhythm+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pre-Bötzinger complex: a brainstem region that may generate respiratory rhythm in mammals.</a> Science. 254, 726-729 (1991).</li>
<li>Smith, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+neonatal+and+adult+mammals%3A+the+hybrid+pacemaker-network+model%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration+Physiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in neonatal and adult mammals: the hybrid pacemaker-network model.</a> Respiration Physiology. 122, 131-147 (2000).</li>
<li>Ramirez, J. M., Schwarzacher, S. W., Pierrefiche, O., Olivera, B. M., Richter, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+lesioning+of+the+cat+pre-B%C3%B6tzinger+complex+in+vivo+eliminates+breathing+but+not+gasping%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Selective lesioning of the cat pre-Bötzinger complex in vivo eliminates breathing but not gasping.</a> The Journal of Physiology. 507, 895-907 (2004).</li>
<li>Butera, R. J., Rinzel, J., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+Respiratory+Rhythm+Generation+in+the+pre-B%C3%B6tzinger+Complex%3A+II.+Populations+of+Coupled+Pacemaker+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Models of Respiratory Rhythm Generation in the pre-Bötzinger Complex: II. Populations of Coupled Pacemaker Neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 82, 398-415 (1999).</li>
<li>Suzue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+rhythm+generation+in+the+in+vitro+brain+stem-spinal+cord+preparation+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Respiratory rhythm generation in the in vitro brain stem-spinal cord preparation of the neonatal rat.</a> Journal of Physiology (London). 354, 173-183 (1984).</li>
<li>Feldman, J. L., Del Negro, C. A., Gray, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+rhythm+of+breathing%3A+so+near%2C+yet+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the rhythm of breathing: so near, yet so far.</a> Annual Review of Physiology. 75, 423-452 (2013).</li>
<li>Rekling, J. C., Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Coupling+and+Excitatory+Synaptic+Transmission+between+Rhythmogenic+Respiratory+Neurons+in+the+PreB%C3%B6tzinger+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrical Coupling and Excitatory Synaptic Transmission between Rhythmogenic Respiratory Neurons in the PreBötzinger Complex.</a> Journal of Neuroscience. 20, 113(2000).</li>
<li>Rousseau, J. -P., Caravagna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+on+Isolated+Brainstem-spinal+Cord+Preparations+from+Newborn+Rodents+Allows+Neural+Respiratory+Network+Output+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology on Isolated Brainstem-spinal Cord Preparations from Newborn Rodents Allows Neural Respiratory Network Output Recording.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53071(2015).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).</li>
<li>Koizumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Imaging%2C+Spatial+Reconstruction%2C+and+Biophysical+Analysis+of+a+Respiratory+Motor+Circuit+Isolated+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional Imaging, Spatial Reconstruction, and Biophysical Analysis of a Respiratory Motor Circuit Isolated In Vitro.</a> Journal of Neuroscience. 28, 2353-2365 (2008).</li>
<li>Danneman, P., Mandrell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+agents%2Fmethods+for+anesthesia+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five agents/methods for anesthesia of neonatal rats.</a> Laboratory Animal Science. 47, 386-395 (1997).</li>
<li>Umezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin-B+antagonized+respiratory+depression+induced+by+sevoflurane%2C+propofol%2C+and+remifentanil+in+isolated+brainstem-spinal+cords+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Physiology+%26+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Orexin-B antagonized respiratory depression induced by sevoflurane, propofol, and remifentanil in isolated brainstem-spinal cords of neonatal rats.</a> Respiratory Physiology & Neurobiology. 205, 61-65 (2015).</li>
<li>Bierman, A. M., Tankersley, C. G., Wilson, C. G., Chavez-Valdez, R., Gauda, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+hyperoxic+exposure+reconfigures+the+central+respiratory+network+contributing+to+intolerance+to+anoxia+in+newborn+rat+pups%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perinatal hyperoxic exposure reconfigures the central respiratory network contributing to intolerance to anoxia in newborn rat pups.</a> Journal of Applied Physiology. 116, 47-53 (2014).</li>
