Name: Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a evaluar parámetros de neuroplasticidad ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión y transducción in utero en cerebro y médula espinal de ratón. Este método ofrece imágenes de alta resolución con potencial terapéutico translacional.

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Los autores agradecen a los colegas de la instalación animal en la Facultad de medicina, Universidad del Ruhr de Bochum, para el cuidado de sus animales y apoyo.

Todos los procedimientos sobre temas animales han sido aprobados por los comités institucionales de ética animal de los Estados federales de Hamburgo y Nordrhein-Westfalen, Alemania.  Utilizar instrumentos estériles, guantes y abrigos asépticas a lo largo de todo el procedimiento quirúrgico.
1. en la transducción de útero
<ol><li>Preparar virus adeno-asociado tipo 1 (AAV1) codificación para el destino deseado (4 x 1011 viral partículas/μl de AAV1) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4. Añadir 0,1 mg/μl verde Fast Green y mantener la mezcla AAV1-Fast-Green a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar una punta capilar fina con la forma deseada (8 mm de largo, con un diámetro externo de 80 μm y un interior diámetro de 50 μm), usando un extractor de micropipeta (configuración: presión = 500, calor = 700, tire = 0, velocidad = 80, tiempo = 200, vea el tabla de materiales < / c1 >). Romper la punta del tubo capilar para que sea 4-5 mm.</li>
	<li>Montar un tubo aspirador (44 cm x 0,7 cm) con la punta del capilar y Aspire 15 μl de la mezcla de AAV1-Fast-Green en el capilar.</li>
	<li>Mantener los animales sujetos a una temperatura corporal fisiológica constante de 37 ° C durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Coloque un embarazada ratón C57Bl/6 (día embrionario 14.5) en la cámara de preincubación y anestesiar el ratón con gaseosa 4% isoflurano (con una tasa de flujo volumétrico de aire de 0.6-0.8 L/min).</li>
	<li>Inyectar por vía subcutánea, buprenorfina (0.1 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Coloque el ratón anestesiado en la placa quirúrgica precalentada (37 ° C).</li>
	<li>Cubrir los ojos con un lubricante.</li>
	<li>Ajuste el ratón con la máscara de la anestesia (isoflurano gaseosa de 1,5% a una tasa de flujo volumétrico de aire de 0.6-0.8 L/min) en la placa quirúrgica y afeitado de la región de la piel abdominal. Limpie la región depilada con 3 X 75% etanol y luego con solución de betadine. Nota: Controlar continuamente el comportamiento de la respiración del ratón anestesiado. Ajustar la concentración del gas isoflurano según el patrón de inhalación-exhalación del ratón.</li>
	<li>Comprobar la ausencia del reflejo plantar apretando las falanges traseras de la pata del ratón.</li>
	<li>Abrir la cavidad abdominal, sujetando la piel con pinza de iris aserrado curvo (10 cm) y cortar la piel a lo largo de la linea mediana con tijeras rectas de carburo de tungsteno (10 cm) y luego, sujetando la pared peritoneal con recta Pinzas Dumont (12 cm, 0,2 mm x 0.12 mm) y tijeras de corte de la pared a lo largo de la linea alba con recta Vanna (8 cm).</li>
	<li>Coloque un pedazo de la película de parafina fenestrados en la abertura abdominal y fijar la película en ambos extremos con pinzas hemostáticas mosquito micro (12,5 cm, curvado).</li>
	<li>Exponga los cuernos uterinos con a cuchara-como el dispositivo para evitar daños a los embriones dentro de los cuernos uterinos. Gotear algunas gotas de PBS (37 ° C) en los cuernos uterinos e inspeccione los embriones por daños o malformaciones en el saco uterino.</li>
	<li>Documento el orden y la posición de los embriones en los cuernos uterinos. Girar los embriones con cuidado dentro del saco uterino hasta la posición deseada para la inyección.</li>
	<li>Inyectar 1-2 μl de la mezcla de AAV1-Fast-Green por inspeccionar visualmente el sitio de inyección (por ejemplo, ventrículos cerebrales) y la penetración de tinte bajo un estereomicroscopio.</li>
	<li>Documentar los embriones inyectados y coloque los cuernos uterinos con los embriones inyectados en la cavidad abdominal.</li>
