Name: Nass-Spinnen-basierte Spritzgießprozess Gelatine für die Geweberegeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Nass-Spinn-Technik zur Herstellung gelatinbasierter Biomaterialien für die Geweberegeneration. Diese kostengünstige Methode ohne synthetische Polymere eignet sich für Nervenbehandlung und Blutgefäßersatz.

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Diese Studie wurde unterstützt durch das Ministerium der Nationalverteidigung (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065), das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (die meisten 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, die National Defense Medical Center, Taiwan (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041), Cheng-Hsin General Hospital und National Defense Medical Center Zusammenarbeit (CH-NDMC-107-8).

Das Fettgewebe stammen aus orthopädischen Operationen, wie von der institutionellen Review Board der Tri-Service General Hospital zertifiziert, Taipei, Taiwan, r.o.c. Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen von Animal Care Committee auf nationaler genehmigt worden Defense Medical Center, Taiwan (R.O.C).
1. nass Spinnerei Prozess
<ol><li>
Vorbereitung der Lösung
	<ol>
<li>Lösen Sie 5 g Gelatine-Pulver in 100 mL bidestilliertem Wasser, Konzentration von 5 % (w/V) Lösung zu erhalten.</li>
		<li>Rühren Sie die Mischung langsam bei 60-70 ° C über Nacht eine völlig homogene Dispersion blasenfrei zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nass Spinnerei
	<ol>
<li>Faser-Bildung Hinweis: Abbildung 1Azeigt eine schematische Darstellung der Methode. Das Spinnen-Setup ist ausgestattet mit einer peristaltischen Pumpe Maschine (siehe Tabelle der Materialien), die bietet Hochpräzisions Geschwindigkeit und steuert die reibungslose Lieferung des Stroms.<ol>
<li>Klares Vinyl Schlauch stecken Sie 26 X 1/2 Zoll (0,45 x 12 mm) Spritze als Lösung Injektor.</li>
			<li>Bereiten Sie 100 mL 99,5 % Aceton-Lösung in ein Becherglas Glas als Koagulation Bad verwendet werden.</li>
			<li>Laufen Sie die peristaltischen Pumpe Maschine, bei 21 u/min (3,25 mL/min) und lassen Sie die Gelatinelösung stehen für mehrere Sekunden in Aceton-Lösung vor dem einrollen.</li>
			<li>Nehmen Sie die Gelatine-Fasern aus der Aceton-Lösung und Tauchen sie in 2,5 % (w/V) Polycaprolactons/Dichlormethan (PCL/DCM) Lösung mit 01:20 (w/w).</li>
			<li>Lassen Sie die Gelatine, die Fasern in der PCL/DCM Lösung trocken unter der Haube bei Raumtemperatur über Nacht.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rohr-Bildung Hinweis: Abbildung 1Bzeigt eine schematische Darstellung der Methode.<ol>
<li>Verwenden Sie einen peripheren Venenkatheter 24 X 3/4 Zoll (0,7 x 19 mm) als Rohr Schimmel.</li>
			<li>Laden Sie den Katheter in die Gelatine-Lösung und halten Sie ihn dort für 3 s.</li>
			<li>Laden Sie den Katheter in die Aceton-Lösung und 1 min warten.</li>
			<li>Laden Sie den Katheter wieder in die Gelatine-Lösung und halten Sie ihn dort für 3 s.</li>
			<li>Wiederholen Sie dieses alternative Verfahren 20 X.</li>
			<li>Nehmen Sie den Katheter aus der Aceton-Lösung und lassen Sie das geformte Rohr bei 5 min bei Raumtemperatur trocknen.</li>
			<li>Herausnehmen Sie sanft die Gelatine-Röhre aus der Katheter mit einer Gefäßklemme und übertragen Sie sorgfältig die Gelatine-Schlauch in ein Glas Pasteurpipette mit das Eintauchen von 2,5 % (w/V) PCL/DCM-Lösung.</li>
			<li>Lassen Sie die Pasteur Pipette enthält, die die Gelatine Rohr- und PCL/DCM-Lösung trocken unter der Haube bei Raumtemperatur Übernachtung.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Morphologie der Gelatine-Röhre
<ol><li>Montieren Sie das Stück getrocknete Gelatine Schlauch an eine Kohlenstoff-Stub.</li>
