Name: Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a analizar la expresión génica bacteriana en tejidos animales mediante fluorescencia con Staphylococcus aureus. Este método revela patrones espaciales y heterogeneidades poblacionales para identificar nuevas dianas terapéuticas contra infecciones.

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Agradecemos a Alexander Horswill para el regalo de la fusión de PsarAP1- tdTomato y Karen Creswell para ayuda con análisis de citometría de flujo. También agradecemos a Alyssa King para asesoramiento en análisis estadístico. Este trabajo fue financiado en parte por fondos de inicio de Facultad a SRB y un premio de investigación exploratorios/desarrollo de NIH (grant AI123708). Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos e interpretación o la decisión de enviar el trabajo para su publicación.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Georgetown.
1. generación de la cepa de reportero fluorescente
<ol><li>Digerir el vector de pRB4 integradora de genoma secuencialmente con enzimas de restricción EcoRI y SmaI. Siguiendo el protocolo del fabricante, configurar una digestión durante la noche con SmaI con 1 μg de pRB4 a 25 ° C y luego proceder con la segunda digestión por 1h a 37 ° C mediante la adición de EcoRI de la mezcla de reacción. Inactivar las enzimas por incubación a 65 ° C por 20 min.</li>
	<li>PCR amplifica la región reguladora de interés de la DNA genomic (en este caso, un par de base ~ 350 fragmento de ADN que contiene la región del promotor thermonuclease [nuc]), la incorporación de un sitio de restricción de EcoRI de 5' y un sitio de restricción SmaI 3'. La secuencia de reconocimiento de SmaI debe ser en el marco con el codón de inicio traslacional. En este estudio, la PCR fue realizada usando una ADN polimerasa de alta fidelidad según las recomendaciones del fabricante con primer avance oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') y atrás (oRB016) primer 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). La temperatura de recocido es 53 ° C. Purificar el fragmento resultante usando un kit de limpieza PCR siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Digerir el producto resultante de la polimerización en cadena con EcoRI y SmaI ya que se realiza en el paso 1.1 y ligar el fragmento de ADN digerido a los mismos sitios de pRB4 con T4 ADN ligasa como recomendado por el fabricante para generar la construcción integradora. Introducir la mezcla de ligadura en e. coli y confirmar la secuencia de construcción.</li>
	<li>Electroporate la construcción en la cepa de S. aureus RN4220 como describió anteriormente34. En Resumen, utilizar 1 μg de plásmido con 70 μl de células competentes de electro (Ω 100, 25 μF y 2,3 kV) en caldo de B2 (hidrolizado de caseína 1% [p/v], extracto de levadura 2.5% [p/v], 2,5% [p/v] NaCl, 0,1% [p/v] K2PO4, 0.5% [p/v] de glucosa). Seleccionar para la resistencia a la eritromicina (Emr) a la temperatura permisiva (30 ° C) en agar peptona de soja (TSA) suplementado con eritromicina (5 μg mL-1) y 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 μg mL-1). Los transformantes resultantes son azules debido a la actividad de β-galactosidasa codificada por el plásmido. Nota: Transferencia de ADN en cepas clínicas es muy difícil debido a una fuerte restricción-modificación barrera35. Por lo tanto, S. aureus RN4220 fue utilizado como un destinatario intermedio de la construcción de la fusión porque es restricción deficiente y altamente transformable.</li>
	<li>Transferencia de plásmido a S. aureus cepa USA300 interés con electroporación o transducción mediada por fagos36 a la temperatura permisiva. En Resumen, propagar bacteriófagos de11 Φ las partículas de la cepa donante usando las placas de TSA que contiene 5 mM CaCl2 noche a 30 ° C y luego esterilización por filtración a través de un filtro de jeringa 0.45 μm acetato de celulosa. Utilizar lisados para transducir S. aureus cepa LAC Emr. Nota: LAC es un aislante clínico ampliamente utilizado que previamente hizo Em sensible paso serial en medio TSB para curar la tensión de la pUSA03 nativa de plásmido que confiere Emr 37,38.</li>