	<li>Gotear algunas gotas de PBS (37 ° C) en la cavidad abdominal. Cerrar la cavidad suturando la pared peritoneal (uso poliamida 6-0-tamaño de las suturas) y la piel (uso poliamida 3-0-tamaño de las suturas), uso de pinzas hemostáticas de mosquito de Halsted (12,5 cm, curvado). Como alternativa, utilizar un patrón interrumpido simple o grapas/sutura de acero inoxidable para cerrar la cavidad abdominal y la piel.</li>
</ol>2. Telemacrophotography de tejidos aislados
<ol><li>
Preparación de tampones
	<ol>
<li>Preparar el tampón de Sörensen (1 L) por disolución 14,95 g de Na2HPO4 y 2,18 g de KH2PO4 en 1 L de agua destilada con agitación a 200 rpm. Para perfusión de cachorros gestación o cachorros en el post-natal periodos de tiempo, use un tamaño apropiado de agujas para inyección intragástrica o abdominal y asegúrese de que la concentración de la anestesia de pentobarbital de sodio terminal no supera los 180 mg / kg de peso corporal.</li>
		<li>Preparar solución de fijación de Mugnaini (5 L) al calentar 500 mL de agua destilada a 75 ° C y añadir 50 g de polvo paraformaldehido con agitación a 200 rpm, añadir 200 μL de 5 N NaOH, añadir 1.500 mL de tampón de Sörensen, 1.750 mL de agua destilada y 500 mL de glutaraldehído al 25%. Llene hasta 5.000 mL con agua destilada. Utilice este búfer final para perfusión. Nota: Preparar la solución de fijación de Mugnaini bajo el capó, usar gafas de protección y evitar humos. Añadir azul de metileno (0.05 g/L) para una mejor visualización de la perfusión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento de perfusión y de tejido de ratón
	<ol>
<li>Transcardially perfusión los ratones embarazados que llevan los embriones transduced (en el caso de estudios de embriones) o los pubs transduced nacidos a la edad deseada (por ejemplo, día postnatal 24) según procedimientos estándar6,7, 11,12,13,14,15,16,17, utilizando pentobarbital sódico intraperitoneal de terminal anestesia (200 mg/kg de peso corporal).</li>
		<li>Inyectar a lo ratones transcardially con solución de heparina (500 U) utilizando un 26 G, 1 aguja y, antes de la fijación, infundir los ratones transcardially con 10 mL de PBS para eliminar la sangre del cuerpo y ellos perfusión transcardially con 30 mL de 40 º C precalentado Mugnaini solución de fijación. Nota: Para los ratones adultos, realizar una alternativa perfusión retrógrada a través de la aorta abdominal14.</li>
		<li>Aislar el tejido perfundido de interés (por ejemplo, todo el cerebro o la médula espinal) y postfix el tejido en menos de 10 mL de solución de fijación de Mugnaini por otro 24 h a 4 ° C.</li>
		<li>Lavar el tejido en 10 mL de PBS durante 3 horas a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incrustación en agarosa, además de documentación y seccionamiento
	<ol>
<li>Ajustar el tejido aislado (por ejemplo, todo el cerebro) en un marco especial con un reproducible seccionamiento ángulo8,9,10. Como alternativa, utilice un vibratome con un espesor de corte ajustable.</li>
		<li>Coloque el tejido nervioso en el marco, ajustar el tejido para telemacrography y documentar las coordenadas.</li>
		<li>Preparar el medio de inclusión de agarosa bajo punto de fusión de 3%: agregar 3 g de agarosa en 100 mL de tampón de Sörensen y calentar la mezcla en un baño de agua a 90 ° C.</li>
		<li>Verter la agarosa al 3% (30 ° C) en el marco que contiene el tejido. Cubrir el marco con un bloque de metal caliente y esperar hasta que se endurece. Durante el endurecimiento, utilice dispositivos de telemacrographic para el tejido embebido y sus coordenadas en el marco de la imagen.</li>
		<li>Transferir el tejido embebido en agarosa en un marco con boquetes de corte correspondientes a las coordenadas del primer fotograma.</li>
		<li>Cortar el tejido embebido en secciones de espesor deseado (por ejemplo, 1.5 mm) con un dispositivo con una navaja delgada y vibrante (véase Tabla de materiales). Nota: Para mejorar el deslizamiento de la hoja de afeitar, vierta unas gotas de glicerina sobre el tejido embebido.</li>
		<li>Imagen de cada sección de tejido en PBS y recoger las imágenes en una carpeta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación del tejido aislado para microscopía electrónica de transmisión
Nota: Realizar todos los otros pasos de incubación en platos de vidrio con tapas herméticamente con cierre en una plataforma de agitación bajo el capó.