	<li>Legen Sie die Probe in die Ionen-Sputter Coater Maschine (siehe Tabelle der Materialien) und Mantel die Probe mit Gold für 60 s; dann beobachten seiner Morphologie von Rasterelektronenmikroskopie (siehe Tabelle der Materialien).</li>
</ol>3. Kultur von menschlichen Fettgewebe Stammzellen
<ol><li>Platzieren Sie das Fettgewebe (gewonnen aus mündlichen Fettgewebe durch klinische Chirurgie) in eine Petrischale mit 10 mL Transferlösung bestehend aus 0,1 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1 % Penicillin/Streptomycin und 0,1 % Glukose.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gewebe in kleine Stücke (weniger als 1 mm2) mit einer Skalpellklinge.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gewebe in eine 15 mL Kunststoffrohr und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min.</li>
	<li>Den Überstand zu entfernen und das Sediment in ein Kunststoffrohr mit 10 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM, bestehend aus 4 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat und 15 mg/L Phenol rot) mit 0,1 % Kollagenase bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre inkubieren 95 % Luft und 5 % CO2, enthält für 1 Tag.</li>
	<li>Das Kunststoffrohr 500 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand sorgfältig entsorgen (das Sediment nicht berühren), und dann das Sediment sanft durch Zugabe von 10 mL DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) auszusetzen und 1 Tag bei 37 ° C stehen lassen , in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2.</li>
	<li>Das Kunststoffrohr 500 X g für 5 min Zentrifugieren und den Überstand vorsichtig zu verwerfen; Fügen Sie 1 mL der Stammzell-Medium (bestehend aus Keratinozyten serumfreien Medium (K-SFM), 5 % der FBS, N-Acetyl-L-Cystein, Ascorbinsäure-2-Phosphat, Streptomycin und Amphotericin) auszusetzen, das Sediment, übertragen Sie sie in ein T25-Kultur-Fläschchen mit 4 mL Zelle Medium stammen, und 3 Tage bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2stehen lassen.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) und inkubieren Sie es bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2 für 3,5 min, um die Zellen von der Unterseite des Kolbens Kultur zu lösen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der FBS, auszusetzen Sie, die Mischung und auf einem Microcentrifuge Schlauch übertragen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Federung bei 500 X g für 3,5 min, auszusetzen Sie das Sediment mit 1 mL der Stammzell-Medium und in der Kultur-Flasche mit 5 mL Medium Stammzellen übertragen; dann halten Sie es bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2.</li>
	<li>Pflegen Sie die Subkultur durch Ändern der Stammzell-Medium alle 3 Tage.</li>
</ol>(4) die Kultivierung von Zellen mit der Gelatine-U-Bahn
<ol><li>Sterilisieren Sie die Gelatine-Röhre mit UV-Licht für 2 h; dann tauchen sie in 75 % (V/V) Ethanol und waschen Sie es 2 X mit Stammzell-Medium, das restliche Ethanol zu entfernen.</li>
	<li>
Sammeln Sie die menschlichen Fettgewebe Stammzellen (hASCs) aus der Kultur-Flasche.
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Medium aus der Kultur-Flasche.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2 3,5 min, hASCs von der Unterseite des Kolbens Kultur zu lösen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL der FBS, auszusetzen Sie, die Mischung und auf einem Microcentrifuge Schlauch übertragen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Microcentrifuge Schlauch 500 X g für 3,5 min; dann verwerfen des Überstands vorsichtig, und unterbrechen das Sediment mit 1 mL der Stammzell-Medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Gelatine-Röhre in eine 6-Well-Platte mit 3 mL Stammzell-Medium und Samen Sie 4 x 104 der hASCs am Rohr; inkubieren sie für 2 Wochen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % CO2.</li>
	<li>Ändern der Stammzell-Medium alle 3 Tage um genug Nahrung für das Zellwachstum zu bieten.</li>