	<li>Integrar la construcción por dos eventos de recombinación homóloga sucesivas en el cromosoma como se describió anteriormente32. Los recombinantes son resistentes al cloranfenicol (Cmr) en placas de TSA que contiene 5 μg mL-1 de cloranfenicol, eritromicina susceptibles (Erms) y no más azul. Nota: Cuando sea posible, volver a introducir la fusión marcada en USA300 vía transducción mediada por fagos para evitar la acumulación de mutaciones asociadas con tensión in vitro paso39 y temperatura cambios.</li>
</ol>2. animal infección: Preparación del inóculo, infección sistémica y procesamiento de tejido
<ol><li>
Preparación del inóculo bacteriano
	<ol>
<li>Raya las cepas de S. aureus de interés para el aislamiento en placas de agar sangre de un stock de glicerol congelados. Incubar a 37 ° C durante 16-24 h confirmar los fenotipos hemolíticos basados en su capacidad para lisar los glóbulos rojos (gr) y forma claras zonas transparentes.</li>
		<li>Inocular las colonias individuales de cada cepa a 4 mL de caldo de soja tríptica (TSB) en tubos de vidrio estériles para iniciar cultivos durante la noche. Gire los tubos a 37 ° C durante 16-24 h en un rodillo de tubo de aproximadamente un ángulo de 70° y 70 revoluciones por minuto [RPM].</li>
		<li>Use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) de las culturas en el paso 2.1.2. Medio estéril de uso como una referencia óptica (en blanco). Diluir estas células a un OD600 de 0.05 en 25 mL de estéril peptona soya caldo (TSB) en separado, 125 mL DeLong frascos (5:1 frasco al cociente del volumen) e incubar de culturas en un baño de agua (para la transferencia de calor adecuado a las culturas), sacudiendo a 280 RPM y en 37 ° C. Nota: Crecimiento del inóculo puede realizarse de varias maneras; se presenta un método para el cultivo de células en fase exponencial. Cueste lo que cueste, es importante que siempre utilice el mismo método para preparar las células para la inoculación.</li>
		<li>A un OD600 de ~ 1, volver a diluir las células en medio fresco a un partida de OD600 de 0.05 para las células alcanzar fase exponencial y que factores que se acumulan durante la incubación durante la noche se han reducido a niveles de fase exponencial.</li>
		<li>Recoger las células durante la fase exponencial (OD600 ~0.6–0.8) por centrifugación a 3.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar el pellet dos veces en volumen equivalente de estéril 1 x solución salina con tampón fosfato (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Suspender las células en PBS 1 x (pH 7,4) a una concentración de 1 x 108 colonias formando unidades (UFC) mL-1 o según corresponda para el deseado experimentar. Nota: es importante determinar la relación entre el OD600 y UFC mL-1 para cada cepa de interés debido a alteraciones dependientes de la tensión de forma y tamaño celular pueden afectar propiedades de dispersión de la luz y en última instancia, la dosis de infección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de los animales y la infección bacteriana
	<ol>
<li>Aclimatar ratones durante 7 días en purificada dieta AIN-93. La dieta está formulada para proporcionar una nutrición adecuada reduciendo el tejido auto-fluorescencia asociada con el consumo de alimentos basados en plantas utilizadas en la ratón estándar chow40. Nota: Mujer ratones C57/BL6 (6-8 semanas) se utilizan aquí, pero dependerán de la cepa de ratón y el sexo en el estudio.</li>
		<li>Antes de la infección, se dilatan las venas de cola de ratón con agua tibia.</li>
		<li>Infectar a animales por inyección 100 μl del inóculo bacteriano mediante cola las venas para producir una infección sistémica. Guardar una alícuota del inóculo inicial en caso de citometría de flujo (ver sección 4).</li>
