Name: Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a medir la permeabilidad glomerular en ratones usando un trazador fluorescente no radioactivo. Este método sensible permite análisis repetidos de orina con volúmenes mínimos para investigación en nefrología.

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Los autores agradecen a Christina Schwandt, Blanka Duvnjak y Nicola Kuhr por su excepcional asistencia técnica y al Dr. Dennis Sohn por su ayuda con el escaneo de fluorescencia. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 a L.C.R. y L.S. El fundero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Las investigaciones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices descritas en la Guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio (Publicación No 85-23 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, revisada en 1996). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las aprobaciones institucionales pertinentes (el gobierno estatal Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] número de referencia 84-02.04.2012.A397).
1. Preparación de instrumentos, soluciones y equipos
<ol><li>Reconstituir FITC-policrorosa 70 con cloruro de sodio estéril al 0,9% (NaCl) a una concentración final de 10 mg/ml (es decir, 100 mg en 10 ml de NaCl).</li>
	<li>Dialyze FITC-policrose 70 solución para eliminar las moléculas FITC libres durante la noche a 4 oC (corte de peso molecular [MWCO] a 10.000). Utilice 1 L de NaCl estéril al 0,9% por 10 ml de FITC-policrorosa 70 bajo agitación constante. Proteger de la luz. Aliquot el dializado FITC-policrorosa 70 y almacenarlo a -20 oC.</li>
	<li>Para la solución FITC-policrorosa 70 bolus, añadir 4 ml de 10 mg/ml de fitC-polisucrosa 70 solución a 996 ml de 0,9% de NaCl (la concentración final de FITC-policrorosa 70: 40 g/ml).</li>
	<li>Para la solución de perfusión de equilibrio, añadir 20 ml de una solución de 10 mg/ml de FITC-polisucrosa 70 a 9,98 ml de NaCl estéril al 0,9% que produzca una concentración final de 20 g/ml.</li>
	<li>Para la solución experimental, añadir fármacos o sustancias a la solución de perfusión (por ejemplo, para angiotensina II [Ang II] [100 ng/kg/min] para un ratón de 25 g, añadir 3 ml de Ang II de una solución de 1 mM).</li>
	<li>Para la cirugía, prepare una afeitadora, dos abrazaderas quirúrgicas, un par de tijeras quirúrgicas, dos pinzas, dos pinzas finas, un par de tijeras finas y hisopos. Prepare dos hilos de seda de 10 cm (4-0 a 6-0) para los procedimientos de ligadura.</li>
	<li>Para la colocación de un catéter venoso central, prepare una jeringa de 10 ml con una aguja de 21 G. Coloque la punta de la aguja en un catéter de 30 cm de largo (con un diámetro interior [ID] de 0,58 mm). Conecte el catéter de 0,58 mm a un catéter de 10 cm (con una identificación de 0,28 mm). Corte la punta del catéter oblicuo más pequeño para crear una punta afilada que se introduce en la vena yugular.</li>
	<li>Preparar la anestesia (es decir, ketamina de anestesia intraperitoneal, 100 mg/kg de peso corporal, y xilazina, 5 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Prepare un angiocatéter de 22 G descartando la aguja y marcando el catéter a 1 cm de la punta. Precalentar la almohadilla de calentamiento a 37 oC.</li>
	<li>Prepare un dispositivo de presión arterial y cambie la membrana de medición de la presión arterial si es necesario.</li>
</ol>2. Fase de preparación
<ol><li>Catéter urinario NOTA: La sección 2.1 sigue el protocolo descrito por Reis et al.7. La Figura 1 y la Figura Suplementaria 1 muestran la colocación de un catéter urinario en ratones hembras.<ol>
<li>Anestetizar el ratón con ketamina/xilazina (ver paso 1.8). Utilice la prueba del dedo del pie para confirmar la anestesia adecuada. Para mantener la anestesia, repita la anestesia (por ejemplo, con la mitad de la dosis) después de 60 min. Se confirma la anestesia adecuada si la prueba de pellizco del dedo del rallado no da lugar a la retirada del reflejo. NOTA: En este protocolo se utilizan ratones FVB hembra.</li>
		<li>Coloque el ratón en la recumbencia dorsal en una almohadilla de calentamiento de 37 oC. Apriete la parte inferior del abdomen y encuentre el ostium uretral (por ejemplo, bajo un microscopio).</li>
		<li>Utilice la parte plástica del catéter de un angiocatéter de 22 G y lubrique con gel de xilocaína. Introducirlo cuidadosamente 3 mm en el ostium uretral mientras se paralece el eje uretral distal (Figura1A).</li>
		<li>Gire la parte superior del angiocatéter 180o manteniendo la punta dentro del ostium uretral y manteniendo el eje de la uretra (Figura1B).</li>