<ol><li>Lávese las secciones de tejido de 2 x 30 min en PBS. Incubar las secciones en solución acuosa el tetróxido de osmio al 2% (OsO4) por 2 h a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: El tetróxido de osmio es tóxico y puede ser dañino cuando entra en contacto con la piel.</li>
	<li>Lávese las secciones osmicated de 2 x 30 min en PBS.</li>
	<li>Incubar las secciones en etanol al 30%, 50% y 70% a temperatura ambiente durante 10-15 min (opcional: incubar en etanol al 70% a 4 ° C durante la noche).</li>
	<li>Imagen de las muestras osmicated en etanol al 70% en RGB LED luz8,9,10 (2 x 15 W) aplicadas a la muestra de la izquierda y derecha en un ángulo de 45 °. Platos de uso negro y un fondo negro opaco para reducir al mínimo la dispersión y la reflexión de la luz durante la iluminación. PRECAUCIÓN: No permita que la sección se sequen durante proyección de imagen.</li>
	<li>Crear un atlas de la sección con coordenadas por la recogida de imágenes en serie en una carpeta.</li>
	<li>Incubar a las muestras en etanol al 100% (2 x 30 min) y óxido de propileno 100% (2 x 30 minutos) a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: No permita que las secciones se sequen mientras se cambian las soluciones.</li>
	<li>Mezclar 260 mL de resina con 240 mL de anhídrido dodecenylsuccinic en un recipiente de vidrio, agitando suavemente con una barra de vidrio. Revise periódicamente la inhomogeneidad, burbujas y manchas. Muy suavemente, agitar a mano durante al menos 45 minutos.</li>
	<li>Preparar óxido de propileno/resina en una proporción de 1:2 y 1:1 y añadir acelerador de 3% (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol).</li>
	<li>Incubar el tejido en el 1:2 incrustación solución de paso 3.8 por 2 h y luego en la solución de empotrar de 1:1 del paso 3.8 por 2 h a temperatura ambiente en un disco giratorio.</li>
	<li>Coloque el tejido en platos planos de polipropileno, cubrir el tejido con resina fresca que contiene 3% acelerador y curar el tejido embebido en 65-85 ° C durante 12-24 h.</li>
	<li>Enfriar el tejido embebido a temperatura ambiente y extraer a los especímenes incrustados de resina de los platos de polipropileno.</li>
</ol>4. selección de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales para análisis cuantitativo
<ol><li>
Mapeo del área de interés
	<ol>
<li>Elija un área de interés (por ejemplo, el hipocampo o el cerebelo) y localizar el área en el atlas de sección seleccionando la imagen del atlas (paso 3.5) que contiene esta zona.</li>
		<li>Esboce las fronteras del área de interés en la imagen de la sección y encontrar/superponer estas fronteras de la región en la muestra de resina.</li>
		<li>Scratch-marca las fronteras de la zona de interés (por ejemplo, el hipocampo o el cerebelo) en la muestra de resina, con un calibre de aguja fina (26 G, 1 in).</li>
		<li>Calentar la muestra de resina a 85 ° C en un horno para ablandar la resina para el ajuste o, alternativamente, utilizar un dispositivo de corte, una lámina fina o papel de lija.</li>
		<li>Suprimir la zona de interés de la muestra de resina con una cuchilla de afeitar (véase Tabla de materiales). Montar al espécimen sobre la celebración de barras de vidrio acrílico del calibre requerido por ejemplo, con (un diámetro de 8 mm) y una longitud de 1 cm con pegamento. Cortar al espécimen montado para semi y seccionamiento ultrafino.</li>
		<li>Preparación Semifinos (0.75 μm) y ultrafino (70 nm) las secciones de la zona recortada utilizando un ultramicrótomo: situado a 1,5 mm/s de 0.75 μm de grosor y a 0,7 mm/s para el grueso de nm 70.</li>
		<li>Recoger las secciones SEMIFINOS en soportes de vidrio y las secciones con toluidina 1% de la mancha azul en PBS (de 4 minutos).</li>
