Name: Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende a visualizar linfocitos humanos en pulmón de ratón mediante microscopía de luz hoja en modelos de inflamación alérgica. Este método permite cuantificar la acumulación celular in vivo para investigación inmunológica.

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Los autores reconocen con agradecimiento financiación por la DFG colaboración investigación centros SFB 1181 y 241 TRR. La óptica de imagen centro de Erlangen (OICE) y en particular Ralf Palmisano, Philipp Tripal y Tina Fraaß (proyecto Z2 de la DFG CRC 1181) son reconocidos por expertos asistencia técnica para la proyección de imagen microscópica hoja de luz de la fluorescencia.

M.F. Neurath ha servido como asesor para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda y Boehringer. Los restantes autores no revelar cualquier conflicto.

El nivel experimental descrito aquí proporciona la oportunidad de controlar la capacidad recalada de pulmón de células inmunes humanas primarias bajo condiciones inflamatorias in vivo y así relevante complementos clásico realiza quimiotaxis y adherencia in vitro ensayos. Para tener en las características de órgano anatómico específico de cuenta del pulmón, aspectos importantes de la célula inmune autoguiado hacia el blanco (incluyendo chemotaxis y célula de distribución dentro del órgano blan...

Trastornos inflamatorios clásicos del pulmón, como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), son bien conocidos para ser conducido por un mayor reclutamiento de linfocitos activados en el tejido pulmonar1,2. Publicado por linfocitos citoquinas (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ y TNF-α) promover aún más la Quimiotaxis de las células inmunes innatas y adaptativas, inducen remodelación fibrótica de la vía aérea o directamente dañar el parénquima de pulmón2. Hasta ahora, los mecanismos subyacentes responsables de la acumulación patológica de linfocitos en el tejido pulmonar no se entiende todavía completamente. En analogía a impresión selectiva para el tejido T cell descrita homing de intestino y piel, pulmonares células dendríticas (DCs) son obviamente capaces de cebar células de T periféricas para infiltración de pulmón preferenciales, al menos en parte mediante la inducción de la expresión de CCR4 en la superficie de los linfocitos3. Además de CCR4, las células T infiltrantes en las vías respiratorias también se caracterizan por un especial incremento en la expresión de los receptores del chemokine CCR5 y CXCR3 en comparación con las células de T en la sangre periférica1,4,5. En generales, los datos son consistentes con el concepto que autoguiado hacia el blanco de los linfocitos T en condiciones fisiológicas o inflamatorias del pulmón consiste en un número de diferentes chemokine receptores y sus ligandos respectivos y así crucial depende de una estrecha colaboración control de colaboración entre las células inmunes innata y adaptativa1. Especialmente, durante la fase inicial de la exposición de patógenos o alérgenos, células del sistema inmune innato responden al estímulo de TLR o IgE-mediada del cross-linking de la liberación inmediata de los diferentes atrayentes, como el LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 y PGD21,6,7. Como un ejemplo, la interacción entre PGD2 y el receptor chemoattractant CRTh2 es conocido por ser de particular importancia para el quimiotactismo de las células Th2 y así apareció como prometedora diana terapéutica en el manejo clínico del asma. De hecho, pacientes con asma moderada mostraron una mejoría de los síntomas y un aumento significativo del volumen espiratorio forzado en un segundo (VEF1) después del tratamiento con un antagonista selectivo de CRTh2 en comparación con el placebo grupo8 ,9. En un estado más progresado de la respuesta inflamatoria, ya reclutado de las células T son capaces de amplificar más acumulación de linfocitos pulmonares mediante la liberación de IL-4 y IL-13 como potentes estímulos para DCs pulmonares. Posteriormente, estas células mieloides derivados de innatas para arriba-regulan la expresión de CCL17 y CCL22 en un dependiente de STAT6 forma1,10,11.  Aunque la complejidad de la situación descrita todavía impide una comprensión completa del pulmón de la célula de T autoguiado hacia el blanco, ofrece una gran cantidad de dianas moleculares para un control terapéutico potencialmente optimizado de enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de innovadoras técnicas experimentales, que son capaces de profundizar y complementar nuestro conocimiento en el campo de la Quimiotaxis de células T y homing de pulmón.