		<li>Vigilar animales diariamente y evaluar su estado de salud mediante un sistema de monitoreo revisado y aprobado por la institucional Animal cuidado y uso.</li>
		<li>Permiten la infección al progreso para la duración deseada. Aquí, los experimentos son terminados 3 días post-infección. Nota: En estas condiciones, abscesos consisten en una comunidad de absceso estafilococio de bacterias, rodeado de depósitos de fibrina y rodeado por capas concéntricas de células inmunes5,41.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección de los órganos y el proceso de tejido
	<ol>
<li>Eutanasia a los animales por inhalación de CO2 y dislocación cervical como método secundario y realizar la necropsia.</li>
		<li>Cosecha de riñón (derecha) y otros órganos vitales (pulmones corazón, hígado, bazo) y transferir a tubos de polipropileno de 15 mL que contenga formol al 10% [v/v] intermedia. Proceder con estos órganos a 2.3.4 abajo.</li>
		<li>Transferir el riñón izquierdo a un tubo resistente a los choques estériles de 2 mL que contiene ~ 500 μl de perlas de silicona de 2 mm y 1 mL estéril de 1 x PBS (pH 7.4). Proceder con este órgano al paso 4.2.</li>
		<li>Permita que los órganos de paso 2.3.2 para fijar en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave o rotación de al menos 24 horas pero no más de 48 horas.</li>
		<li>Integrar órganos de tejido claro medio de congelación y almacenar los tejidos a-80 ° C.</li>
		<li>Usando un criostato, sección tejido en rebanadas de 10 μm de grosor.</li>
		<li>Secar las secciones en un portaobjetos de vidrio previamente limpia y cargada durante 20 min en la oscuridad, aplicar medio de montaje disco duro con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Mancha y aplicar el cubreobjetos. Curar las diapositivas montadas a temperatura ambiente durante la noche y traslado a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Microscopía Confocal y proceso de imagen del laser
<ol><li>Examinar diapositivas montadas para localizar lesiones con láseres apropiados para el reportero fluorescente se utiliza. Las señales se utilizan en este caso, el verde (GFP), rojo (tdTomato) y fluorescencia (DAPI) azul.</li>
	<li>Adquirir la imagen mediante el objetivo adecuado para la visualización de células individuales (por ejemplo, típicamente 20 x o 40 x objetivos se utilizan).</li>
	<li>
Medir las intensidades de fluorescencia en las imágenes confocales.
	<ol>
<li>Abra la imagen confocal en Image J y ajustar brillo y contraste para visualizar correctamente la señal de fluorescencia de la lesión.</li>
		<li>Definir la región de interés y mediante la opción de umbralización , establecer los límites inferior y superior de la fluorescencia según sea necesario.</li>
		<li>Definen el centroide seleccionando área → valor de gris medio → centroide → límite umbral en la pestaña de análisis de imagen J.</li>
		<li>Extraer valor de intensidad de fluorescencia de centroide o medir la intensidad de fluorescencia media en una lesión determinada por unidad de área (intensidad de fluorescencia media, IMF) para GFP y tdTomato. Aquí, se utilizaron áreas de2 μm. Nota: Un segundo análisis ciego minimiza el sesgo cuando se conoce la identidad de la muestra.</li>
		<li>Parcela los datos y realizar los análisis estadísticos apropiados para cada comparación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de citometría de flujo de
<ol><li>
(Opcional) Determinar la actividad de la fusión del inóculo en el día de la infección (de la sección 2.2.3)
	<ol>
<li>A 899 μl de 1 x PBS estéril (pH 7.4) Añadir 100 μl de cada inóculo y 1 μl de ácido nucleico florescente de membrana mancha (véase Tabla de materiales). Como control, asegúrese de incluir una muestra de falta de tinción del ácido nucleico.</li>