		<li>Lávese las secciones varias veces en agua desionizada. Examinar las secciones manchadas bajo el microscopio óptico usando 4 x (NA de ∞ 0,1 /-), 10 x (NA de ∞/0.17 0.22), 40 x (NA de 0.65 ∞/0.17) y 100 x (NA de 1.25 ∞/0.17) objetivos.</li>
		<li>Recoge secciones ultradelgadas en rejillas de níquel. Utilizadas de las rejillas TEM a 180 kV y a 3, 200 x, 6, 000 x o 8.000 aumentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis TEM
	<ol>
<li>Elija los parámetros ultraestructurales de interés para el análisis cuantitativo de TEM (p. ej., botones con vesículas y mitocondrias o axones nonmyelinated y mielínicas) y tomar imágenes TEM de estos parámetros menores de 3 x 500, x 6.000 y 8.000 aumentos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un paso crucial de transducción en el útero es el procedimiento de inyección. La inyección precisa en ventrículos cerebrales o en otra área de interés requiere experiencia y habilidad práctica. La más fina la punta microcapillary, el menor daño tisular puede ocurrir; sin embargo, esto es a costa de aumentar la presión de la inyección. En contraste con electroporación en el útero19,20,21,22, la ...

Ningún fotón puede penetrar a una muestra de tejido ultrafino en el grado de profundidad de un electrón. Esto atribuye ventajas inestimables a TEM en la captura de imágenes de resolución nanométrica de estructuras finas en comparación con técnicas de microscopía de luz. Por ejemplo, permite la visualización de los organelos intracelulares como mitocondrias, melanosomas y varios tipos de gránulos secretores, microtúbulos, microfilamentos, cilios, microvellosidades y uniones intercelulares (superficie de la célula TEM especializaciones), en particular sinapsis en el sistema nervioso1,2,3,4. El objetivo general del presente estudio metodológico es el reconocimiento ultraestructural de los cambios en la plasticidad neuronal durante el desarrollo sobre interferencia prenatal mediante la combinación de las técnicas de vanguardia de transducción en el útero y TEM. Virally codificadas proteínas de interés han sido transduced en el útero en el sistema nervioso central5,6,7, incluyendo la médula espinal6. Por ejemplo, en el útero transducción en combinación con TEM se ha utilizado para estudiar el efecto de la molécula de adherencia de célula L1 motor aprendizaje plasticidad en ratones deficientes en L1, en particular con respecto a la interacción entre las proteínas del receptor nuclear y L1 en las neuronas cerebelosas7.
El análisis de parámetros de neuroplasticidad requiere información precisa sobre la localización de las zonas más pequeñas dentro del sistema nervioso. Por lo tanto, es adecuada describir detalles ultraestructurales y su orientación topográfica exacta con respecto a otras estructuras. En el presente estudio, se presenta un método preparatorio específico con el objetivo de la investigación detallada de áreas morfológicas distintas basadas en la luz y la microscopia electrónica. Este enfoque combina varias técnicas de manipulación del tejido, a partir de transducción en el útero de ratón cerebro y médula espinal y seguido por la fijación de la perfusión, incrustación de molde y procesamiento del tejido para TEM. Un paso esencial entre la fijación y el procesamiento del tejido para TEM es la documentación de los tejidos, utilizando la técnica de reflexión de la luz de interferencia que permite la documentación precisa microfotográficos y baja magnificación de muestras de tejido8,9,10. Incorporado en el enfoque actual, esta técnica permite a los investigadores examinar detalles topográficos y estructurales de las superficies de tejido nervioso y de perfiles de segmento de muestra antes de su preparación para TEM.