</ol>(5) Immunocytochemistry
<ol><li>Die Stammzell-Medium zu entfernen und den Brunnen mit PBS waschen.</li>
	<li>Befestigen Sie den Schlauch mit Zellen mit 0,1 % Essigsäure glacial für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Die gut 2 X waschen mit PBS.</li>
	<li>Fügen Sie ein Tensid (NP-40, 0,05 %) und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie der gut 3 X mit PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 2 % normalem Ziegenserum und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.</li>
	<li>Dekantieren Sie die Lösung zu, fügen Sie Primärantikörper nestin (neurale Vorläuferzellen Zellmarkierung hinzu) und über Nacht bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie der gut 3 X mit PBS.</li>
	<li>Fügen Sie Sekundärantikörper Esel anti-mouse-Fluorescein erfolgt (FITC) und halten Sie die Probe in der Dunkelheit für 2 h.</li>
	<li>Waschen Sie der gut 3 X mit PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der Hoechst 33342 zu färben die Kerne und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie den Brunnen sanft und unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten.</li>
</ol>(6) in Vivo Biokompatibilität Test
Hinweis: Ratten mit einem Gewicht zwischen 201-225 g wurden unter Verwendung dieses Protokolls erfolgreich getestet.
<ol><li>
Anästhesie
	<ol>
<li>Induzieren und Anästhesie zu erhalten; vorzugsweise ein Ratte (8 Wochen alten Sprague-Dawley Ratten, weiblich) durch eine intramuskuläre Injektion von Tiletamin und Zolazepam zu betäuben (25 mg / kg + 25 mg / kg, beziehungsweise) und Xylazin (5 mg/kg). Führen Sie einen Schmerz Stimulation Test durch Drücken der Ratte in den Fingern, die Anesthetization zu bestätigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sterilisation von der Operationsstelle
	<ol>
<li>Rasieren Sie und reinigen Sie die Haut der Ratte in den Trapezius Bereich (über der Rückseite des Halses) und wischen Sie es mit Povidon-Jod-Lotion zur Vorbereitung des aseptischen Zustand der Haut (100 mg/mL).</li>
		<li>Decken Sie die Ratte mit sterilen OP-Tüchern, bakterielle Übertragung und nachträgliche Kontamination an der Operationsstelle zu reduzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Implantation von Gelatine-Rohr
	<ol>
<li>Schneiden Sie vorsichtig die Haut der Ratte in den Trapezius Bereich mit einer chirurgischen Schere.</li>
		<li>Erstellen Sie eine Wunde von 2 cm und legen Sie die Gelatine-Röhre direkt auf die Schicht zwischen der Faszie und der Muskel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Postimplantation Chirurgie
	<ol>
<li>Schließen Sie die Wunde mit Nylon-Naht und wischen Sie es mit Povidon-Jod-Lösung (100 mg/mL).</li>
		<li>Induzieren Sie die Ratte über eine intramuskuläre Injektion von Ketoprofen (2,5 mg/kg) und Cefazolin (15 mg/kg).</li>
		<li>Halten Sie die Ratte unter aseptischen Bedingungen für 7 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Euthanasie
	<ol>
<li>Ratte ist über CO2 Erstickung nach AVMA Richtlinien für Euthanasie eingeschläfert. Bestätigen Sie den Tod der Ratte durch Zehe und Tail Prise, gefolgt von Brust zu berühren, um den Herzschlag zu gewährleisten.</li>
		<li>Schneiden Sie die Ratte sanft mit einer Skalpellklinge, entfernen des implantierten Gewebes und fotografieren für die Beobachtung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir präsentiert die Entwicklung von Gelatine-basierten Biomaterialien mit einem einfachen nassen Drehtechnik, die in der Studie von natürlichen Polymeren für die Geweberegeneration angewendet werden können. Diese Arbeit zeigte die Möglichkeit der Herstellung von Gelatine als eine gute Proteinquelle ohne Zusatz von anderen Quellen, mit dem Ziel, die Eigenschaften der Gelatine selbst optimieren. Die Entwicklung der Gelatine-basierten Biomaterialien wurde vollständig in Raumtemperatur (22-26 ° C) durchgeführt. Eine sanfte L...