		<li>Realizar citometría de flujo en todas las muestras. Nota: Para el primer experimento, es útil incluir un control único vector para la fusión de interés para determinar el voltaje adecuado a utilizar. Una clara separación entre muestras positivas y negativas es esencial para el análisis de los datos, indicando que el reportero está muy por encima de la señal de fondo.</li>
		<li>Para identificar la población bacteriana, parcela eventos mediante tinción de ácido nucleico (eje y) y adelante scatter (eje x).</li>
		<li>Dibujar una puerta de inserción alrededor de eventos que son ambos ácidos nucleicos tiñen positivamente y el tamaño correcto de la bacteria basado en la dispersión hacia delante (entre 0.5 a 2.0 μm para S. aureus). Nota: Ser riguroso al identificar esta población ya que es fundamental para incluir eventos que están claramente dentro de estos parámetros. Asegúrese de que esta puerta no incluye todos los eventos para los controles negativos en otras condiciones. En este estudio, aproximadamente el 70% la población de células se reunió estos requisitos en el análisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de muestras de tejido después del sacrificio:
	<ol>
<li>Eutanasia a los animales, cosechar los riñones izquierdos (ver paso 2.3), y transferencia en grano-paliza tubos conteniendo 1 mL de 1 x PBS estéril (pH 7.4) y 250 μl de granos de borosilicato de 2 mm.</li>
		<li>Alteran los tejidos para liberar las células bacterianas. Para riñones, utilizar un homogeneizador para alterar las células. Aquí, tres 30 s ráfagas a 6800 rpm con 1 min períodos en hielo húmedo entre los ciclos de enfriamiento fueron utilizados para minimizar las muestras de la calefacción.</li>
		<li>Pellets de los más grandes restos de tejido por centrifugación a 250 x g durante 3 minutos en una microcentrífuga de mesa enfriado a 4 ° C. Nota: Por lo general, es un precipitado de células en la parte inferior del tubo y una capa de escombros flotantes en la parte superior. La capa acuosa media contiene las células bacterianas.</li>
		<li>Transferir 10 μl de la capa acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL que contiene 1 μl de colorante de ácidos nucleicos en 989 μl de PBS (volumen total de 1 mL).</li>
		<li>Realizar citometría de flujo utilizando los mismos parámetros de adquisición de datos y bloquear como el inóculo inicial. Nota: Recuento bacteriano será muy bajo porque la muestra contiene principalmente desechos de tejido. La opción "Live gate" también puede utilizarse si las células son ácido nucleico tinción positiva y cerrada de tamaño cuando los datos se cargan en la aplicación. Esto también ayudará a analizar más de los eventos de destino y reducir el tamaño del archivo. Casi 1 millón de eventos por muestra se cuentan, pero más cuentas de evento pueden ser necesarias dependiendo de la severidad de la infección y el tamaño del tejido analizado.</li>
		<li>Análisis de los datos: Determinar significa intensidad fluorescente (IMF) para cada fluoróforo en una muestra determinada usando las puertas de la inclusión en la sección 4.1.4. Normalizar las muestras en el software de análisis de flujo a evento cuentas. 10.000 cuentas son generalmente suficientes en el análisis. Nota: No es raro encontrar muestras que contienen menos de este número de eventos ya que es dependiente en la severidad de infección y formación de absceso. Usando este acercamiento, 500-40.000 eventos suelen encontrarse en tejido infectado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Enfermedades infecciosas bacterianas son un problema de salud creciente en todo el mundo debido a la adquisición de los determinantes de resistencia antibiótica46. Porque la adaptación a entornos de host es esencial para el crecimiento y supervivencia durante la infección, estrategias dirigidas a programas de expresión génica que aumentan la aptitud del patógeno pueden resultar útiles terapéuticamente. Un tal programa es el conjunto de genes controlados por el sistema de dos componentes de SaeR/S ...