Un marco especial para seccionar todo cerebro corresponde a las coordenadas estereotáxicas. Este marco de beneficios morfológica reconstrucción tridimensional (3D) de zonas en tejido nervioso y puede ser utilizado para el análisis morfométrico. Las macrographs de las visualizadas secciones se asignan a coordenadas topográficas, y las secciones en serie numeradas crear mapas en un atlas de tejido.
Después de procesamiento de la resina, se secciona el tejido embebido en secciones ultrafinas (< 70 nm) que contiene las áreas seleccionadas, según los mapas del atlas mencionado tejido. Las secciones ultrafinas son sometidas a TEM para obtención de imágenes de alta resolución de los parámetros (por ejemplo, áreas de sección transversal Perfil de botones sinápticos o axonales fibras) de la plasticidad de sus contenidos y de contactos a estructuras vecinas dentro del complejo neuropilo.
Con el método descrito en este documento, la transición de macroestructuras visualizado a micro - y nanoestructuras permite estudios comparativos detallados de la plasticidad neuronal morfológica después en el útero de transducción el desarrollo nervioso sistema.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tris(dimetil-aminometil)fenol</td><td>Serva</td><td>36975</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 26 G x 1''</td><td>Henke-Sass, Wolf GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>410 Unidad de anestesia para bomba de aire</td><td>Instrumentos biomédicos (Univentor)</td><td>8323102</td><td></td></tr><tr><td>Virus adenoasociados serotipo 1 (AAV1)</td><td>UKE (Viral Core Facility)</td><td>-</td><td>Para referencias y áreas objetivo de AAV1, véase: https://www.addgene.org/viral-vectors/aav/aav-guide/ y también: Vectores de entrega de genes de diseño: ingeniería molecular y evolución de vectores virales adenoasociados para mejorar la transferencia de genes. Kwon I, Schaffer DV. Pharm Res. 2008 Marzo; 25(3):489-99. Los vectores virales AAV recombinantes pseudotipados con cápsidas virales de los serotipos 1, 2 y 5 muestran eficiencia diferencial y tropismo celular después de la entrega a diferentes regiones del sistema nervioso central. Burger C, Gorbatyuk OS, Velardo MJ, Peden CS, Williams P, Zolotukhin S, Reier PJ, Mandel RJ, Muzyczka N. Mol. Ther. Agosto de 2004; 10(2):302-17. Los vectores de virus adenoasociados recombinantes autocomplementarios (scAAV) promueven la transducción eficiente independientemente de la síntesis de ADN. McCarty DM, Monahan PE, Samulski RJ. Gene Ther. Agosto de 2001; 8(16):1248-54.</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>baja gelificación Bomba</td></tr> de <tr><td>aire de</td> agarosa <td>Instrumentos biomédicos (Univentor)</td><td>Eheim 100</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>CIBA-GEIGY</td><td>23857.9</td><td>resina para la inclusión de</td></tr><tr><td>tejidos Conjuntos de sintonía del aspirador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Máscara de respiración Ratón Aluminio anodizado</td><td>Instrumentos biomédicos (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfina</td><td>Temgesic</td><td>ampollas</td><td>analgésicos</td></tr><tr><td>capilares</td><td>Ciencia-Productos</td><td>GB100TF-10</td><td>con fillamento</td></tr><tr><td>Anhídrido dodecenilsuccínico</td> Pinzas Dumont <td>Fluka</td><td>44160</td><td></td></tr> (<tr><td>#3, 12 cm, rectas, 0,2 x 0,12 mm)</td><td>FST</td><td>11203-23</td><td></td></tr><tr><td>afeitadora eléctrica</td><td>Phillips</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Suturas Ethicon (Ethilon, 6-0 y 3-0)</td><td>Ethicon-poliamida</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>lubricante ocular</td><td>Bepanthene-Fast</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>para la visualización de líquidos inyectados</td></tr><tr><td>Interruptor de enrutamiento de gas 4/2 conectores</td><td>Instrumentos biomédicos (Univentor)</td><td>8433020</td><td></td></tr><tr><td>halsted Pinzas hemostáticas para mosquitos (12,5 cm, rectas)</td><td>FST</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>Relación heparina-natrio</td><td></td><td></td><td>25 000 I.E./5 mL</td></tr><tr><td>Caja de inducción para ratones con tapa horizontal. Dimensiones interiores: LxBxH: 155 mm x 115 mm x 130 mm. Espesor de la pared: 6 mm</td><td>Instrumentos biomédicos (Univentor)</td><td>-</td>pinzas de <td></td></tr><tr><td>iris (10 cm, curvadas, dentadas)</td><td>FST</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>tijeras