Debido a que homing pulmón de linfocitos en el cuerpo humano está influenciada por varios parámetros celulares, humorales y física1, la mayoría de los métodos experimentales existentes no es capaces de modelar la entera complejidad de este proceso inmunológico. En cambio, muchos protocolos estándar para el análisis de pulmón homing selectivamente se centran en un aspecto específico en la cascada de linfocito atracción, adhesión, migración y retención. Además de una determinación puramente descriptiva del patrón de expresión de mRNA o proteínas de receptores de integrinas y quimioquinas en linfocitos periféricos o infiltración pulmonar y la medida complementaria de chemokine respectivos niveles en sangre, el lavado broncoalveolar (BAL) o tejido pulmonar12,13,14,15, celular in vitro bien establecida cultura ensayos permiten una caracterización funcional de linfocitos adherencia o quimiotaxis en definidas condiciones experimentales16,17,18. En principio, ensayos de adherencia in vitro estática monitorea la capacidad de unión de los linfocitos cultivados para un monocapa endotelial o portaobjetos de vidrio recubiertas de moléculas de adhesión endotelial recombinantes (por ejemplo, MAdCAM-1, VCAM-1), mientras el estándar in vitro ensayos de quimiotaxis se aplican generalmente para cuantificar la capacidad de los linfocitos que migran a lo largo de un gradiente de chemokine en un sistema de transwell19. Ambos parámetros in vitro permiten un ajuste controlado y la modulación de las condiciones experimentales, pero por otro lado carecen de variables importantes que críticamente impacto en vivo de quimiotaxis y adherencia de los linfocitos. Predominante, ensayos de cultura de célula estática ignoran la influencia de las fuerzas de corte causadas por el flujo de sangre permanente19 y potencialmente descuidan la participación del alrededor ambiente inmunológico e interactuando no linfocitos las células inmunes, presentes en un organismo vivo. Para superar estas limitaciones, la interpretación de los resultados adquiridos en ensayos de quimiotaxis o adherencia in vitro estática necesita validación en experimentos de adhesión dinámico bajo condiciones de flujo20,21 y en modelos de órgano inflamatoria patología19en vivo. De hecho, importantes estudios en animales podrían extraer conclusiones sobre la regulación del pulmón de la célula de T autoguiado hacia el blanco en condiciones inflamatorias o alérgicas analizar genéticamente modificado ratones en modelos definidos de diferentes enfermedades pulmonares3, 22 , 23. la comparación cuantitativa de pulmón infiltración linfocitos entre ratones de tipo salvaje y ratones con una deficiencia de un gen específico de interés representa una herramienta bien establecida y ampliamente usada para definir el impacto del celular particular vías o receptores en el patrón basados en la enfermedad de la distribución de la célula de T. Sin embargo, en contraste con antes de debate ensayos de cultivo celular in vitro, un diseño de estudio basado en modelos animales clásicos carece de la capacidad de análisis y control de las células T primarias humanas directamente derivadas de la sangre o de BAL de pacientes que sufren de una inflamación pulmonar de la enfermedad. Por lo tanto, sigue siendo difícil para validar funcionalmente si una enfermedad pulmonar diagnóstico especificado es capaz de imprimir los linfocitos humanos de tropismo preferencial de pulmón y hasta qué punto los parámetros clínicos puedan impactar en este escenario. Recientemente, un enfoque muy elegante en vivo fue introducido en el contexto de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII), que fue capaz de superar la mayoría de estas limitaciones y abre nuevos caminos para estudios traslacionales en intestinal linfocito autoguiado hacia el blanco24 . Tomando ventaja de los protocolos para el claro del tejido base solvente seguida por microscopia de fluorescencia de luz de hoja transversal como una poderosa herramienta de imagen, fue posible visualizar la infiltración y distribución de las células de T humanas eventualmente transferidas en el intestino de ratones inmunodeficientes colitic24. En particular, esta configuración experimental implementó dos innovaciones principales: las células inmunitarias humanas primarias (1) pueden ser analizado bajo condiciones en vivo experimentalmente definidas; (2) un área bastante grande del órgano enfermo (aproximadamente 1,5 cm x 1,5 cm) puede ser reflejada en la calidad de alta resolución, seguida de reconstrucción 3D. Por otra parte, varios estudios recientes establecieron con éxito el uso de tejido base solvente claro y microscopía de fluorescencia de la hoja de luz como herramientas importantes para25,26la proyección de imagen avanzada del pulmón. Para poder beneficiarse de este avance tecnológico en el campo de la inmunología pulmonar, ahora adoptamos el sistema de análisis de homing de pulmón.
El protocolo presentado aquí ofrece una introducción paso a paso cómo purificar y fluorescencia etiqueta T humanos primario de las células de transferencia en ratones con inflamación pulmonar inducida y, por otra parte, describe en detalle el proceso posterior de la hoja de luz imágenes microscópicas de fluorescencia, como órgano preparación y procesamiento de imágenes. En general, esperamos apoyar futuros estudios traslacionales en el campo de las enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas mediante la introducción de un sofisticado, pero sin embargo factible modelo experimental para el monitoreo de linfocitos humanos pulmón autoguiado hacia el blanco en condiciones in vivo.