Las bacterias responden a cambiar condiciones fisiológicas y las alteraciones en el estado nutricional de su entorno expresando diferencialmente genes necesarios para la adaptación y supervivencia. Por ejemplo, patógenos oportunistas colonizan cuerpo superficies en relativamente bajas densidades y suelen ser inofensivos. Sin embargo, una vez que la bacteria ha penetrado las barreras físicas y químicas, deben lidiar con el anfitrión célula inmune contra defensas y restringida la disponibilidad de nutrientes1. Por ejemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente un tercio de la población de forma asintomática pero también es la causa de la piel devastador e infecciones de tejidos blandos, osteomielitis, endocarditis y bacteremia2. El éxito de S. aureus como patógeno a menudo se atribuye a su flexibilidad metabólica, así como un arsenal de factores de virulencia asociados a superficie y secretada que permiten a la bacteria escapar el torrente sanguíneo y replicar en tejidos periféricos 3,4,5. Porque la muerte del anfitrión debido a la enfermedad estafilocócica es un callejón sin salida evolutivo y límites de transmisión a nuevos anfitriones6, debe controlarse cuidadosamente el compromiso con la producción del factor de virulencia.
Una compleja red de regulación de proteínas y no-codificación RNAs responde a una variedad de estímulos ambientales, incluyendo la célula densidad, fase de crecimiento, factores asociados del neutrófilo y la disponibilidad de nutrientes, para asegurar que los genes de virulencia se expresan en la hora exacta y la ubicación en host tejidos7,8,9,10,11,12,13. Por ejemplo, el sistema de dos componentes de SaeR/S (TCS) regula la expresión de varios factores de virulencia a través de la cinasa del sensor (SaeS) y la respuesta de regulador (SaeR)14. SaeS es autophosphorylated en un residuo conservado de histidina en respuesta a señales (e.g., humano neutrófilos péptidos [HNPs], calprotectina) de host8,15,16. El grupo fosforilo es entonces transferido a un residuo de aspartato en SaeR, activarlo como una proteína de unión al ADN (SaeR ~ P)17. El TCS SaeR/S regula más de 20 genes que contribuyen a la patogénesis, incluyendo proteínas de unión de fibronectina (FnBPs), leukocidins y coagulasa14,18,19,20. Objetivos se pueden clasificar en objetivos gene de alta afinidad y baja afinidad, que son probablemente inducida como el nivel de SaeR ~ P se levanta cuando se exponen a sus señales21. La actividad de SaeR/S es controlada por otros reguladores de expresión génica como el sistema de detección de quórum de Agr, represor de las toxinas proteínas (putrefacción) y el factor sigma alternativo B (SigB)22,23,24.
NUC es un gen de virulencia dependientes de la Sae en Staphylococcus aureus y codifica thermonuclease (Nuc), que es esencial para escapar de neutrophilic extracellular traps (redes) y para su difusión durante la curso de la infección25,26. La expresión de nuc es también fuertemente indirectamente reprimida por CodY en presencia de los aminoácidos de cadena ramificada y GTP27y directamente reprimida por la proteína estafilocócica regulador accesorio SarA28,29 , cuya actividad está influenciada por el oxígeno (estado redox) y pH30. Dado que sae y nuc mutantes se atenúan en modelos de ratón de la infección, hay interés en el desarrollo de intervenciones químicas que inhiben sus correspondientes actividades26,31. A pesar de esto, no hay información con respecto a su regulación durante la infección.
Reporteros fluorescentes se han utilizado para controlar y cuantificar la expresión génica a nivel unicelular. Adjunto, presentamos un método para cuantificar el S. aureus expresión génica durante la infección, cuando se combina con análisis de transcriptoma en vitro y potentes técnicas de imagen como resonancia magnética (MRI) y espectroscopia de resonancia magnética (MRS), puede revelar cómo bacteriana Fisiología está regulada in vivo y la relativa abundancia de nutrientes en ciertos nichos. El método puede aplicarse a cualquier patógeno bacteriano con un manejable sistema de genético.
Resumen del vector integrador de genoma.