Die neueste Entwicklung in der Geweberegeneration beinhaltet die Anwendung des Tissue Engineering, was eine Herausforderung für die Verbesserung der neue Therapiestrategien bei medizinischen Behandlungen darstellt. Zum Beispiel stellt das begrenzte Potential des Nervensystems Regenerierung, folgende Verletzungen oder Krankheiten, ein erhebliche gesundheitliche Problem weltweit. Aufgrund der Komplexität der pathophysiologischen Prozesse im Zusammenhang mit dem Nervensystem die Verwendung von traditionellen Spendertransplantat oder die Umsetzung der Stabilisierung Chirurgie hat gezeigt, dass Vorteile in funktionellen Ergebnisse bieten, aber es gibt keine Evidenz für die Auswirkungen von spinaler Fixierung Chirurgie1,2. Das Gewebe an den beschädigten Bereich verloren und ersetzt mit hypertrophisch induzierte Astrozyten3, schließlich bildet einen dichten glial Narbe4,5. Diese Matrix dient als eine Sperre, dass Blöcke die Erholung des Nervs Funktion6,7 und ist somit erheblich behindert Regeneration. Daher geeignete Füllmaterial Lücke wird voraussichtlich verhindern den Verlust von Gewebe und reduzieren die Bildung von Bindegewebe Narbe verbunden, durch die Aufrechterhaltung der Integrität der beschädigten Bereich sowie durch Bereitstellung den direkten Ersatz von neuronalen Zellen und Schaltung, Axon Regeneration zu fördern.
Polymere Biomaterialien wurden als Gerüste für Gewebe-Regeneration-Therapie, basierend auf der Verordnung der Zelle oder Axon Verhalten und Gewebe Progression durch natürliche extrazelluläre Matrix (ECM) Unterstützung bevorzugt. Das Faser-Format gilt allgemein als ein Baustein für verschiedene Materialien, aufgrund deren eindimensionale Struktur8. Die Fasern erhalten Sie in der Regel durch Schmelze Extrusion oder nass Spinnerei Methode; Allerdings sind die Größe und die Kosten für die Ausrüstung und die Schwierigkeit, diese Methoden ausführen herausfordernd. Darüber hinaus hat ein Großteil der Arbeit im Zusammenhang mit Polymerfasern auf synthetische oder zusammengesetzte Materialien konzentriert. Natürliche Polymere als Quelle von Biomaterial bieten bessere Biokompatibilität Eigenschaften für den menschlichen Körper. Um die Ausrichtung des natürlichen Polymerfasern zu erhalten ist jedoch relativ schwieriger als synthetische Polymer Quellen9. Daher ist die Umwandlung von ein natürliches Polymer als eine reiche Quelle von Protein in Biomaterial Fasern eine wichtige Strategie — nicht nur können der Biomaterial-Fasern werden direkt isoliert vom Rohstoff, wodurch eine unnötige Transformation zu Monomeren, aber die Protein-Fasern haben auch ein gutes Aussehen und positive Eigenschaften10.
In diesem Zusammenhang beschreiben wir eine kostengünstige Verarbeitungsmethode für die Herstellung von natürlichen Polymerfasern durch das Grundkonzept der nass Spinnerei, die im Labormaßstab für das Tissue Engineering umgesetzt werden können. Nass Spinnerei erfolgt durch die Extrusion und Koagulation von einer Polymerlösung in einem geeigneten Polymers Nonsolvent. Eine geeignete, zähflüssige Lösung dotierten in Koagulation Medium bewirkt, dass die Polymermoleküle aufzulösen. Durch den Phasenübergang die Filamente dann verlieren ihre Löslichkeit und in Form von einem festen Polymers Phase11ausgefällt werden. Unter Bezugnahme auf dieses Konzept, erweiterten wir dann die Entwicklung der Gelatine in die u-Form um einen Spritzgießprozess, das richtige für Gewebe-Regeneration-Anwendung gilt. Intrinsisch, darüber hinaus entwickeln wir auch jede Form von Material aus Gelatine Fasern (z. B. Gelatine Conduit aufgerollt aus mehreren Fasern, Gelatine), für andere Anwendungen gewünscht.
Gelatine, ein biologisch abbaubares natürliches Polymer aus denaturierten und hydrolysiertes Kollagen, einschließlich eines teilkristallinen, amorphen oder Dreibettzimmer spiralförmigen Bundesstaates Kollagen12gebildet wird. Es ist bekannt, dass Kollagen ist die wesentlichen Strukturprotein in alle Bindegewebe der Wirbeltiere und Wirbellose13,14, die ähnlich wie die Proteinstruktur des wichtigsten ECM ist das Nervenwachstum induziert und, gleichzeitig ersetzt eine große Menge an Glykosaminoglykan abgesondert während Verletzungen des Rückenmarks. Daher wäre die Verwendung von Gelatine als Quelle eine gute Wahl für alle Fahrzeuge, medizinische. Abgesehen davon, dass eine günstige Quelle, Gelatine ist auch biologisch abbaubar und Cytocompatible und klinisch geprüft zu werden, eine vorübergehende defekt Füller15. Entwickelte sich zu einer Röhre Form, zeigen hier beschriebenen in-vitro- und in-vivo-Tests, dass Gelatine hat eine ausgezeichnete Biokompatibilität und Eignung für zukünftige Tissue engineering-Anwendungen. Kultivierten mit menschlichen Fettgewebe Stammzellen verbessern Gelatine Röhren Zelldifferenzierung in neurale Vorläuferzellen mit positiven nestin Färbung als neuronale Zelle Marker. Darüber hinaus dürfte Gelatine als Füllmaterial Lücke, wie durch die in dieser Studie etablierte Methode produziert, überschaubar und sicher sein und Gewebe Ingenieure profitieren, die derzeit korrelative natürliche Polymeren zur Verbesserung der Gewebe entwickeln Regenerationsstrategien.