<li>Formenti, A., Zocchi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error+signals+as+powerful+stimuli+for+the+operant+conditioning-like+process+of+the+fictive+respiratory+output+in+a+brainstem-spinal+cord+preparation+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Error signals as powerful stimuli for the operant conditioning-like process of the fictive respiratory output in a brainstem-spinal cord preparation from rats.</a> Behavioural Brain Research. 272, 8-15 (2014).</li>
<li>Negro, C. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+and+Calcium+Current-Mediated+Pacemaker+Neurons+and+Respiratory+Rhythm+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sodium and Calcium Current-Mediated Pacemaker Neurons and Respiratory Rhythm Generation.</a> Journal of Neuroscience. 25, 446-453 (2005).</li>
<li>Johnson, S. M., Koshiya, N., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Kernel+for+Respiratory+Rhythm+Generation+in+a+Novel+Preparation%3A+The+Pre-B%C3%B6tzinger+Complex+%22Island%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Kernel for Respiratory Rhythm Generation in a Novel Preparation: The Pre-Bötzinger Complex "Island".</a> Journal of Neurophysiology. 85, 1772-1776 (2001).</li>
<li>Funk, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+respiratory+rhythm+generating+networks+in+neonatal+mice+lacking+NMDAR1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional respiratory rhythm generating networks in neonatal mice lacking NMDAR1 gene.</a> Journal of Neurophysiology. 78, 1414-1420 (1997).</li>
<li>Campos, M., Bravo, E., Eugenín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunctions+induced+by+prenatal+nicotine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunctions induced by prenatal nicotine exposure.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 36, 1205-1217 (2009).</li>
<li>Ballanyi, K., Volker, A., Richter, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia+induced+functional+inactivation+of+neonatal+respiratory+neurones+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Anoxia induced functional inactivation of neonatal respiratory neurones in vitro.</a> NeuroReport. 6, 165-168 (1994).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Sensitivity+to+Neuromodulator-Activated+Signaling+Pathways+at+Physiological+%5BK%2B%5D+of+Confocally+Imaged+Respiratory+Center+Neurons+in+On-Line-Calibrated+Newborn+Rat+Brainstem+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High Sensitivity to Neuromodulator-Activated Signaling Pathways at Physiological [K+] of Confocally Imaged Respiratory Center Neurons in On-Line-Calibrated Newborn Rat Brainstem Slices.</a> Journal of Neuroscience. 26, 11870-11880 (2006).</li>
<li>Rybak, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+ponto-medullary+respiratory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Physiology+%26+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Modeling the ponto-medullary respiratory network.</a> Respiratory Physiology & Neurobiology. 143, 307-319 (2004).</li>
<li>Ruangkittisakul, A., Kottick, A., Picardo, M. C. D., Ballanyi, K., Del Negro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+pre-B%C3%B6tzinger+complex+inspiratory+center+in+calibrated+%27sandwich%27+slices+from+newborn+mice+with+fluorescent+Dbx1+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of the pre-Bötzinger complex inspiratory center in calibrated 'sandwich' slices from newborn mice with fluorescent Dbx1 interneurons.</a> Physiological Reports. 2, (2014).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press, Inc. (1997).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press, Inc. (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Adaptando el protocolo presentado aquí en un en bloque o rebanada workflow es ventajosa para los laboratorios y estudios que le gustaría utilizar ya sea medular en bloque del tronco encefálico o delgada rebanada preparados para grabaciones de electrofisiología. El método de disección y corte presentado, combinado con métodos divulgados previamente por otros17,18,19, permitirá la preparación reproducible de tejido viable y robust...