El pRB4 vector integrador de genoma contiene 500 pares de bases cada uno de las regiones de aguas arriba y aguas abajo del pseudogene S. aureus USA300 SAUSA300_0087 para facilitar la recombinación homóloga. pRB4 se deriva de la columna vertebral de vector pMAD sensibles a la temperatura que contiene el cassette de resistencia a eritromicina (ermC) y beta-galactosidasa termoestable gene bgaB para azul/blanco cribado de recombinantes32. La construcción de ingeniería reportero también contiene un marcador de resistencia a cloranfenicol (cat) para la selección después de la integración del genoma y eliminación de plásmido, así como sitios de EcoRI y SmaI fusionar la región reguladora de interés verde superfolder proteína fluorescente (sGFP) (figura 1). Se sabe que la elección del sitio de unión a ribosoma (RBS) influye en la actividad del reportero y a menudo requiere optimización empírica33. Por lo tanto, no se suministra un RBS. Aquí, el sitio de unión del ribosoma nativa se utiliza para proporcionar un patrón natural de la expresión génica, pero pueden utilizarse otros sitios.

<table><tbody><tr><td>5% de sangre de oveja</td><td>Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galactopiranósido (X-Gal)</td><td>ThermoScientific</td><td>R0402</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 Ratones</td><td>Charles River</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0378</td><td></td></tr><tr><td>microscopio de barrido láser confocal</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo criostato</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Culture, Cap</td><td>VWR International</td><td>2005-02512</td><td></td></tr><tr><td>D+2:25NA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5389</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de flujo</td><td>Becton Dickinson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>perlas de vidrio</td><td>Sigma</td><td>Z273627</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep, plásmido</td><td>Promega</td><td>A1220</td><td></td></tr><tr><td>baño de agua agitador orbital</td><td>New Brunswick Innova</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>purificación PCR</td><td>QIagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato salino (PBS)</td><td>Cellgrow</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 homogeneizador</td><td>Bertin Laboratories</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>pUC57-Kan</td><td>GenScript (Piscataway, NJ)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Taq ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de restricción</td><td>Nuevo England Biolabs (Ipswich, MA)</td><td>R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptasa inversa</td><td>New England BioLabs</td><td>E6300L</td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sequencing</td><td>Genewiz (Germantown, MD)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sub Xero medio de congelación de tejido claro</td><td>Mercedes Medical</td><td>MER5000</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>superloop</td><td>GE Lifesciences</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, filtro</td><td>VWR International</td><td>28145-481</td><td></td></tr><tr><td>Syto 40</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11351</td><td>Tinción de ácido nucleico permeado en la membrana</td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico</td><td>VWR</td><td>90000-376</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-visible</td><td>Beckman Coulter-DU350</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Vectashield Antifade con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr></tbody></table>

un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Genes de virulencia bacteriana a menudo están regulados a nivel transcripcional por múltiples factores que responden a señales ambientales diferentes. Algunos factores que actúan directamente sobre los genes de virulencia; otros controlan patogenesia ajustando la expresión de los reguladores de aguas abajo o la acumulación de señales que afectan la actividad de regulador. Mientras que el Reglamento ha sido estudiado ampliamente durante el crecimiento en vitro , relativamente poco se sabe sobre cómo se ajusta la expresión génica durante la infección. Dicha información es importante cuando el producto de un gen particular es un candidato para la intervención terapéutica. Enfoques transcripcionales como RT-PCR cuantitativa en tiempo real, y RNA-Seq son poderosas formas de examinar la expresión génica a nivel global pero sufren muchos problemas técnicos incluyendo la baja abundancia de RNA bacteriana en comparación con el RNA del anfitrión y muestra degradación por RNasas. Evaluación de regulación utilizando reporteros fluorescentes es relativamente fácil y puede ser multiplexado con proteínas fluorescentes con propiedades espectrales únicas. El método permite el análisis unicelular, espacio-temporal de la expresión génica en los tejidos que presentan complejas tridimensionales gradientes arquitectura y fisicoquímicos que afectan redes de regulación bacterianas. Dicha información se pierde cuando se calcula el promedio de los datos sobre la población a granel. Adjunto, describimos un método para cuantificar la expresión génica en bacterias patógenas in situ. El método se basa en el procesamiento de tejido simple y directa observación de la fluorescencia de proteínas de reportero. Demostramos la utilidad de este sistema mediante el examen de la expresión de la thermonuclease de Staphylococcus aureus (nuc), cuyo producto del gene es necesario para la evasión inmune y la virulencia completo ex vivo e in vivo. Mostramos que nuc-gfp se expresa fuertemente en abscesos renales y revelar expresión génica heterogénea debido en parte a la aparente regulación espacial de la actividad de promotor de nuc en abscesos comprometidos plenamente con la respuesta inmune. El método puede aplicarse a cualquier bacteria con un sistema de genético manipulable y cualquier modelo de la infección, proporcionando información valiosa para los estudios preclínicos y desarrollo de fármacos.

