Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70
9 de agosto de 2019
Aquí, presentamos un protocolo para probar la permeabilidad glomerular en ratones usando un trazador no radioactivo altamente sensible. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nefrología sobre el papel de la permeabilidad glomerular en la enfermedad renal. La principal ventaja de esta técnica es que se detectan pequeños y transitorios aumentos de la permeabilidad glomerular mediante el uso de un trazador con plomo fluorescente etiquetado. Después de la anestesia, coloque un catéter urinario en el ratón femenino.
Coloque el ratón en la reclinación dorsal. Apriete la parte inferior del abdomen y encuentre el ostium uretral. Obtener la parte de plástico del catéter de un angiocatéter de 22 G y lubricarlo con gel de xylocaína.
Utilice el dedo índice izquierdo para colocar una tensión cuidadosa en la parte inferior del abdomen e introducir el catéter tres milímetros en el ostium uretral mientras se parale hacia el eje uretral distal. Gire la parte superior del angiocatéter 180 grados manteniendo la punta dentro del ostium uretral y manteniendo el eje de la uretra. Luego, introduzca el catéter siete milímetros más en el ratón para que se coloque dentro de la vejiga.
Coloque un tubo marrón de 1,5 mililitros sobre la parte superior del angiocatéter para recoger la orina. Aplicar un mililitro de 0,9% de cloruro de sodio por vía subcutánea para mejorar la producción de orina. Afeite el cuello del ratón y colóquelo en recumbencia con la cabeza hacia el cirujano.
Hyper extiende la cabeza del ratón con una cinta. Desinfectar el cuello con 70%isopropanol. Usando una pinza y un par de tijeras hacer una incisión de piel de cinco milímetros debajo de la mandíbula.
Corte la piel aproximadamente un centímetro en la dirección del esternón hasta que se alcance el centro del esternón. Usa unas tijeras. Diseccione cuidadosamente la piel al lado derecho del cuello.
Haga una incisión rectangular de la piel a la derecha para exponer el tejido blando del cuello. Tenga cuidado de no dañar la vena yugular. Usa un par de tijeras y una pinza para fijar las solapas de la piel con dos abrazaderas.
Usando la punta de la pinza fina, exponga cuidadosamente la vena yugular mediante una preparación contundente. Si es necesario, retire el tejido con tijeras finas. Evite lesiones en las ramas de las venas.
Colocar y cerrar una ligadura con un hilo de seda en la parte distal de la vena yugular visible que está hacia la cabeza del ratón. Fije el hilo de seda con una cinta para poner tensión en la ligadura. Esto asegura una ligera tensión en la vena yugular.
Preparar una ligadura alrededor de la parte proximal de la vena yugular. Después de eso, llene el catéter con la solución de equilibrio y fusión. Fije el catéter con una cinta adhesiva para que el catéter alinee la vena yugular.
Control de burbujas para evitar la embolia aérea. Levante la vena yugular con pinzas finas en el lugar de inserción. Alinee el tubo paralelo a la vena yugular y perfore la vena yugular apuntando al lumen.
Insertar para aproximadamente dos a cuatro milímetros en paralelo al eje de la vena yugular. Evite cualquier movimiento rápido. Cierre la ligadura para fijar el catéter.
Control de la estanqueidad de la ligadura mediante una visión cuidadosa a través del microscopio. Ponga un hisopo húmedo sobre el lugar de la cirugía. Coloque el manguito de la cola en la parte inferior de la cola del ratón mientras el ratón se encuentra en la reclinación dorsal.
Inicie las mediciones y repítelas diez veces por punto de tiempo. Si las mediciones de la presión arterial no parecen correctas y se producen datos falsos, ajuste la posición del manguito de cola. Antes de la fase de equilibrio, cambie el tubo de recolección urinaria y colóquelo sobre hielo.
Doble un hisopo y colóquelo alrededor del catéter del recipiente pequeño que se introduce en la vena yugular. Coloque una abrazadera sobre el hisopo para abolir el flujo sanguíneo retrógrado o la embolia aérea. Conecte una aguja de 27 G con una jeringa de un mililitro llena con el bolo FITC al final del catéter del vaso pequeño.