La red neuronal respiratoria del médula oblonga proporciona un dominio fértil para entender las características generales de las redes neuronales rítmicas. En particular, el interés es en el desarrollo de roedores neonatales respirar y entender cómo se desarrolla el ritmo de la respiración. Esto puede ser hecho usando un acercamiento de niveles múltiples, incluidas en la pletismografía todo animal vivo, in vitro en bloque del nervio grabaciones e in vitro cortar grabaciones que contienen el generador de ritmo de respiración. Reduccionista en vitro en bloque y rebanar las grabaciones son un método ventajoso utilizar al interrogar los mecanismos detrás de rhythmogenesis respiratoria y los circuitos neuronales en la región de la médula espinal tronco encefálico de desarrollo de roedores. El sistema respiratorio en desarrollo incluye aproximadamente 40 tipos de células, caracterizados por el disparo de patrón, los del centro respiratorio1,2incluidos. La red respiratoria central incluye un grupo de rítmicamente activas neuronas localizadas en la médula ventrolateral rostral1,3. Mamíferos rhythmogenesis respiratorio se genera de un autorhythmic interneurona red apodado el complejo preBötzinger (pBC), que ha sido localizada experimentalmente mediante preparaciones de rebanada y en bloque de mamíferos neonatal tronco encefálico espinal cordones3,4,5,6,7,8. Esta región sirve una función similar a la del nódulo sinoauricular (SA) en el corazón y genera un sistema de tiempo inspiratorio para respiración de la unidad. De la pBC, el ritmo inspiratorio es llevado a otras regiones de la médula oblonga (incluyendo el núcleo hipogloso motor) y piscinas de motor espinal (por ejemplo, las neuronas motoras frénicas que impulsan el diafragma)9.
Actividad rítmica puede obtenerse utilizando preparaciones de médula oblonga médula espinal en bloque o rebanadas de una variedad de poblaciones celulares, incluyendo raicillas del nervio de C3-C5, raicillas de nervio XII, núcleo motor hipogloso (XII MN), neuronas premotor hipoglosos (XII pMN), y el pBC3,10,11,12. Mientras que estos métodos de recogida de datos han tenido éxito a través de un puñado de laboratorios, muchos de los protocolos no se presentan de una manera que es totalmente reproducible para nuevos investigadores entrar en el campo. Viable y rítmicamente activa en la obtención de preparaciones y rebanada requiere una aguda atención al detalle a través de todos los pasos de la disección y el protocolo de corte de rebanada. Protocolos anteriores ampliamente describir los diversos procedimientos de grabación y electrofisiología, sin embargo, carecen de detalle en la parte más crítica de la obtención de una preparación de tejido viable: realizar el procedimiento de disección y corte de médula espinal tronco encefálico.
Eficiente la obtención de una preparación de bloque o rebanada de rítmicamente activa y viable en grabaciones de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico requiere realizar todos los pasos correctamente, con cuidado y rápidamente (por lo general, todo el procedimiento relacionado aquí, puede ser realizado en aproximadamente 30 min). Puntos críticos del Protocolo de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico que no han sido previamente bien descritos incluyen la disección de las raicillas del nervio y el procedimiento de corte en el vibratome. Este protocolo es el primero que paso a paso comunicar visualmente la disección de la médula espinal tronco encefálico para nuevos investigadores y expertos en la materia. Este protocolo explica también muy bien las técnicas quirúrgicas, hitos y otros procedimientos para ayudar a futuros investigadores en estandarización de cortes y preparaciones en bloque para contener el circuito exacto deseado en cada experimento. Los procedimientos aquí presentados pueden usarse en cachorros neonatales de rata y ratón.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &bull; H2O</td><td>Sigma Aldrch</td><td>S9638-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>Aldrich C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7774-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz fría Lámpara halógena 150 W</td><td>AmScope</td><td>H2L50-AY</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td>M-60</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome 1000 Plus</td><td>Vibratome</td><td>W3 69-0353</td><td></td></tr><tr><td>Base Magnética</td><td>Kanetic</td><td>MB-B-DG6C</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Espada Clásica Hojas de Doble Filo</td><td>Wilkinson</td><td>97573</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2779</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas Finas</td><td>Herramientas de Ciencias Finas</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pinza</td><td>Herramientas de Ciencias Finas</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí # 10</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí Handel # 3</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte rectas&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de patrón estrecho dentada/recta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Tijeras de resorte de disección; Tijeras rectas</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 3" curvo</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td></td></tr><tr><td>Pasadores de insectos, 0</td><td>Fine Science Tools/8840604</td><td>26000-35&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos, 0, SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos, 00</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-30</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos, 00, SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos, 000</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos, 000, SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-25</td><td></td></tr><tr><td>Minutien alfileres, 0,10 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Pines de Minución, 0,15 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td></td></tr><tr><td>Pines de Minuciones, 0,2 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissue prep Parafin&nbsp;</td><td>fisher</td><td>T56-5</td><td></td></tr><tr><td>Grafito&nbsp;</td><td>Pescador&nbsp;</td><td>G67-500</td><td></td></tr><tr><td>Delrin Plástico&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>3HMT2</td><td></td></tr><tr><td>Aguja hipodérmica de calibre 18</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de rítmicamente activa en vitro neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mamífero ritmo inspiratorio se genera de una red neuronal en una región de la médula llamada la preBötzinger complejo (pBC), que produce una señal que conduce a la contracción rítmica de los músculos inspiratorios. Actividad neuronal rítmica generada en el pBC y llevado a otras piscinas neuronales a la musculatura de la respiración puede ser estudiada mediante varios enfoques, incluyendo en bloque del nervio grabaciones y grabaciones de corte transversal en coche. Sin embargo, métodos previamente publicados no han descrito el proceso de disección de la médula espinal tronco encefálico extensivamente de manera transparente y reproducible para futuros estudios. Aquí, presentamos una visión completa de un método reproducible Cortar rodajas rítmicamente activa del médula oblonga que contiene los circuitos neuronales necesarios y suficientes para generar y transmitir la impulsión inspiratoria. Este trabajo se basa en protocolos anteriores de electrofisiología de la médula espinal tronco encefálico para aumentar la probabilidad de obtener confiablemente sectores viables y rítmicamente activa para grabación salida neuronal de la pBC, neuronas premotor hipoglosos (XII pMN), y neuronas motoras hipoglosos (XII MN). El trabajo presentado se expande sobre los métodos publicados anteriores proporcionando ilustraciones detalladas, paso a paso de la disección, de crías de rata entera, cortar en vitro con las raicillas XII.