		<li>Introducir el catéter 7 mm más en el ratón para que se coloque dentro de la vejiga (Figura1C). No fuerce el catéter más allá de la resistencia. Corrija la posición del catéter desde el principio si se siente resistencia. Tenga en cuenta que si la posición del catéter urinario es correcta, la orina ya puede aparecer dentro del catéter.</li>
		<li>Coloque un tubo marrón de 1,5 ml sobre la parte superior del angiocatéter para recoger la orina. Aplicar 1 ml de 0,9% De NaCl por vía subcutánea para mejorar la producción de orina.</li>
	</ol></li>
	<li>Catéter venoso central
	<ol>
<li>Afeitar el cuello del ratón y colocarlo en la recumbencia con la cabeza hacia el cirujano. Hiperextender la cabeza del ratón con una cinta.</li>
		<li>Desinfectar el cuello con 70% isopropanol. Haga una pequeña incisión en la piel (5 mm) por debajo de la mandíbula, usando una pinza y un par de tijeras. Cortar la piel aproximadamente 1 cm en la dirección del esternón hasta que se alcance el centro del esternón.</li>
		<li>Disecciona cuidadosamente la piel en el lado derecho del cuello, usando un par de tijeras. Haga una incisión rectangular de la piel en el lado derecho del ratón para exponer el tejido blando del cuello. Usa unas tijeras y una pinza. Fije las aletas de la piel con dos abrazaderas. NOTA: La vena yugular corre a lo largo del lado izquierdo de la glándula tiroides o está ligeramente cubierta por el lóbulo derecho de la glándula tiroides. Después de este paso, use un microscopio para la cirugía.</li>
		<li>Exponer cuidadosamente la vena yugular mediante una preparación contundente, utilizando la punta de la pinza fina. Evite lesiones en las ramas de las venas. NOTA: Puede ser necesario extraer el tejido con tijeras finas. Tenga cuidado al usar tijeras para extraer tejido, ya que aumenta el riesgo de sangrado.</li>
		<li>Coloque y cierre una ligadura con un hilo de seda (4-0 a 6-0) en la parte distal de la vena yugular visible (hacia la cabeza del ratón). Ponga tensión en la ligadura fijando el hilo de seda con una cinta para asegurar una ligera tensión en la vena yugular. Prepare una ligadura alrededor de la parte proximal de la vena yugular.</li>
		<li>Llene el catéter con la solución de perfusión de equilibrio (ver paso 1.4) y fije el catéter con una cinta adhesiva para que el catéter alinee la vena yugular. Control de burbujas para evitar la embolia de aire.</li>
		<li>Levante la vena yugular con pinzas finas en el lugar de inserción (el sitio de inserción es de 1-2 mm proximal de la ligadura). Alinee el tubo paralelo a la vena yugular. Perforar la vena yugular, apuntando hacia el lumen, e insertar para aproximadamente 2-4 mm, en paralelo el eje de la vena yugular. Evite los movimientos rápidos.</li>
		<li>Cierre la ligadura para fijar el catéter. Control de la estanqueidad de la ligadura mediante la visualización cuidadosa a través del microscopio. Ponga un hisopo húmedo sobre el lugar de la cirugía.</li>
	</ol></li>
	<li>Medición de la presión arterial
	<ol>
<li>Coloque el manguito de cola en la parte inferior de la cola del ratón mientras el ratón se acostó en la recumbencia dorsal. Inicie las mediciones y repitalas 10 veces por punto de tiempo. Construir una media a partir de las mediciones.</li>
		<li>Ajuste la posición del manguito de la cola si las mediciones de la presión arterial no parecen correctas y se producen datos falsos.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fase de equilibrio
<ol><li>Cambie el tubo de recolección urinaria antes de que comience la fase de equilibrio y colóquelo en hielo.</li>
	<li>Introducir una jeringa de 10 ml llena de solución de fase de equilibrio FITC (ver paso 1.4) con una aguja de 21 G y el catéter más grande (con un ID de 0,58 mm) y colocarla en la bomba de la jeringa.</li>
	<li>Doble un hisopo y colóquelo alrededor del catéter de pequeño recipiente (con una identificación de 0,28 mm) que se introduce en la vena yugular. Coloca el catéter dentro del hisopo. Coloque una abrazadera sobre el hisopo para abolir el flujo sanguíneo retrógrado o la embolia aérea. Conecte una aguja de 27 G con una jeringa de 1 ml llena con el bolo FITC hasta el extremo del catéter de recipiente pequeño.</li>
	<li>Abra la abrazadera y aplique el bolo FITC (100 l). Cierre la abrazadera de nuevo y conecte el catéter más grande con el catéter más pequeño. Encienda la bomba de jeringa con 0,008 ml/min (0,480 ml/h). Continúe la perfusión durante 60 min.</li>
</ol>4. Fase experimental
NOTA: En esta fase, se puede investigar el efecto de los fármacos sobre la permselectividad glomerular.