<table><tbody><tr><td>Agarosa NEEO Ultra</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFlour594 anticuerpo CD45 humano</td><td>BioLegend, San Diego, EE. UU</td>. <td>304060</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>Cánula K2981</td><td></td></tr><tr><td>21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EE. UU</td>. <td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Tinte para la proliferación celular eflour670</td><td>eBioscience Inc., San Diego, EE. UU.</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4 MicroBeads, humano</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemania</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de extracción de sangre de potasio-EDTA, 9 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>21066001</td><td></td></tr><tr><td>Ethly cinamato (ECi)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania</td><td>112372-100G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol &ge; 99.5% (EtOH)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>5054.3</td><td></td></tr><tr><td>FBS (suero fetal bovino) Good Forte</td><td>PAN-Biotech GmbH, Aidenbach, Alemania</td><td>P40-47500</td><td></td></tr><tr><td>Filtro 100 &micro; m&nbsp;</td><td>VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Alemania</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Image Analysis Software 9.0.2</td><td>Bitplane AG, Zúrich, Suiza</td><td>n.a.ImspectorPro</td><td></td></tr> <tr><td>software</td><td>Abberior Instruments GmbH, G&ouml; ttingen, Alemania</td><td>n.a.Ketamin</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Friburgo, Alemania</td><td>3617KET-V</td><td></td></tr><tr><td>LaVision UltraMicroscope II</td><td>LaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Alemania</td><td>n.a.MACS</td><td></td></tr> <tr><td>MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemania</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Cánula Multimosca 20 G</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>851638035</td><td></td></tr><tr><td>aguja de 30 G</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Alemania</td><td>9161502</td><td></td></tr><tr><td>cámara de recuento</td><td>Neubauer neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td>C-1003</td><td></td></tr><tr><td>Pattex Glue</td><td>Henkel AG & Co, D&uuml; Sseldorf, Alemania</td><td>Columna PSK1C</td><td></td></tr><tr><td>LS</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemania</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Medios de separación de linfocitos (densidad 1.077 g/mL)</td><td>anprotec</td><td>AC-AF-0018</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Merck</td><td>1.071.440.025</td><td></td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (solución salina tamponada con fosfato)</td><td>Biochrom GmbH, Berlín, Alemania</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 antihumano CD4</td><td>BioLegend, San Diego, EE. UU.</td><td>317428</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 ratón IgG2b, &kappa; isotipo Ctrl</td><td>BioLegend, San Diego, EE. UU.</td><td>400337</td><td></td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehído)</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>0335.1</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de hidrógeno de potasio</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 10 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>86.1254.001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 1 mL</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Alemania</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 5 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EE. UU</td>. <td>260067</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa 20 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EE. UU</td>. <td></td> 260069 <td></td></tr><tr><td>Tubo 1,5 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>72.706.400</td><td></td></tr><tr><td>Tubo 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>72.695.400&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo 2 mL, marrón</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>72.695.001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo 15 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>62.554.502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo 50 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>62.547.254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemania</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (Rompun 2%)</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania</td><td>KPOBD32</td><td></td></tr></tbody></table>