El método presentado aquí permite un investigador interesado en la obtención de rodajas rítmicamente activas del médula oblonga reproducible y fiable cortar un sector viable y robusto que permite la grabación de salida del motor fictive de muchas horas. Todos los elementos de circuito neuronal mínimamente necesario para generar y transmitir el ritmo inspiratorio pueden ser capturados en una rebanada fina usando este método. Estos elementos incluyen: preBötzinger complejo premotor neuronas...

Este protocolo tanto visualmente comunica la preparación de la médula espinal de la médula oblonga y aclara la preparación de cortes transversales del tronco encefálico de forma integral paso a paso. Fue diseñado para aumentar la reproductibilidad y mejorar la probabilidad de obtener rodajas viables, duraderas, rítmicamente activa para grabación salida neuronal de las regiones respiratorias del tronco encefálico.

Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Este método facilita la disección reproducible y el corte de troncos cerebrales de roedores para el análisis capturado de la Red Respiratoria Medular Mirian. Esta técnica ofrece una gran flexibilidad experimental, lo que permite preparar un desbloqueo in vitro o una preparación de la rebanada para la grabación. Este método se puede utilizar para experimentos de electrofisiología para explorar el circuito de control neural que genera ritmos respiratorios y para comprender la patología y la desregulación de la respiración en roedores modificados genéticamente.Después de la disección de la neuraxis, transfiera rápidamente el tronco aislado del animal a una cámara de disección aireada bajo un microscopio de disección y coloque el lado dorsal del tejido hacia arriba, con el extremo rostral mirando hacia la parte delantera de la cámara. Ancle el tejido en los hombros y el extremo más caudal de la médula espinal y hacer una incisión midsagittal a través del cráneo después de la sutura parietal para evitar dañar la corteza y el tronco encefálico subyacente al cráneo. Comenzando en la sutura sagital y trabajando lateralmente, cortar las suturas occipitales del cráneo para crear colgajos de hueso que pueden reflejarse y fijarse para anclar y estabilizar la parte rostral del cráneo.Después de reflejar ambos colgajos del cráneo, excúbica el resto de la corteza cerebral, dejando la porción caudal del cerebelo relativamente intacta para realizar una laminectomía dorsal. Utilice tijeras y fórceps de micro resorte para eliminar la musculatura que rodea el cráneo y la columna vertebral. Retire el tejido a lo largo del lado dorsal de la caja torácica, dejando las costillas intactas y cortando cuidadosamente los procesos laterales de la lámina vertebral.Después de cortar cualquier tejido que sobresoje los pons y la médula, el vermis, cerebelo, pons y el comienzo de la médula espinal, serán claramente visibles. Para realizar una laminectomía ventral, coloque el lado dorsal del tejido hacia abajo y el alfiler en la caja torácica y el extremo más caudal de la columna vertebral. Usa los colgajos del cráneo para fijar el lado rostral del tejido y extraer la mitad ventral de la caja torácica, incluyendo el esternón y todos los órganos abdominales.Diseccionar el tejido blando unido a la caja torácica para exponer las costillas y la médula espinal y eliminar la lengua, el esófago, la tráquea, la laringe y todo el otro tejido blando y la musculatura sobre la base del cráneo y la columna vertebral. Para identificar el palet duro, disecciona el