<ol><li>Cambie el tubo urinario (punto de tiempo 0 min) a otro tubo marrón de 1,5 ml. Coloque un hisopo alrededor del catéter de recipiente pequeño y cierre una abrazadera como se indica en el paso 3.3.</li>
	<li>Desconecte el catéter grande del catéter de recipiente pequeño. Cambie las jeringas a las soluciones de fase experimental (ver paso 1.5). Deje que la bomba de perfusión funcione de modo que el catéter grande se llene con la solución de equilibrio.</li>
	<li>Vuelva a conectar los catéteres evitando la embolia de aire y vuelva a abrir la abrazadera. Encienda la bomba de jeringa a 0,008 ml/min.</li>
	<li>Continúe ejecutando la bomba de la jeringa durante 60 minutos y recoja la orina dentro del tubo urinario a partir de entonces (orina 60 min). Coloque el tubo de orina en hielo.</li>
	<li>Sacrificar el ratón por luxación cervical durante la anestesia. Antes de la eliminación, el ratón se observa durante 5 minutos para asegurarse de que está muerto.</li>
</ol>5. Análisis de orina
<ol><li>
Medición de fluorescencia
	<ol>
<li>Descongelar la piscina urinaria y diluirla 1:10 con solución salina con fosfato tampón (PBS). NOTA: La piscina urinaria es un charco de orina que se ha recogido de ratones sanos en una colección de orina de 12-24 h en una jaula metabólica.</li>
		<li>Preparar normas para la medición de fluorescencia. Tome 10 tubos marrones de 1,5 ml y etiquételos para blanco (1:10 piscina de orina diluida) y las siguientes concentraciones de FITC-policrorosa 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 g/ml).</li>
		<li>Pipet 246 l de piscina de orina diluida en un tubo marrón de 1,5 ml y añadir 4 l de la concentración de material FITC-polisurosa 70 (ver paso 1.1) para obtener una concentración final de 160 g/ml FITC-policrorosa 70. Pipet 100 l de la piscina de orina diluida en todos los demás tubos.</li>
		<li>Diluir 1:2 pipeteando 100 l del tubo de 160 g/ml FITC-polisucrosa 70 en el tubo de 80 g/ml y continúe con las otras concentraciones. Asegurar la mezcla adecuada de las concentraciones diluidas (por ejemplo, vórtice el tubo antes de continuar).</li>
		<li>Diluir las muestras de orina del ratón (0 min, 60 min) 1:10 con piscina urinaria diluida.</li>
		<li>Pipetear 5 l de cada concentración estándar de FITC-policrorosa 70 y de las muestras de orina del ratón como triplicados en una placa negra de 384 pocillos. Centrifugar la placa a 1.000 x g durante 15 s para evitar burbujas.</li>
		<li>Analice la placa de 384 pocillos en un lector de placas. Realizar excitación a 496 nm y medir la fluorescencia a 525 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medición de creatinina
	<ol>
<li>Siga las instrucciones del fabricante. En resumen, prepare las normas de creatinina diluyendo 10 ml de la solución estándar de creatinina de 100 mM con 990 ml de tampón de ensayo de creatinina para preparar una solución estándar de 1 mM.</li>
		<li>Agregue 0, 2, 4, 6, 8 y 10 l de la solución estándar de creatinina de 1 mM en una placa de 96 pocillos para generar 0, 2, 4, 6, 8 y 10 nmol/estándares de pozo, respectivamente. Añadir tampón de ensayo de creatinina a cada pozo para llevar el volumen a 50 sL.</li>
		<li>Preparar las mezclas de reacción añadiendo 42–44 l de tampón de ensayo de creatinina, 2 s de creatinasa, 2 ml de creatininasa, 2 l de mezcla enzimática de creatinina y 2 s de sonda de creatinina. Para el espacio en blanco, utilice 44 s de tampón de ensayo de creatinina, 2 ml de creatinasa, 2 ml de mezcla enzimática de creatinina y 1–2 l de sonda de creatinina.</li>
		<li>Añadir 50 l de la mezcla de reacción apropiada a cada pocto en la placa de 96 pocillos e incubarla durante 60 minutos en una coctelera horizontal a 37 oC. Proteja la placa de la luz durante la incubación. Mida la absorbancia a 570 nm en un lector de placas.</li>
		<li>Calcule las concentraciones de creatinina restando el valor en blanco de todas las lecturas. El resultado tendrá la unidad nanomoles/microlitro. Multiplique la concentración de creatinina por el peso molecular de la creatinina (113,12 ng/nmol) para recibir la unidad nanogramos/microlitro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Calcule la concentración de orina FITC-policrorosa 70 a partir de la curva estándar.</li>
	<li>Hacer referencia a las concentraciones de orina FITC-policrorosa 70 a las concentraciones de creatinina en la muestra de orina representativa.</li>
	<li>Hacer referencia a la orina muestras de 60 minutos a la orina 0 min muestras de controles y ratones tratados.</li>
</ol>

