Método de empalamiento de microelectrodos para registrar el potencial de la membrana a partir de una arteria cerebral media cannulada

Este protocolo se puede utilizar para medir el potencial de membrana de los vasos sanguíneos normales y enfermos y para evaluar los agentes farmacológicos que modulan el potencial de la membrana, el tono vascular y el flujo sanguíneo. Los potenciales de membrana generados a partir de esta técnica están cerca del rango fisiológico ya que los músculos lisos vasculares dentro de un recipiente están en un sincitio. Antes de comenzar el procedimiento, coloque un amplificador de electrómetro diferencial de doble canal cerca de la cámara del recipiente en la ubicación deseada.

Utilice un cable BNC-BNC para conectar la salida del canal de amplificador A o B a la entrada de canal del digitalizador. Monte la sonda en el micromanipulador y gire el micromaniprógrafo hacia el microscopio y el miógrafo en una mesa libre de vibraciones. Coloque las perillas y los interruptores en la parte delantera del amplificador en las posiciones adecuadas para el experimento, como se describe en el manual.

A continuación, conecte el suelo del baño al suelo del circuito del amplificador con un electrodo adecuado y asegúrese de que la jaula esté conectada a tierra al chasis del amplificador. Para preparar los microelectrodos de vidrio de borosilicato, utilice un tirador estándar para lograr un cónico corto, gradual, de ocho a 10 milímetros con un diámetro inferior a un micrómetro, en bucle dos veces para mayores resistencias y puntas más pequeñas. Utilice una jeringa de microfibra para llenar el microelectrodo con cloruro de potasio de tres molares, retrayendo lentamente el émbolo durante la inyección para permitir espacio para que el líquido se llene y para evitar la formación de burbujas dentro del microelectrodo.

Coloque el microelectrodo completamente cargado en el soporte del microelectrodo y empuje cuidadosamente pero firmemente el vástago del electrodo en el soporte a través del orificio perforado. Retire cualquier exceso de líquido con un tejido de laboratorio y conecte el conjunto del soporte del electrodo a la sonda del amplificador. Realice una prueba de electrodo para medir la resistencia del electrodo.

A continuación, abra el software de grabación, asigne un nombre al archivo y guarde el archivo para su análisis futuro. A continuación, enjuague la cámara de miograma con agua destilada varias veces antes de cargar la cámara con cinco mililitros de solución fisiológica de sal normal, o PSS. Usando una jeringa de cinco o 10 mililitros, llene las cánulas de vidrio y el tubo adjunto con PSS normal filtrado sin introducir ninguna burbuja de aire, y use fórceps contundentes para hacer un medio nudo en dos suturas de nylon monofilamento 10-0.

Luego, usando fórceps de disección bajo un microscopio de disección, coloque los nudos de sutura parcialmente cerrados en ambas cánulas ligeramente lejos de las puntas. Para el aislamiento de la arteria cerebral media, utilice tijeras y fórceps de resorte para identificar y diseccionar un segmento no ramificado de la arteria cerebral media, con un diámetro interno de 100 a 200 mifómetros, del cerebro de rata. Usa fórceps finos para montar la arteria cerebral media en las cánulas de vidrio, y aprieta las suturas para asegurar la arteria a la cánula.

Cierre la cánula distal para que no haya flujo dentro de la arteria y conecte la pipeta de entrada a un reservorio de PSS. Visualice la arteria cerebral media canulada utilizando una cámara de dispositivo acoplada a carga montada en un microscopio invertido y un software de imágenes. Establezca la longitud axial del MCA en una longitud aproximada de tal manera que no parezca rígida ni flácida.

Equilibre la solución de baño con 95%oxígeno y 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Sumerja el suelo del amplificador en el PSS del miógrafo. Iluminar la cámara del recipiente y visualizar la punta del microelectrodo en la solución de baño a través del microscopio.

Usando el micromanipulador, mueva la punta del microelectrodo cerca de la pared externa del vaso sanguíneo y comience la grabación. Mueva lentamente la punta del microelectrodo hacia el recipiente, apuntando hacia el centro del vaso. Cuando la punta se acerque mucho al recipiente, avance el electrodo hacia adelante en un movimiento rápido para empalar la membrana del músculo.

Una vez que la membrana ha sido penetrada, se pueden observar cambios en el potencial de la membrana. No toque el micromaniprógrafo una vez que la membrana haya sido empalada. Cuando se hayan registrado los cambios potenciales de membrana, utilice el manipulador para eliminar el microelectrodo en un movimiento rápido y detenga la grabación antes de guardar los archivos de datos.

El empalamiento se considera exitoso cuando hay una rápida desviación a valores negativos, el potencial de membrana es estable durante un mínimo de 30 segundos, y el voltaje vuelve abruptamente a cero milivoltios al retirar el electrodo. Después de un empalamiento exitoso y la estabilización potencial de membrana, los medicamentos de interés se pueden perfunden en el baño y se pueden registrar cambios en el potencial de la membrana. En este experimento representativo, la perfusión con cloruro de potasio despolarizó la membrana en aproximadamente seis milivoltios, mientras que la perfusión con un activador dependiente del calcio de grandes canales de potasio activados por calcio de conductividad hiperpolarizó la membrana en casi cuatro milivoltios.

Lo más importante a recordar es tirar de microelectrodos altamente resistentes que tienen un cónico corto y gradual con un diámetro inferior a un micrómetro.