de iris (11 cm, rectas, carburo de tungsteno)</td><td>FST</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran OP Tisch, calentadas eléctricamente, sm Dimensiones exteriores: 257 mm x110 mm x 18 mm. Área de calentamiento: 190 mm x 90 mm La eliminación del isoflurano que escapa la máscara respiratoria se realiza hacia abajo de acuerdo con las normativas </td><td>Instrumentos biomédicos (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano (Attane)</td><td>JD medical</td><td></td><td>anestesia inhalatoria</td></tr><tr><td>Luces LED RGB</td><td>Cameo</td><td>CLQS15RGBW</td><td>LEDs 2 x 15 W</td></tr><tr><td>Microscopio óptico Basic DM E</td><td>Leica-4x</td><td></td> <td>(N.A. 0,1 &infin;/-), 10x (N.A. 0,22 &infin;/0,17), 40x (N.A. 0,65 &infin;/0,17), 100x (N.A. 1,25 &infin;/0,17) Objetivos</td></tr><tr><td>extractor de micropipetas</td><td>Ciencia-Productos</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas hemostáticas para mosquitos (12.5 cm, curvado)</td><td>FST</td><td>13010-12</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas de níquel, malla 200</td><td>Ted Pella</td><td>1GC200</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de osmio (VIII)</td><td>Degussa</td><td>73219</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>Fluka</td><td>82320</td><td></td></tr><tr><td>hojas de afeitar</td><td>Schick</td><td>87-10489</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico (Narcoren)</td><td>Merial GmbH</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TC01mR 1-Controlador de temperatura Channal con retroalimentación</td><td>Biomedical Instruments (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Technovit 4004 pegamento de dos componentes</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Telemacrodevice</td><td></td> <td>Canon-Canon</td> <td>Spiegelreflex Kamera EOS2000D, EF-S 18-55 mm f/3.5-5.6 IS STM Objetivo, Extensión por debajo de 150 mm, Tubo de extensión manual Anillo de 7 mm, anillo de 14 mm, anillo de 28 mm, Anillo macro inverso (58 mm), Soporte de copia Canon.</td></tr><tr><td>Thermopuller P-97</td><td>Sutter</td> <td>Instruments-dispositivo</td><td></td></tr> <tr><td>de cuchillas de afeitar vibradoras delgadas</td><td></td> <td>Krup-con</td> <td>hojas delgadas Szabo</td></tr><tr><td>azul toluidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión C20</td> <td>Phillips-hasta</td> <td>200 kV</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 6/4 Material del tubo para la conexión de todas las piezas Diámetro exterior: 6 mm Diámetro interior: 4 mm Wa ll espesor: 1 mm</td><td>Instrumentos biomédicos (Univentor)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut E</td><td>Reichert-Jung-ultramicrotomo</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Univentor Scavenger</td><td>Instrumentos biomédicos (Univentor)</td><td>8338001</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Vannas (8 cm, rectas)</td><td>FST</td><td>15009-08</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

El presente estudio combina la transducción en el útero con microscopía electrónica de transmisión (TEM) con el objetivo de un análisis preciso morfométricas de parámetros ultraestructurales en estructuras topográficas claramente identificados, afectados por una proteína de interés se introduce en el organismo vía transferencia viral. Este enfoque combinado permite una transición fluida de macroestructurales a identificación ultraestructural por mapas topográficos de la navegación en un atlas de tejido. Alta resolución microscopia electrónica del tejido en el útero-transduced revela la fina ultraestructura el neuropil y sus parámetros de plasticidad, tales como áreas de sección bouton sináptico, el número de vesículas sinápticas y mitocondrias dentro de un Perfil de Bouton, la longitud de los contactos sinápticos, sección áreas axonales, el grosor de las vainas de mielina, el número de laminillas del myelin y áreas de sección de perfiles de las mitocondrias. El análisis de estos parámetros revela conocimientos esenciales en los cambios de plasticidad ultraestructural en las áreas del sistema nervioso que se ven afectados por la transferencia viral de la construcción genética. Este método combinado no sólo se puede utilizar para estudiar el efecto directo de biomoléculas genéticamente o drogas en la plasticidad neuronal pero también abre la posibilidad para estudiar el rescate en el útero de la plasticidad neuronal (por ejemplo, en el contexto de enfermedades neurodegenerativas).