<table><tbody><tr><td><stark>Lösungsvorbereitung:</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatine Typ B (Schwein)</td><td>Ferak</td><td>Art. -Nr. 10733</td><td>500 g Fläschchen</td></tr><tr><td><stark>Nassspinnverfahren:</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Gilson</td><td>Modell M312</td><td>Minipuls*3</td></tr><tr><td>Schlauchverbinder aus Kunststoff</td><td>World Precision Instruments</td><td>14011</td><td>1 Packung</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>Sterican</td><td>5A06258541</td><td>26Gx1/2" (0,45 x 12mm)</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Ferak</td><td>Art. -Nr. 00010</td><td>2,5 L Fläschchen</td></tr><tr><td>Polycaprolacton CAPA 6500</td><td>Perstorp</td><td>24980-41-4-Dichlormethan</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scharlau</td><td>CL03421000</td><td>1 L Fläschchen</td></tr><tr><td>Glaspasteurpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A-Hämostat</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Shinetec Instrumente</td><td>ST-B021-Peripherer</td><td></td></tr> <tr><td>Venenkatheter (Introcan Certo)</td><td>B. Braun</td><td>1B03258241</td><td>24Gx3/4"(0,7 x 19mm)</td></tr><tr><td><stark>Morphologie des Gelatineröhrchens:</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionen-Sputter-Beschichtungsmaschine&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>e1010-Rasterelektronenmikroskopie</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Hitachi</td><td>S-3000N</td><td>-</td></tr><tr><td>Kultivierung von Zellen auf dem Gelatineröhrchen: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>488625</td><td>100 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>923119</td><td>500 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31600-034</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Keratinozyten-SFM-Medium</td><td>Gibco</td><td>10744-019</td><td>500 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>T25 Kulturflasche</td><td>TPP</td><td>90025</td><td>VENT Typ</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Falcon</td><td>1209938</td><td></td></tr><tr><td>-<stark>Immunzytochemie:</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosppat-gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>654471</td><td>500 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>Essigsäure Gletscher</td><td>Ferak</td><td>Art. -Nr. 00697</td><td>500 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>NP-40 Tensid (Tergitollösung)</td><td>Sigma</td><td>056K0151</td><td>500 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>20 mL Fläschchen, Konzentrat</td></tr><tr><td>Nestin (primärer Antikörper)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-23927-Donkey</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-Maus-Fluorescein Isothiocyanat ( Sekundärantikörper)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2099-Hoechst</td><td></td></tr> <tr><td>33342</td><td>Anaspec</td><td>AS-83218</td><td>5 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>In vivo Biokompatibilitätstest:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiletamine+zolazepam&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>BC91</td><td>5 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer Korea</td><td>KR03227</td><td>10 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Astar</td><td>1406232</td><td>2 mL Fläschchen</td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Lösung</td><td>Everstar</td><td>HA161202</td><td>4 L Fass</td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>China Chemical & Pharmazie</td><td>18P909</td><td>1 g Fläschchen</td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td>Shinetec Instrumente</td><td>ST-B021-Chirurgische</td><td></td></tr> <tr><td>Schere</td><td>Shinetec Instrumente</td><td>ST-B021</td><td>-</td></tr></tbody></table>