tejido que sobresote esta placa rectangular de hueso en la base del cráneo, que incluye una sangría en forma de V. A continuación, corte a lo largo de la línea media de la paleta, levantando cuidadosamente el tejido hacia arriba y realizar un corte transversal para eliminarlo.Para comenzar una laminectomía ventral, extraiga la lámina, exponiendo la superficie ventral del tronco encefálico y la médula espinal desde la primera vértebra cervical hasta aproximadamente la vértebra torácica siete y corte de cinco a 10 milímetros a lo largo de ambos lados de la columna vertebral en la lámina. Cuando la médula espinal ha sido expuesta, corta las raíces aproximadamente de 20 a 25 milímetros bilateralmente, a lo largo de la columna vertebral a aproximadamente T7 y levanta cuidadosamente el borde rostral de C1, C2 y C3 con fórceps enganchados o doblados para permitir el corte por debajo del hueso para la extracción de las tres vértebras. Cuando la longitud deseada de la médula espinal se haya aislado de la columna vertebral, haga un corte transversal para extraer el tejido de la médula espinal.Después de eliminar la dura, coloque el tronco encefálico en el centro de la plataforma de parafina en el bloque de corte de plástico y utilice pasadores finos de insectos, recortados a no más de un centímetro de longitud para fijar el extremo caudal del tronco encefálico a través de la médula espinal distal. A continuación, alinee el bloque de corte cubierto de parafina con el tronco encefálica anclado en el soporte del bloque Vibratone, de modo que la hoja corte perpendicular a la cara rostral del tronco encefálica. A continuación, haga una rebanada inicial para eliminar de 200 a 300 micrómetros de tejido extraño desigual en el extremo rostral más del tejido, haciendo pequeños ajustes según sea necesario para asegurar la linealidad PARP y pequeños cortes para eliminar cualquier tejido desigual.Las raíces glossofaríngeas se harán visibles en el borde lateral del tronco cerebral, cortarán una rebanada de 300 a 500 micrómetros de tronco cerebral de estos marcadores neuroanatómicos rostrales para capturar el complejo pre-Botzinger y el circuito de transmisión asociado. Todos los pasos del procedimiento de corte son críticos para crear una rebanada reproducible y viable, con todos los circuitos neuronales necesarios en la orientación correcta para producir un ritmo robusto. Todos los elementos de circuito neural mínimamente necesarios para generar y transmitir ritmo inspiratorio se pueden capturar en una rebanada delgada utilizando este método.Incluyendo el complejo pre-Botzinger, neuronas pre-motor que se proyectan a las neuronas motoras hipoglossales y las raíces nerviosas hipoglossas. El complejo pre-Botzinger, el hipoglossal o 12o neumo nervioso craneal rootlets y las raíles nerviosas C4 se pueden utilizar para la grabación inspiratoria. El aspecto clave de este procedimiento es el cuidadoso aislamiento de las rootletas y la confirmación de que el tronco encefálica no está dañado antes de cortar la rebanada final.Después de este procedimiento, las grabaciones de electrofisiología se pueden realizar utilizando métodos de abrazadera de parche, grabaciones celulares adicionales o electrodos de succión para registrar la actividad eléctrica producida por la red. Los protocolos publicados anteriormente han proporcionado poco detalle paso a paso, lo que dificulta que los nuevos investigadores utilicen este método sin viajar a otro laboratorio y pasar tiempo con un investigador experimentado.