Hemos desarrollado un plásmido derivado pMAD32 que puede ofrecer cualquier reportero construcción de fusión en el cromosoma por recombinación homóloga doble cruce (figura 1). Esta construcción permite el análisis cuantitativo de cualquier región reguladora que apoya la producción de la proteína GFP y la señal fluorescente sobre fondo. El plásmido confiere resistencia a la ampicilina (Apr) para el mantenimiento y propagación ...

Se describe aquí es un método para el análisis de expresión génica bacteriana en los tejidos animales a nivel celular. Este método proporciona un recurso para el estudio de la diversidad fenotípica que ocurre dentro de una población bacteriana en respuesta al ambiente de tejido durante una infección.

Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Este método puede revelar patrones espaciales de expresión génica bacteriana y estrategias para la adaptación fisiológica a los microambientes del tejido huésped que se pierden cuando se promedian en toda la población en los tejidos. Con esta técnica se pueden detectar heterogenidades potenciales que deben ser consideradas al identificar nuevas vías bacterianas y proteínas a ser objetivo de antivirulencia o compuestos antibacterianos. Comience por rayar cepas de S.aureus de interés en las placas de agar de sangre de una población de glicerol congelado e incubar las placas a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas para confirmar sus fenotipos hemolíticos basados en su capacidad para linsear glóbulos rojos y formar zonas transparentes claras.Inocular aislados de colonia única de cada cepa en cuatro mililitros de caldo de soja tríptico, o TSB, en tubos de vidrio estériles y rotar los tubos a 37 grados Celsius durante 16 a 24 horas en un rodillo de tubo en un ángulo de aproximadamente 70 grados y 70 rotaciones por minuto. A la mañana siguiente medir la densidad óptica a 600 nanómetros, o OD 600, de los cultivos en un espectrofotómetro y diluir las células a un OD 600 de 0.05 en 25 mililitros de TSB estéril a una relación de entre dos y un volumen en matraces Delong de 125 mililitros. Incubar los cultivos en un baño de agua celsius de 37 grados a 280 rotaciones por minuto y cosechar las células durante la fase exponencial.Pele el Plículo de las células por centrifugación y lavar las células dos veces en un volumen igual de PBS estéril. Luego resuspendir las células en PBS fresco a una por 10 a la octava colonia formando unidades por mililitro de concentración para su posterior inyección en un animal receptor. En el punto final experimental apropiado, cosecha el riñón, el corazón, el hígado, los pulmones y el bazo en tubos de polipropileno de 15 mililitros que contienen 10% de formalina tamponada durante una incubación de 24 a 48 horas en la oscuridad a temperatura ambiente con suave temblor o rotación.Al final de la fijación, incruste los órganos en un medio de congelación de tejido transparente para almacenarlos a menos 80 grados centígrados. Utilice un criostato para adquirir secciones de tejido de 10 micrómetros de espesor y secar las secciones en diapositivas de vidrio cargadas pre-limpiadas individuales durante 20 minutos en la oscuridad antes de aplicar el medio de montaje duro complementado con DAPI. A continuación, aplique los resbalones de cubierta y cure los portaobjetos a temperatura ambiente durante la noche antes de transferir las muestras a un almacenamiento a largo plazo a cuatro grados centígrados.Para identificar lesiones dentro de las muestras, coloque una diapositiva en el escenario de un microscopio confocal de escaneo láser y utilice un objetivo adecuado para visualizar células individuales para adquirir imágenes de