nass-spinnen-basierte spritzgießprozess gelatine für die geweberegeneration

Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration

Dieser Artikel stellt eine kostengünstige Methode, um Gelatine, als ein natürliches Polymer in monofilen Fasern oder andere geeignetsten Formen zu fabrizieren. Durch den nassen Methode Spinnen werden Gelatine-Fasern durch reibungslosen Extrusion in einem geeigneten Koagulation Medium produziert. Zur Erhöhung der funktionalen Oberfläche diese Gelatine-Fasern und ihre Fähigkeit, die Eigenschaften der Gewebe nachahmen kann Gelatine in eine u-Form geformt werden, mit dem Hinweis auf dieses Konzept. Von in-vitro- und in-vivo-Tests untersucht, zeigen die Gelatine-Röhren ein großes Potenzial für den Einsatz in Gewebetechnik. Handeln als geeignete Lücke Füllmaterial, Gelatine, die Rohre, das Gewebe in den beschädigten Bereich (z. B. in der nervös oder Herz-Kreislauf-System) zu ersetzen, sowie die Regeneration zu fördern, durch die Bereitstellung eines direkten Ersatz von Stammzellen und neuralen Schaltkreis verwendet werden können. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Anleitung zum Erstellen von Biomaterial basierend auf ein natürliches Polymer, und seine Umsetzung wird voraussichtlich die Entwicklung von korrelativen natürlichen Polymeren, profitieren die Gewebe Regenerationsstrategien realisieren helfen.

In dieser Studie haben wir erfolgreich die Gelatine in Fasern (Abb. 2A) und Rohre (Abbildung 2B, C) durch das benutzerfreundliche nass Spinnerei-Konzept entwickelt. Diese Gelatine-basierte Materialien können als jede medizinische Instrument, je nach ihrer Form genutzt werden. Wenn man bedenkt, dass die funktionale Oberfläche und Rahmen solcher Materialien besser geeignet für die Geweberegeneratio...

Wir entwickelten und beschreiben ein Protokoll basiert auf dem nass Spinnerei-Konzept für den Bau von Gelatine-basierten Biomaterialien für die Anwendung des Tissue Engineering verwendet.

Nass-Spinnen-basierte Spritzgießprozess Gelatine für die Geweberegeneration

This article presents an inexpensive method to fabricate gelatin, as a natural polymer, into monofilament fibers or other appropriate forms. Through the ...