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<li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li>
<li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction%3A+effects+of+Tempol%2C+NOS%2C+RhoA%2C+and+Rac-1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li>
<li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li>
<li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li>
<li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado permite al investigador probar la permeabilidad glomerular en ratones de una manera muy sensible utilizando un trazador. Con este método, los aumentos a corto plazo en la permeabilidad glomerular se pueden diagnosticar utilizando sólo pequeñas cantidades de orina. Los pasos más críticos para dominar con éxito esta técnica son 1) el desarrollo de la experiencia manual en cirugía de ratón, especialmente en la cannulación de una vena central, 2) la colocación del catéter urinario sin dañar la mucosa, y ...

Los defectos funcionales o estructurales dentro de la barrera de filtración glomerular aumentan la permeabilidad glomerular a la albúmina, lo que resulta en la detección de albúmina en la orina (albuminuria). La albúmina predice el resultado cardiovascular y es un marcador importante para la lesión glomerular1. Incluso los niveles bajos de albúmina, que se encuentran dentro del rango normal, se asocian con un aumento del riesgo cardiovascular1.
En condiciones fisiológicas, la albúmina se filtra a travésdel glomérulo y se reabsorbe casi por completo en el sistema tubular 2,3. En ratones, la detección de albúmina en la orina suele realizarse mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de albúmina (ELISA) a partir de las 24 horas de recolección de orina. Si se utiliza orina de una colección de orina de 24 horas o orina manchada, se pueden perder pequeñas diferencias en las concentraciones de albúmina debido a problemas de sensibilidad al ensayo. La mayoría de los investigadores, por lo tanto, utilizan modelos animales en los que la albuminuria es inducida por una lesión renal robusta debido a toxinas, medicamentos y cirugía renal.
Por lo tanto, la búsqueda de un método sensible para detectar pequeños y transitorios cambios en la permeabilidad glomerular es muy importante para el campo. Rippe et al. han presentado un modelo de rata para probar la permeabilidad glomerular mediante la aplicación de un trazador con etiqueta fluorescente, a saber, FITC-polisucrose 70 (es decir, FITC-Ficoll 70), en el tamaño de la albúmina4. La aplicación de trazador permite la prueba de cambios a corto plazo en la permeabilidad glomerular (en cuestión de minutos) y es muy sensible4. Dos estudios han utilizado elmétodo trazador en ratones 5,6. A pesar de sus beneficios, este método, por desgracia, tiene desventajas: es técnicamente muy complejo, radiactivo e invasivo. El análisis posterior de la orina sólo se realiza mediante el uso de filtración de gel o tamaño-exclusión HPLC5,6.
Dentro de este artículo, presentamos un método alternativo, sensible, no radioactivo y rápido para medir la permeabilidad glomerular en ratones utilizando fluorescentemente etiquetado FITC-policrorosa 70. Mediante la introducción de un catéter transuretral, la recolección de orina es menos invasiva que la punción vesical, la uretrotomía y la aplicación de catéter suprapúbico, y permite la recolección de orina al menos cada 30 minutos. El análisis de orina se realiza a partir de pequeñas cantidades (5 ol) utilizando un lector de placas fluorescentes. Las concentraciones de trazador en la orina se normalizan a las concentraciones de creatinina en la orina mediante un ensayo de creatinina enzimática.
Por lo tanto, este novedoso método ofrece una herramienta sensible para estudiar lesiones glomerulares tempranas con mayor permeabilidad glomerular.