Para la anestesia rápida y fiable de los ratones, se consideraron varios parámetros de seguridad, y un espacio de trabajo optimizado de la unidad de anestesia demostró para ser adecuada (figura 1A). La unidad está diseñada para controlar la mezcla de isoflurano líquido y aire ambiente con una precisión necesaria para la exitosa cirugía en pequeños animales, como ratones y ratas. Aire e isoflurano se mezclan en el vaporizador de acuerdo con la...

La combinación de microscopía electrónica de transmisión y transducción de señales en el útero es un poderoso enfoque para estudiar los cambios morfológicos en la ultraestructura fina del sistema nervioso durante el desarrollo. Este método combinado permite penetraciones profundas en cambios en los detalles estructurales subyacentes de neuroplasticidad con respecto a su representación topográfica.

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Nuestro enfoque combinado ayuda a responder cómo los parámetros de neuroplasticidad ultraestructural cambian después de las intervenciones tempranas del desarrollo al naciente sistema nervioso en el útero. La principal ventaja de nuestro método es la adquisición de imágenes de alta resolución de macro-meso-micro-y nanoestructuras en el sistema de coordenadas predefinido dentro de un atlas de tejido. La implicación de nuestro método es su potencial terapéutico traslacional para enfermedades neurodegenerativas congénitas.Por ejemplo, tratamiento y rescate en etapas embrionarias utilizando esta técnica de transducción del útero. Nuestro método se puede aplicar a cualquier otro modelo. Por ejemplo, las especies de ratón se pueden cambiar, así como el área de interés.Los investigadores que prueban nuestro método por primera vez necesitan un entrenamiento quirúrgico profundo, así como el conocimiento de cómo preparar el tejido para la toma de imágenes microscópicas electrónicas. Comience cargando una punta capilar personalizada que contenga cuatro veces 10 a las 11 partículas virales del recubrimiento de virus asociado al adeno tipo 1 para el objetivo deseado, y etiquetado con tinte Fast Green en un tubo aspirador. Añadir 15 microlitros de las partículas de virus asociadas a adeno etiquetadas en el capilar.A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del otro en un ratón embarazada anestesizado día embrionario 14.5 y desinfecte la piel. Utilice fórceps de iris serrados curvos y tijeras rectas de carburo de tungsteno para hacer una incisión de la piel a lo largo de la línea mediana. Usando pinzas dumont rectas para agarrar la pared peritoneal, continúe a lo largo de la linea alba con tijeras Vannas rectas y coloque un pedazo de película de parafina fenestrada sobre la abertura abdominal y use un dispositivo similar a una cuchara para exponer los cuernos uterinos sin dañar los embriones dentro de los cuernos.Después de aplicar unas gotas de PBS de 37 grados celsius en los cuernos uterinos, inspeccione los embriones en busca de daño o malformaciones dentro del saco uterino. Gire los embriones cuidadosamente dentro de sus sacos hasta que se logre la posición deseada para cada inyección. Cuando los embriones estén en su lugar, inyecte de uno a dos microlitros de la solución de partículas de virus etiquetados con Fast Green en cada embrión.Después de inyectar todos los embriones, coloque los cuernos uterinos de nuevo en la cavidad abdominal, y agregue unas gotas de PBS de 37 grados Celsius en el abdomen. Luego usa suturas de tamaño poliamida 6-0 para cerrar la pared peritoneal y las suturas de tamaño poliamida 3-0 y los fórceps hemostáticos Mosquito de Halsted para cerrar la piel. Para incrustar