avanzadas de la proyección de imagen de pulmón homing de linfocitos humanos en un experimental en modelo vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Acumulación de tejido de células inmunitarias altamente activadas representa un sello de varias enfermedades inflamatorias crónicas y surgió como una diana terapéutica atractiva en el manejo clínico de los pacientes afectados. Para optimizar aún más estrategias con el objetivo de la regulación terapéutica de infiltración de tejido patológicamente desequilibrada de células inmunológicas inflamatorias, será de particular importancia para el logro de mejores perspectivas en enfermedades órgano-específicas y propiedades homing de linfocitos periféricos. El protocolo experimental descrito aquí permite para vigilar acumulación pulmonar de fluorescencia etiquetadas y eventualmente transferidos los linfocitos humanos en el contexto de la inflamación pulmonar inducida por la papaína. En contraste con estudios in vitro estándar utilizadas para el análisis de la migración de células inmunes y quimiotaxis, la configuración en vivo ahora introducida tiene en cuenta los aspectos pulmonar específico de organización tejido y la influencia del complejo inflamatorio escenario tiene lugar en el organismo murino vivo. Por otra parte, la proyección de imagen microscópica tridimensional transversal hoja de luz fluorescencia no sólo proporciona datos cuantitativos sobre las células inmunes de la infiltración, pero también representa el patrón de localización de células inmunitarias en el pulmón inflamado. En general, somos capaces de introducir una técnica innovadora de alto valor para la investigación inmunológica en el campo de enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas, que pueden aplicarse fácilmente siguiendo el protocolo paso a paso siempre.

El protocolo presentado describe un modelo experimental de ratón, que permite monitoreo y cuantificación de la acumulación de linfocitos T humanos eventualmente transferidos en el pulmón mediante microscopía de fluorescencia de la hoja de luz. Figura 1 Proporciona un Resumen esquemático de los pasos en vivo del programa experimental . Para garantizar resultados confiables, se etiqueta de sustancial importancia para garantizar una buena calidad de los aislados y fluorescencia...