Abra la abrazadera y aplique el bolo FITC de 100 microlitrotro. Cierre la abrazadera de nuevo y conecte el catéter más grande con el catéter más pequeño. Vuelva a abrir la abrazadera e inicie la bomba de la jeringa con un caudal de 0,008 mililitros por minuto.
Continúe la perfusión durante 60 minutos. En esta fase, se investigan los fármacos eficaces sobre la selectividad de la perm glomerular. Cambie el tubo urinario del punto de tiempo cero minuto a otro tubo marrón de 1,5 mililitros.
Coloque un hisopo alrededor del catéter del vaso pequeño y desconecte el catéter grande del catéter del vaso pequeño. Llene la jeringa con la solución de fase experimental. Colóquelo en la bomba de la jeringa y deje que la bomba de perfusión funcione para que el catéter grande se llene con la solución de fase experimental.
Vuelva a conectar los catéteres evitando la embolia de aire y vuelva a abrir la abrazadera. Encienda la bomba de la jeringa a un caudal de 0,008 mililitros por minuto. Continúe ejecutando la bomba de jeringa durante 60 minutos y recoja la orina dentro del tubo urinario a partir de entonces.
Coloque el tubo de orina sobre hielo. En este estudio, la exploración por fluorescencia de orina nativa de ratón muestra un pico de 395 nanómetros. La polisurosa FITC 70 a una concentración de 40 microgramos por mililitro en orina de ratón muestra un máximo de fluorescencia a 525 nanómetros.
La orina del ratón no altera la medición de fluorescencia de la polisurosa FITC 70. A la admisión de 525 nanómetros el aumento de las concentraciones de polisuquida FITC 70 muestra un aumento de la intensidad de la fluorescencia. Este método también es capaz de detectar diferencias en la permeabilidad glomerular.
Las columnas blancas representan la polisuquida FITC 70 niveles antes del inicio de la estimulación de la angiotensina II en la fase experimental. Después de dosis durante 60 minutos, la permeabilidad glomerular aumentó en comparación con el grupo de control. la angiotensina II lamina reduce la permeabilidad glomerular.
Los niveles de polisuquida FITC 70 disminuyeron después de 60 minutos adicionales de estimulación de la angiotensina II o 60 minutos de lavado con angiotensina II. El aumento de la permeabilidad glomerular debido a la angiotensina II podría ser bloqueado por un bloqueador de receptores de angiotensina II. La presión arterial monitoreada por el método del manguito de cola no mostró diferencias significativas entre los grupos tratados con control y angiotensina II.
Al intentar este procedimiento es importante evitar la embolia de aire al cambiar las soluciones de perfusión.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para evaluar la permeabilidad glomerular en ratones utilizando un trazador sensible y no radiactivo. Este método permite realizar análisis repetidos de orina con volúmenes mínimos de orina.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Nefrología
- Investigación sobre enfermedades renales
- Evaluación de la función glomerular
Antecedentes
- Comprender la permeabilidad glomerular es fundamental en las enfermedades renales.
- Los métodos actuales pueden no detectar cambios pequeños en la permeabilidad.
- Este protocolo tiene como objetivo mejorar la sensibilidad de detección.
- Los trazadores fluorescentes proporcionan una alternativa no radiactiva para los estudios.
Objetivo del estudio
- Evaluar la permeabilidad glomerular en un modelo murino.
- Evaluar el impacto de pequeños aumentos en la permeabilidad sobre la función renal.
- Proporcionar un método confiable para la investigación en nefrología.
Métodos Utilizados
- Uso de un trazador marcado con un fluoróforo para la detección.
- Administración de anestesia a los ratones.
- Colocación de un catéter urinario en ratones hembra.
- Colocación del ratón en posición decúbito dorsal para el procedimiento.
Resultados principales
- Se pueden detectar aumentos pequeños y transitorios en la permeabilidad glomerular.