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Neurociencia

Cultura Cortar organotípicos de los cerebros de ratas E18

Este protocolo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el cerebro postnatal y de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Este es un protocolo para preparar y mantener una rebanada preparación neocortical en la cultura organotípicos con el propósito de realizar grabaciones eléctricas de las neuronas piramidales.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

Un método para generar cortes organotípicos del cerebro medio E12.5 embrionarias murinas se describe. Las culturas rebanada organotípicos se puede utilizar para observar el comportamiento de las neuronas dopaminérgicas o neuronas del cerebro medio ventral.

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

Este video muestra grabaciones electrofisiológicas de preparaciones aisladas de tronco encefálico y médula espinal de roedores recién nacidos. La preparación se coloca en una cámara de registro, y los estallidos inspiratorios del tronco encefálico se registran en condiciones de oxigenación y falta de oxígeno utilizando la raíz nerviosa del cuarto ventral en la médula espinal.

Registros electrofisiológicos de preparaciones de tronco encefálico y médula espinal de un roedor recién nacido

El impulso respiratorio central se encuentra en el tronco encefálico. La salida motora respiratoria espontánea de un tronco encefálico aislado se registra colocando un electrodo en la cuarta raíz ventral. Este enfoque experimental es valioso para las investigaciones farmacológicas o la evaluación de los desafíos respiratorios y las manipulaciones genéticas en el comportamiento motor rítmico.

Electrofisiología en aislados Preparativos Cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal Respiratorio

Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

Aquí, describimos los pasos esenciales para las grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las neuronas de la sustancia gelatinosa (SG) en el segmento de la médula espinal en vitro . Este método permite que las propiedades intrínsecas de la membrana, transmisión sináptica y caracterización morfológica de las neuronas de la SG a estudiar.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

La integración de diversas entradas sinápticas a las neuronas se mide mejor en una preparación que preserva todos los núcleos presinápticos para la sincronización natural y la plasticidad del circuito, pero las rebanadas cerebrales suelen cortar muchas conexiones. Desarrollamos una rebanada cerebral modificada para imitar la actividad del circuito in vivo mientras mantenemos la capacidad de experimentación in vitro.

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

Aquí presentamos un protocolo para obtener cortes auditivos no coronales del tronco encefálico del embrión de pollo para la investigación de propiedades tonotópicas y trayectorias de desarrollo dentro de un corte del tronco encefálico. Estos cortes incluyen secciones sagitales, horizontales y horizontales / transversales que abarcan regiones tonotópicas más grandes dentro de un plano de corte individual que las secciones coronales tradicionales.

Cortar el tronco cerebral auditivo embrionario del pollo para evaluar gradientes tonotópicos y microcircuitos

Aprende a preparar rebanadas de tronco encefálico de roedores neonatales para registrar la red respiratoria medular mediante electrofisiología. Este método captura el complejo pre-Botzinger con reproducibilidad.

Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

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