El protocolo introdujo aquí permite la caracterización de la capacidad de pulmón homing de linfocitos humanos primarios en condiciones inflamatorias en vivo. La infiltración pulmonar de células inmunes humanas eventualmente transferidas en un modelo murino de inflamación alérgica puede ser reflejada y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia de luz hoja de tejido pulmonar químicamente limpia.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Nuestra técnica permite la toma de imágenes precisas de células inmunitarias humanas acumuladas en pulmones en condiciones inflamatorias in vivo, proporcionando información interesantes sobre el proceso de localización pulmonar de células T. Este protocolo apoya la investigación traslacional en el rastreo pulmonar de las células T y, por lo tanto, puede ayudar en la identificación de nuevos objetivos para una terapia optimizada de enfermedades pulmonares inflamatorias o alérgicas. En particular, la capacidad de considerar la influencia de las propiedades de células inmunitarias específicas de la enfermedad, la organización del tejido pulmonar y el entorno inflamatorio en la localización pulmonar de las células T hace que este método sea altamente ventajoso.En general, nuestra técnica es de alto valor para la investigación inmunológica en el campo de las enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas, que a menudo son impulsadas por una abrumadora acumulación de tejido de células inmunitarias activadas. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco en un ratón C57 negro 6J de al menos 16 gramos, seis semanas de edad, anestesiado, utilice un micropipet para entregar lentamente 10 microlitros de solución de papaína recién preparada en una fosa nasal del ratón una vez al día durante tres días consecutivos. Al día siguiente de la última administración de papaína, capa 10 mililitros de Ficoll medio bajo sangre periférica humana de un voluntario sano pre-diluido en una proporción de uno a dos en PBS para la separación del gradiente de densidad por centrifugación.Transfiera la célula sanguínea mononuclear periférica o la capa de interfase PBMC a un nuevo tubo de 50 mililitros y recoja las células por centrifugación. A continuación, realice el aislamiento magnético de microperlas de células positivas CD4 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Re-suspendiendo las células T positivas CD4 aisladas del cordón a una hasta una diez veces a las séptimas células T por al menos 500 microlitros de concentración de PBS.Etiquete las células con un tinte adecuado de proliferación celular excitable de luz roja durante 10 minutos a 37 grados celsius. Al final de la incubación, detener la reacción de etiquetado con cinco volúmenes de RPMI medio complementado con 10%FBS durante cinco minutos en hielo seguido de tres lavados en medio. Para la transferencia adoptiva de los células T positivas CD4 humanas a ratones receptores expuestos a papaína, readhestique las células T etiquetadas fluorescentemente a una concentración de una vez 10 a la séptima célula por mililitro de concentración en PBS y cargue 100 microlitros de células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 30 por animal receptor, luego inyecte todo el volumen de células de una jeringa en la vena de la cola un animal tratado con papaína manteniendo la aguja de la punta dentro de la vena para un adicional cinco segundos después del parto celular para evitar la descarga de la suspensión celular.Tres horas después de la transferencia de células adoptivas, perfore el ventrículo derecho de cada ratón eutanizado con una cánula de calibre 21 conectada a un catéter y haga una incisión en el ventrículo izquierdo. Perfunde lentamente el pulmón con 20 mililitros de PBS helado complementado con cinco EDTA milimétricas seguidos por dos mililitros de helado 4%paraformaldehído. Cuando todo el fijador se haya lavado a través del tejido, retire las glándulas salivales y corte el músculo hioides esternal para permitir que un fórceps se deslice debajo de la tráquea para exponer el tejido del tubo de aire.Realice una punción inicial de la tráquea expuesta con una aguja del calibre 30 antes de reemplazar la aguja con un catéter de calibre 30 para evitar más daños en el tejido. Utilice un soporte de aguja para sellar la unión entre el catéter insertado y la tráquea, y llene cuidadosamente las vías respiratorias con aproximadamente 37 grados Celsius 0.75% de agarosa hasta el despliegue completo del pulmón. Una unión estrecha entre el catéter y la tráquea es fundamental para expandir el pulmón a su tamaño fisiológico y mantener la arquitectura tisular para la toma de imágenes.Cuando la agarosa se haya solidificado por completo, retire el catéter y transfiera cuidadosamente el pulmón a un tubo oscurecido de dos mililitros lleno de 4%paraformaldehdye. A continuación, deshidratar el tejido con incubaciones secuenciales de etanol bajo rotación continua a 31 rotaciones por minuto y cuatro grados Celsius como se indica durante cuatro horas por incubación. Después de la deshidratación completa, transfiera la muestra a cinnamato etílico para una incubación durante la noche a temperatura ambiente hasta que el tejido aparezca translúcido.Para una microscopía fluorescente de hoja de luz, utilice una pequeña gota de pegamento estable con disolvente orgánico para pegar el pulmón