- El método permite mediciones repetidas con un volumen mínimo de orina.
- Los trazadores fluorescentes mejoran la sensibilidad del análisis.
- El protocolo es sencillo y reproducible.
Conclusiones
- Este método proporciona una herramienta valiosa para la investigación en nefrología.
- Permite una mejor comprensión de la función glomerular en la salud y la enfermedad.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para obtener mayores conocimientos sobre la patología renal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la detección de pequeños aumentos transitorios en la permeabilidad glomerular mediante un trazador fluorescente no radiactivo, abordando una brecha crítica en el descubrimiento de biomarcadores de enfermedades renales tempranas. Al permitir análisis repetidos de orina con un volumen mínimo de muestra, facilita el monitoreo longitudinal en modelos preclínicos, mejorando la confianza predictiva en la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas para terapias renales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de cambios en la permselectividad glomerular en respuesta a moduladores farmacológicos.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas a través de la medición directa del flujo de trazadores, reduciendo la dependencia de los parámetros indirectos de albuminuria.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras mediante la detección de cambios tempranos en la permeabilidad que podrían predecir resultados patológicos posteriores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para el ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la cribado de compuestos posteriores mediante el establecimiento de métricas de permeabilidad basales.
- Resultado cuantitativo: Genera lecturas basadas en fluorescencia normalizadas a la creatinina, lo que permite mediciones estandarizadas y reproducibles entre estudios.
- Escalabilidad: Facilita el muestreo de alta frecuencia con requisitos bajos de volumen de orina, apoyando diseños de ensayos longitudinales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la disfunción glomerular humana al capturar los cambios de permeabilidad inducidos por la angiotensina II, un mediador fisiopatológico conocido.
- Continuidad traslacional: Conecta las fases de descubrimiento y preclínica al proporcionar una lectura consistente de la permeabilidad durante las fases de intervención y lavado.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Informa los criterios de avance o detención al demostrar la reversibilidad de los cambios de permeabilidad mediante el bloqueo del receptor, lo que apoya la reducción del riesgo mecanicista.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, permitiendo la evaluación basada en hipótesis de la función glomerular antes de la optimización del fármaco candidato y apoyando decisiones de avance basadas en datos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la investigación mecanicista de las vías que afectan la integridad de la barrera glomerular, como la modulación del sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS).
- Selección: Ofrece sistemas listos para ensayos con manejo estandarizado de trazadores y protocolos de detección de fluorescencia.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas y normalizadas de la intensidad de fluorescencia que permiten comparar los estados de permeabilidad entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traductiva: Relaciona los cambios precoces de permeabilidad con la validación preclínica mediante el seguimiento de las respuestas a la angiotensina II y su bloqueo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de pruebas de permeabilidad reutilizable, aplicable a múltiples modelos de enfermedades renales y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en el blanco al detectar cambios sutiles en la permeabilidad en fases tempranas, que pasan desapercibidos para los biomarcadores convencionales.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante procedimientos estandarizados de cateterización, infusión y medición de fluorescencia.
- Valor estratégico: Aumenta la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de compuestos ineficaces, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al identificar compuestos que modulan la permselectividad glomerular con claridad mecanicista.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de acceso vascular murino y cateterización urinaria.
- Depende de un lector de placas con capacidad de fluorescencia para excitación/emisión a 490/525 nm para la detección de FITC.
- Necesita la estandarización entre equipos de los procedimientos de recolección y manejo de orina, así como de la normalización respecto a la creatinina.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar los protocolos entre cepas, sexos o modelos de enfermedad.
- Limitado por la necesidad de prevenir cuidadosamente los émbolos aéreos durante los cambios de solución de infusión, como se indica en los controles del procedimiento.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
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Title
0:28
Preparation Phase Urinary Catheter
1:43
Preparation Phase - Central Venous Catheter
4:16
Blood Pressure Measurement and Equilibration Phase
5:51
Experimental Phase
7:10
Results: Fluorescence Scan, Glomerular Permeability and Blood Pressure
9:00
Conclusion