Dieses Protokoll verbessert ein grundlegendes Konzept des Nassspinnens, um ein Material aus einem einzelnen Faserstreifen in verschiedene Streifen zu entwickeln, die für jede bevorzugte medizinische Anwendung verwendet werden können. Diese Technik ist einfach, kostengünstig und erfordert nicht die Zugabe von synthetischen Polymeren für die Anpassung der natürlichen Polymere in eine Ressource von Protein für Materialien von Interesse. Diese Technik kann auf die Entwicklung von Biomaterial zur Tötung von Kältetherapien wie Behandlung des zentralen oder peripheren Nervensystems, Blutgefäßersatz oder direkte Rekonstruktion der Harnwege ausgedehnt werden.Diese Methode ist für die medizinische Anwendung gedacht, auch als Strategie für Gewebeneuralisation oder regenerative Medizin. Diese Technik kann leicht von Anfängern implementiert werden. Beachten Sie, dass nach mehreren Formwiederholungen die Qualität der Lösung immer überprüft werden sollte, um eine optimale Formation zu erhalten.Um das Nassspinnrohr zu formen, tauchen Sie zunächst drei Sekunden lang einen 24-Meter-um-Dreiviertel-Zoll-Peripheriekatheter in frisch zubereitete Gelatinelösung ein, gefolgt von einem Eintauchen in frisch zubereitete Acetonlösung für eine Minute. Wiederholen Sie diese Schritte 20 Mal. Nach dem letzten Aceton-Eintauchen lassen Sie das geformte Rohr fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen und verwenden Sie ein Hämostat, um das Gelatinerohr vorsichtig aus dem Katheter in eine gläserne Pasteur-Pipette mit 2,5% Polycaprolacton-Dichlormethanlösung für eine nächtliche Inkubation unter der Haube bei Raumtemperatur zu übertragen.Am nächsten Morgen sterilisieren Sie die Gelatine für zwei Stunden unter ultraviolettem Licht, bevor Sie die Röhre kurz in 75% Ethanol eintauchen. Waschen Sie dann das Rohr zweimal mit Stammzellenmedium, um das Restethanol zu entfernen. Um die Gelatineröhrchen mit der Zellkultur zu kultivieren, ersetzen Sie das supinate Ende menschlicher Fettstammzellen aus einem Kulturkolben mit einem Milliliter 0,25%Trypsin-EDTA für eine 3,5-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Wenn sich die Zellen gelöst haben, halten Sie die Reaktion mit einem Milliliter fetalem Rinderserum fest und übertragen Sie die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenrohr. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Stammzellmedium wieder auf. Dann legen Sie das Gelatinerohr in einen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit drei Milliliter N-Dollar Stammzellmedium.Nach dem Zählen der Zellen, Samen viermal 10 bis der vierten menschlichen Fettstammzellen in die Röhre für eine zweiwöchige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Nach Bestätigung des entsprechenden Sedierungsniveaus durch mangelnde Reaktion auf Zehenkniff in einer acht Wochen alten sprague Dawley-Ratte, rasieren Sie die Haare aus dem Trapezbereich und sterilisieren Sie die exponierte Haut mit Povidon-Jod-Lösung. Bedecken Sie die Ratte mit sterilen chirurgischen Vorhängen, um die bakterielle Kontamination der chirurgischen Stelle zu reduzieren, und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen flachen, zwei Zentimeter langen Hautschnitt zu machen.Legen Sie das Gelatinerohr direkt in die Schicht zwischen der Faszien und dem Muskel und verwenden Sie eine Nylonnaht, um die Wunde zu schließen. Dann sterilisieren Sie den Schnitt mit Povidon-Jod-Lösung. Induzieren Sie die Ratte durch eine intramuskuläre Injektion von Ketoprofen und Cefazolin und halten Sie das Tier unter aseptischen Bedingungen für sieben Tage.Mit diesem benutzerfreundlichen Nassspinnkonzept können Gelatine zu Fasern und Rohren entwickelt werden. Morphologische Beobachtungen des Gelatinerohrs durch Rasterelektronenmikroskopie zeigen eine nicht sehr glatte Oberfläche mit einem Innendurchmesser von mehr als 200 Mikrometern und einer Dicke von etwa 20 Mikrometern. Die Färbung eines menschlichen Fettzellen-Stammzell-Gelatinerohrs für die expression ierung sneuraler Zellmarker zeigt eine positive Färbung für den Marker zusammen mit mehreren detektierten Kernen, was darauf hindeutet, dass die Zellen in das Gelatinerohr eindringen und haften und sich in neuronale Vorläuferzellen differenzieren können.Die Implantation des Gelatinerohrs in die Faszienschicht bestätigt seine Sicherheit und Biokompatibilität, da im lokalen Gewebe keine Anzeichen für Rötung, Schwellungoder oder andere Entzündungssymptome beobachtet werden und das Rohr von gut entwickeltem Bindegewebe umgeben ist. Beim Versuch dieses Verfahrens von zwei Punkt eins, die Sicherstellung des Eintauchens der Form in die spezifische Beschichtungszeit in jeder Lösung sind sehr wichtig, um eine genaue Rohrform aufzubauen. Nach diesem Verfahren können unsere Experimente mit tierexperimentellen Erkrankungen durchgeführt werden, um das Ergebnis der Biomaterialien für die Geweberegenerationsstrategie genau zu untersuchen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher bei der Entwicklung einfacher korrelativer Naturpolymere zu jeder Art von Material für eine entschiedene medizinische Anwendung. Unter normalen Gebrauchszustand, die Polycaprolactone Dichlormethan-Lösung wird als minimale Umweltgefahr darstellen, aber vergessen Sie nicht, irgendwelche Schritte mit dieser Chemikalie in einem geeigneten Biosicherheitsschrank durchzuführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Elektrogesponnene Gerüste können Post-Production für das Tissue Engineering-Anwendungen verarbeitet werden. Hier beschreiben wir Methoden für die Spinnerei komplexe Gerüste (durch aufeinander folgende Spinning), für die Herstellung dicker Gerüste (durch Multi-Schichtung mit Hitze und Dunst Glühen), für das Erreichen Sterilität (aseptische Produktion oder Postproduktion Sterilisation) und für die Erreichung entsprechenden biomechanischen Eigenschaften.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Ein bioprinter wurde verwendet, um strukturierte Hydrogele auf einem Opfer-Form zu erstellen. Das Poloxamer Form wurde mit einem zweiten Hydrogel verfüllt und dann eluiert, so dass Hohlräume, die mit einem dritten Hydrogel gefüllt wurden. Diese Methode verwendet schnelle Elution und gute Bedruckbarkeit von Poloxamers zu komplexen Architekturen aus Biopolymeren zu generieren.

Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Wir berichten über ein Verfahren zur Herstellung von Mikrotaschen in elektro Membranen, bei denen auf das Zellverhalten zu untersuchen. Insbesondere beschreiben wir eine Kombination von Mikrostereo und Elektro zur Herstellung von PLGA (Poly (lactid-co-glycolid)) Hornhaut Biomaterial Geräten mit Mikromerkmalen ausgestattet.

Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrospinnen auf Membranen Ausgestattet mit Nischen für die Hornhautregeneration Produzieren

In dieser Arbeit stellen wir eine Technik zur schnellen Herstellung von lebendem Gefäßgewebe durch direkte Kultivierung von Kollagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen vor. Darüber hinaus wird ein neues Protokoll zur mechanischen Charakterisierung von künstlich hergestellten Gefäßgeweben beschrieben.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Protokolle werden für die Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele basierend auf Hydrazone Vernetzung von Polymeren Oligomere auf der Schüttgut-Skala, Microscale, und nanoskaligen, letztere für die Zubereitung von Gel-Nanopartikeln und Nanofasern beschrieben.

Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele auf mehreren Längenskalen über reaktive Extrusion, Mikrofluidik, Selbstmontage und Elektrospinnen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von elastischen 3D makroporöse Microcryogels durch die Integration von Microfabrication mit Cryogelation Technologie. Beim Laden mit Zellen, entstehen 3D Microtissues, die kann leicht injizierte in Vivo , regenerative Therapie zu erleichtern oder zu Arrays für in-vitro- Hochdurchsatz-Drogen-Screening montiert.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

Ein Protokoll für die mikrofluidischen Spinning und Charakterisierung der Mikrostruktur regenerierten Seide Fibroin Monofilament wird vorgestellt.

Mikrofluidische trocken-Spinnen und Charakterisierung von regenerierten Seide Fibroin Fasern

Präsentiert hier ist eine Methode für den 3D-Bioprinting von Gelatine Methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Die Scherverarbeitung während der Hydrogelbildung führt zur Herstellung von Mikrogelsuspensionen, die scherdünn sind, sich aber nach Beseitigung der Scherkräfte schnell restrukturieren. Solche Materialien wurden als Stützmatrix für das Bioprinting komplexer, zellbeladener Strukturen verwendet. Hier werden Verfahren zur Herstellung des Stützbettes und kompatibler Biotinten beschrieben.

Agarose-Flüssiggele, die durch Scherverarbeitung während der Gelierung für suspendierten 3D-Biodruck gebildet werden

Dieser Artikel beschreibt Protokolle für die Herstellung von Gelatine-Methacryloyl-Mikrogelen mit hohem Durchsatz unter Verwendung mikrofluidischer Geräte, die Umwandlung von Mikrogelen in resuspendierbares Pulver (Mikroaerogele), die chemische Anordnung von Mikrogelen zu körnigen Hydrogelgerüsten und die Entwicklung von körnigen Hydrogel-Biotinten mit erhaltener Mikroporosität für den 3D-Biodruck.

Gelatine-Methacryloyl-Hydrogel-Gerüste: Hochdurchsatz-Mikrogelherstellung, Gefriertrocknung, chemische Assemblierung und 3D-Bioprinting

In dieser Studie wird ein neuartiges κ-Carrageen-Submikrogel-Suspensionsbad vorgestellt, das bemerkenswerte reversible Jamming-Unjamming-Übergangseigenschaften aufweist. Diese Attribute tragen zur Konstruktion biomimetischer Gewebe und Organe im eingebetteten 3D-Bioprinting bei. Das erfolgreiche Drucken von herz-/ösophagusähnlichem Gewebe mit hoher Auflösung und Zellwachstum demonstriert hochwertige Bioprinting- und Tissue-Engineering-Anwendungen.

Eingebettetes Bioprinting von gewebeähnlichen Strukturen mit κ-Carrageen-Submikrogel-Medium

Erfahren Sie die Nass-Spinn-Technik zur Herstellung gelatinbasierter Biomaterialien für die Geweberegeneration. Diese kostengünstige Methode ohne synthetische Polymere eignet sich für Nervenbehandlung und Blutgefäßersatz.

Nass-Spinnen-basierte Spritzgießprozess Gelatine für die Geweberegeneration

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