las lesiones. Para medir las intensidades de fluorescencia dentro de las imágenes confocales, abra una imagen en ImageJ y ajuste el brillo y el contraste para visualizar correctamente la señal de fluorescencia de la lesión. Defina la región de interés mediante la herramienta de selección de polígonos y añada el ROI al gestor de ROI en la pestaña Editar de ImageJ.Seleccione Editar, luego Selección y, finalmente, Agregar al administrador. A continuación, cambie el nombre del ROI y etiquete la imagen respectiva. Para definir el centroide, abra la pestaña Analizar y seleccione Area, Valor gris medio, Centroide y Límite a umbral.Extraiga el valor de intensidad de fluorescencia centroide o mida la intensidad media de fluorescencia en una lesión dada por unidad de área. Esto se puede lograr utilizando la función de umbral para establecer los límites de fluorescencia inferior y superior según sea necesario. Exporte los datos a un archivo de Excel y prepare una columna que indique la intensidad media de fluorescencia por unidad de área para la periferia y el núcleo.Para calcular las intensidades medias de fluorescencia por unidad de área en la periferia y el núcleo, defina manualmente los límites superior e inferior del umbral. La fluorescencia de fusión staphylococcus aureus thermonucleasa GFP es en promedio casi nueve veces mayor en las células que en las células que en las células que no llevan la fusión del reportero. Del mismo modo, la fluorescencia de fusión de tomate dimerico tándáctico es aproximadamente seis veces mayor que el control de reportero nulo.El patrón de las actividades del reportero se puede confirmar mediante citometría de flujo con homogeneizatos tisulares. Aunque las diferencias de pliegue en la fluorescencia son típicamente más bajas. Las variaciones en las mediciones de fluorescencia pueden deberse a la expresión heterogénea de los reporteros.Por ejemplo, en estas muestras representativas se observó que algunas lesiones expresan uno o ambos de los reporteros dentro de aproximadamente 100 micrómetros de distancia en la misma muestra de tejido. El examen de la actividad del reportero a una resolución de una sola célula en comunidades de abcesas estafilocócicas revela una regulación espacial de la expresión de estafilococo aureus thermonucleasa en abscesos circunscritos con una fuerte tinción DAPI, probablemente asociada con la formación y liberación de trampas extracelulares de neutrófilos. Por ejemplo, se observa una fluorescencia de fusión de la fluorescencia de la RFP estafilococo auresa significativamente mayor en el núcleo interior de la comunidad de abcesas estafilocócicas en comparación con la localización en la periferia.En la misma abcesa, el patrón para la fluorescencia de fusión de tomate dimerico tándúrico parece invertirse. Sin embargo, el patrón de este experimento no fue estadísticamente significativo. La obtención de disecciones crio-integradas intactas es vital para el análisis de la imagen de fluorescencia y debe hacerse cuidadosamente.La clasificación de las células bacterianas para capturar submociones que expresan la fusión en diferentes medidas, junto con el análisis de ARN-Seq podría iluminar los cambios anchos del genoma en el transcriptoma. Tenga cuidado al trabajar con formalina, ya que es un carcinógeno y puede causar irritación de la piel, reacciones alérgicas o daño ocular tras la exposición directa. Generar derivados mutantes de cepas que llevan reporteros fluorescentes de interés puede ayudar a revelar la base genética para los patrones regulatorios espaciales observados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

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