al soporte de muestra del microscopio y colocar el lóbulo pulmonar en el soporte en posición vertical. Coloque el portacuchillas en su cámara y seleccione los láseres adecuados para el experimento en el software del instrumento. A continuación, utilice los controles deslizantes en Optics para establecer un ancho de hoja que la apertura numérica que revela uniformemente todo el órgano o una sección específica de interés.Utilice el control deslizante para establecer la intensidad del láser bajo control de transmisión láser para cada láser seleccionado y haga clic en Aplicar. Utilice Configuración de medición avanzada para fusionar las hojas de luz izquierda y derecha para crear una imagen iluminada de forma homogénea. Defina las posiciones inicial y final de la pila Z que se medirán en el rango de escaneo y establezca el tamaño del paso en cinco micrómetros y, a continuación, seleccione autoguardar para guardar los archivos automáticamente e iniciar la medición para capturar las imágenes.Una vez adquiridas todas las imágenes, active el botón Superar en el software de análisis 3D posterior a la imagen y cargue la primera imagen desde una pila Z para iniciar la apertura y la reconstrucción 3D automática de todas las demás imágenes de la pila Z seleccionada, luego en Ajuste de pantalla, ajuste la intensidad, el nivel de negro y el contraste para cada canal. Para comparar la acumulación de células humanas dentro del tejido pulmonar en diferentes muestras, seleccione Editar y recortar 3D para definir un cubo pulmonar con un volumen específico. Para cuantificar las celdas etiquetadas dentro del cubo pulmonar definido, abra Agregar nuevos puntos en la barra de herramientas, haga clic en Omitir creación automática, edite manualmente y seleccione el canal de 640 nanómetros.Establezca la escala de radio en 10,00 micras, haga clic en Seleccionar y, en Editar, pulse Mayús y haga clic con el botón izquierdo del ratón para marcar individualmente cada celda con un punto. El número total de celdas contadas se mostrará en las estadísticas. Para capturar una imagen, utilice la herramienta de instantáneas o utilice la herramienta de animación para capturar un vídeo.El enriquecimiento celular a base de micropera y el posterior etiquetado de fluorescencia, como se demuestra normalmente resultan en una pureza positiva CD4 de al menos el 95% y un etiquetado exitoso de estas células según lo determinado por la citometría de flujo. La limpieza de tejido a base de cinnamato etílico logra un alto nivel de transparencia orgánica que indica una coincidencia exitosa del índice de refracción. La señal auto-fluorescente del tejido pulmonar ofrece una herramienta útil para imaginar la estructura anatómica del pulmón mediante microscopía de hoja de luz que se puede mostrar como una proyección de intensidad media o en modo de superficie.En comparación con la microscopía convencional, la microscopía de láminas ligeras ofrece la ventaja de la toma de imágenes de órganos enteros y la posterior reconstrucción 3D que permite la identificación y visualización de células T humanas etiquetadas con tinte de proliferación en el contexto de todo el órgano, además, la preferencia de las células T humanas transferidas para la acumulación selectiva dentro del tejido pulmonar inflamado de los animales expuestos a la papaína se apoya aún más en el hecho de que las células T positivas CD4 humanas no se pueden recuperar de la mucosa intestinal. Para la cuantificación y comparación de la acumulación pulmonar de células T positivas CD4 humanas entre diferentes condiciones, las células etiquetadas también se pueden contar en varios cubos pulmonares de volumen definido como se ha demostrado. La preparación cuidadosa de los tejidos, incluida la perfusión pulmonar, la inflación y la limpieza de tejidos, es muy importante para una generación optimizada de imágenes microscópicas de hojas de luz de alta resolución.Para confirmar aún más la diapedesis exitosa de los linfocitos humanos transferidos, este protocolo se puede combinar fácilmente con la cuantificación citométrica de flujo de linfocitos humanos dentro del lavado broncoalveolar murino. La capacidad de controlar las células inmunitarias derivadas de pacientes individuales en condiciones in vivo apoya la identificación de alteraciones funcionales en las células inmunitarias impresas por una enfermedad o terapia en particular.

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Microscopía de luz de hoja para la visualización tridimensional de las células inmunes humanas

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Microscopía intravital de fluorescencia de campo ancho de la microcirculación pulmonar en la lesión pulmonar aguda experimental utilizando un sistema de imágenes estabilizado por vacío

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Aprende a visualizar linfocitos humanos en pulmón de ratón mediante microscopía de luz hoja en modelos de inflamación alérgica. Este método permite cuantificar la acumulación celular in vivo para investigación inmunológica.

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja (Video) | JoVE Journal

Avanzadas de la proyección de imagen de pulmón Homing de linfocitos humanos en un Experimental en modelo Vivo de inflamación alérgica basada en microscopia de luz hoja

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