<table><tbody><tr><td>Motic SMZ168 BL</td><td>Microscopio</td><td>de SMZ168BL</td><td>Motic</td> para cirugía</tr><tr><td>con ratones KL1500LCD</td><td>Microscopía de Pulch y Lorenz</td><td>150500</td><td>luz para cirugía con ratones</td></tr><tr><td>Microfederschere</td><td>Braun, Aesculap</td><td>FD100R</td><td>tijeras finas</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BC210R</td><td>para corte de cuello</td></tr><tr><td>Anatomische Pinzette</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BD215R</td><td>para cirugía&nbsp;</td></tr><tr><td>Pr&auml; parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>para cirugía&nbsp;</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner IC108000</td> hilo de <td></td><td>seda</td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td><td>Anestesia</td> <td>Medistar</td><td></td></tr><tr><td>Rompun (xilacina) 2%</td><td>Anestesia</td> <td>Bayer</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de diámetro interior fino 0,28 mm de diámetro exterior 0,61 mm</td><td>Catéter Portex</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Diámetro interior del tubo de polietileno de diámetro fino 0,58 mm de diámetro exterior 0,96 mm</td><td>Catéter Portex</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Aparato Harvard 11 Plus</td><td>Aparato Harvard</td><td>70-2209</td><td>bomba de jeringa</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381823</td><td>&nbsp; catéter urinario</td></tr><tr><td>detector multimodo DTX 880</td><td>Beckman Coulter</td><td>lector de placas</td>placa de microtitulación <td></td></tr><tr>de<td>384 pocillos</td><td>Nunc</td><td>262260</td><td>platte de 384 pocillos</td></tr><tr><td>kit de ensayo de creatinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK080</td><td>para medir la concentración de creatinina</td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos</td><td>Nunc</td><td>260836</td><td>para ensayo de creatinina&nbsp;</td></tr><tr><td>Polisucrosa marcada con FITC 70</td><td>TBD Consultancy</td><td>FP70</td><td>FITC-ficoll</td></tr><tr><td>Angiotensina II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td>utilizada para probar la permeabilidad glomerular</td></tr><tr><td>BP-98A</td><td>Softron</td><td></td><td>para la medición de la presión arterial</td></tr><tr><td>OTS 40.3040</td><td>Medite</td><td>01-4005-00</td> placa <td>calefactora para cirugía con ratones</td></tr><tr><td>Instillagel 6mL</td><td>Farco-Pharma GmbH</td><td></td><td>para catéter urinario</td></tr><tr><td>Exacta</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>afeitadora</td></tr></tbody></table>

medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

La pérdida de albúmina en la orina (albuminuria) predice el resultado cardiovascular. En condiciones fisiológicas, pequeñas cantidades de albúmina son filtradas por el glomérulo y reabsorbidas en el sistema tubular hasta que se alcanza el límite de absorción. Los primeros aumentos en la filtración patológica de albúmina pueden, por lo tanto, perderse mediante el análisis de la albúmina. Por lo tanto, el uso de trazadores para probar la permselectividad glomerular parece ventajoso. El trazador fluorescentemente etiquetado isotiocianato de fluoresceína (FITC)-polisucrosa (es decir, FITC-Ficoll), se puede utilizar para estudiar la permselectividad glomerular. Las moléculas FITC-polisucrosa son filtradas libremente por el glomérulo pero no reabsorbidas en el sistema tubular. En ratones y ratas, FITC-policrorosa se ha investigado en modelos de permeabilidad glomerular mediante el uso de procedimientos técnicamente complejos (es decir, mediciones radiactivas, cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC], filtración de gel). Hemos modificado y facilitado un protocolo basado en trazador de policrorosa FITC para probar aumentos tempranos y pequeños en la permeabilidad glomerular a FITC-policrorosa 70 (tamaño de la albúmina) en ratones. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina (5 l). Este protocolo contiene información sobre cómo se aplica por vía intravenosa el trazador FITC-policrorosa 70 y la orina se recoge a través de un simple catéter urinario. La orina se analiza a través de un lector de placas de fluorescencia y se normaliza a un marcador de concentración de orina (creatinina), evitando así procedimientos técnicamente complejos.

Como se muestra en la Figura2, el método para probar la permeabilidad glomerular en ratones se construye en tres fases. La primera fase se denomina fase de preparación, en la que se colocan un catéter urinario y un catéter venoso central. La segunda fase se denomina fase de equilibrio, comenzando con una inyección intravenosa en bolo de FITC-policrorosa 70 y seguida de la perfusión continua de FITC-policrorosa 70 durante 60 min. La última fase se denomina fas...

Aquí, presentamos un protocolo para probar la permeabilidad glomerular en ratones usando un trazador no radioactivo altamente sensible. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina.

Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nefrología sobre el papel de la permeabilidad glomerular en la enfermedad renal. La principal ventaja de esta técnica es que se detectan pequeños y transitorios aumentos de la permeabilidad glomerular mediante el uso de un trazador con plomo fluorescente etiquetado. Después de la anestesia, coloque un catéter urinario en el ratón femenino.Coloque el ratón en la reclinación dorsal. Apriete la parte inferior del abdomen y encuentre el ostium uretral. Obtener la parte de plástico del catéter de un angiocatéter de 22 G y lubricarlo con gel de xylocaína.Utilice el dedo índice izquierdo para colocar una tensión cuidadosa en la parte inferior del abdomen e introducir el catéter tres milímetros en el ostium uretral mientras se parale hacia el eje uretral distal. Gire la parte superior del angiocatéter 180 grados manteniendo la punta dentro del ostium uretral y manteniendo el eje de la uretra. Luego, introduzca el catéter siete milímetros más en el ratón para que se coloque dentro de la vejiga.Coloque un tubo marrón de 1,5 mililitros sobre la parte superior del angiocatéter para recoger la orina. Aplicar un mililitro de 0,9% de cloruro de sodio por vía subcutánea para mejorar la producción de orina. Afeite el cuello del ratón y colóquelo en recumbencia con la cabeza hacia el cirujano.Hyper extiende la cabeza del ratón con una cinta. Desinfectar el cuello con 70%isopropanol. Usando una pinza y un par de tijeras hacer una incisión de piel de cinco milímetros debajo de la mandíbula.Corte la piel aproximadamente un centímetro en la dirección del esternón hasta que se alcance el centro del esternón. Usa unas tijeras. Diseccione cuidadosamente la piel al lado derecho del cuello.Haga una incisión rectangular de la piel a la derecha para exponer el tejido blando del cuello. Tenga cuidado de no dañar la vena yugular. Usa un par de tijeras y una pinza para fijar las solapas de la piel con dos abrazaderas.Usando la punta de la pinza fina, exponga cuidadosamente la vena yugular mediante una preparación contundente. Si es necesario, retire el tejido con tijeras finas. Evite lesiones en las ramas de las venas.Colocar y cerrar una ligadura con un hilo de seda en la parte distal de la vena yugular visible que está hacia la cabeza del ratón. Fije el hilo de seda con una cinta para poner tensión en la ligadura. Esto asegura una ligera tensión en la vena yugular.Preparar una ligadura alrededor de la parte proximal de la vena yugular. Después de eso, llene el catéter con la solución de equilibrio y fusión. Fije el catéter con una cinta adhesiva para que el catéter alinee la vena yugular.Control de burbujas para evitar la embolia aérea. Levante la vena yugular con pinzas finas en el lugar de inserción. Alinee el tubo paralelo a la vena yugular y perfore la vena yugular apuntando al lumen.Insertar para aproximadamente dos a cuatro milímetros en paralelo al eje de la vena yugular. Evite cualquier movimiento rápido. Cierre la ligadura para fijar el catéter.Control de la estanqueidad de la ligadura mediante una visión cuidadosa a través del microscopio. Ponga un hisopo húmedo sobre el lugar de la cirugía. Coloque el manguito de la cola en la parte inferior de la cola del ratón mientras el ratón se encuentra en la reclinación dorsal.Inicie las mediciones y repítelas diez veces por punto de tiempo. Si las mediciones de la presión arterial no parecen correctas y se producen datos falsos, ajuste la posición del manguito de cola. Antes de la fase de equilibrio, cambie el tubo de recolección urinaria y colóquelo sobre hielo.Doble un hisopo y colóquelo alrededor del catéter del recipiente pequeño que se introduce en la vena yugular. Coloque una abrazadera sobre el hisopo para abolir el flujo sanguíneo retrógrado o la embolia aérea. Conecte una aguja de 27 G con una jeringa de un mililitro llena con el bolo FITC al final del catéter del vaso pequeño.Abra la abrazadera y aplique el bolo FITC de 100 microlitrotro. Cierre la abrazadera de nuevo y conecte el catéter más grande con el catéter más pequeño. Vuelva a abrir la abrazadera e inicie la bomba de la jeringa con un caudal de 0,008 mililitros por minuto.Continúe la perfusión durante 60 minutos. En esta fase, se investigan los fármacos eficaces sobre la selectividad de la perm glomerular. Cambie el tubo urinario del punto de tiempo cero minuto a otro tubo marrón de 1,5 mililitros.Coloque un hisopo alrededor del catéter del vaso pequeño y desconecte el catéter grande del catéter del vaso pequeño. Llene la jeringa con la solución de fase experimental. Colóquelo en la bomba de la jeringa y deje que la bomba de perfusión funcione para que el catéter grande se llene con la solución de fase experimental.Vuelva a conectar los catéteres evitando la embolia de aire y vuelva a abrir la abrazadera. Encienda la bomba de la jeringa a un caudal de 0,008 mililitros por minuto. Continúe ejecutando la bomba de jeringa durante 60 minutos y recoja la orina dentro del tubo urinario a partir de entonces.Coloque el tubo de orina sobre hielo. En este estudio, la exploración por fluorescencia de orina nativa de ratón muestra un pico de 395 nanómetros. La polisurosa FITC 70 a una concentración de 40 microgramos por mililitro en orina de ratón muestra un máximo de fluorescencia a 525 nanómetros.La orina del ratón no altera la medición de fluorescencia de la polisurosa FITC 70. A la admisión de 525 nanómetros el aumento de las concentraciones de polisuquida FITC 70 muestra un aumento de la intensidad de la fluorescencia. Este método también es capaz de detectar diferencias en la permeabilidad glomerular.Las columnas blancas representan la polisuquida FITC 70 niveles antes del inicio de la estimulación de la angiotensina II en la fase experimental. Después de dosis durante 60 minutos, la permeabilidad glomerular aumentó en comparación con el grupo de control. la angiotensina II lamina reduce la permeabilidad glomerular.Los niveles de polisuquida FITC 70 disminuyeron después de 60 minutos adicionales de estimulación de la angiotensina II o 60 minutos de lavado con angiotensina II. El aumento de la permeabilidad glomerular debido a la angiotensina II podría ser bloqueado por un bloqueador de receptores de angiotensina II. La presión arterial monitoreada por el método del manguito de cola no mostró diferencias significativas entre los grupos tratados con control y angiotensina II.Al intentar este procedimiento es importante evitar la embolia de aire al cambiar las soluciones de perfusión.

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Research

Investigación

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Medicine

Medicina

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