tejidos aislados de interés para la fotografía tele-macro, coloque la muestra de tejido en un marco especial con el ángulo de sección reproducible y documente las coordenadas.Llene el marco con 30 grados-Celsius 3%agarosa hasta que el tejido esté cubierto, y cubra el marco con una tapa de plástico hasta que la agarosa se haya endurecido. Mientras la agarosa se está endureciendo, utilice el dispositivo gráfico tele-macro para crear imágenes del tejido incrustado y sus coordenadas dentro del marco. Cuando la agarosa se haya solidificado, transfiera el tejido incrustado en la agarosa al marco con huecos de corte correspondientes a las coordenadas del primer marco.Utilice un dispositivo con una cuchilla de afeitar delgada y vibrante para cortar el tejido incrustado en secciones de un espesor experimental adecuado. A continuación, imagine cada sección de tejido en PBS y recopile las imágenes en una carpeta. Para preparar las muestras de tejido para la microscopía electrónica de transmisión, en un gabinete de bioseguridad, lave las secciones tisulares con dos lavados de 30 minutos en PBS, seguido de una incubación de dos horas en una solución de tetróxido de osmio acuosa al 2%a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave las secciones osmicadas dos veces más en PBS durante 30 minutos por lavado y deshidrate las secciones en inmersiones secuenciales de etanol de 10 a 15 minutos como se indica. Después de la inmersión de 70%etanol, coloque cada muestra en un plato negro sobre un fondo negro opaco e imagine las muestras en 70%etanol bajo luz LED RGB aplicada a las muestras de los lados izquierdo y derecho en ángulos de 45 grados. Cree un atlas de las imágenes de la sección con coordenadas recopilando imágenes de las muestras en serie en una carpeta.Tratar los especímenes con dos incubaciones de 30 minutos al 100% de etanol, seguidas de dos incubaciones de óxido de 30 minutos al 100%, ambas a temperatura ambiente. Mientras las muestras están incubando, mezcle la resina recién preparada con óxido de propileno en una a una y una a dos proporciones, y agregue un acelerador del 3% a ambas soluciones. Después de la segunda incubación de óxido de propileno, transfiera las muestras a la solución media de incrustación de óxido de propileno de uno a dos durante dos horas a temperatura ambiente, seguida de una incubación de dos horas en la solución media de incrustación de óxido de propileno de uno a uno a temperatura ambiente.Al final de la segunda incubación, transfiera los tejidos a platos planos de polipropileno y cure los tejidos incrustados con resina fresca que contenga un acelerador del 3% durante 12 a 24 horas a 65 a 85 grados centígrados. A continuación, enfríe el tejido a temperatura ambiente y retire las muestras incrustadas en resina de los platos de polipropileno. Para asignar un área de interés, seleccione una imagen que contenga el área de interés del atlas de imagen preparado anteriormente.Dibuje los bordes del área de interés sobre la imagen seccionada, superponga ópticamente estos bordes sobre la muestra incrustada bajo el microscopio, y utilice una aguja de calibre de una pulgada de 26 para rayar estos bordes de la región sobre la muestra de resina. Luego, calienta los especímenes a 95 grados Celsius para suavizar la resina. A continuación, saque las muestras de resina tibia del horno y utilice una cuchilla de afeitar para extirpar las áreas de interés.Pegue los especímenes en barras de sujeción de vidrio acrílico del calibre adecuado y recorte las muestras montadas para una sección semi y ultrafina. Utilice un ultramicrotoma para adquirir secciones semidelgadas de 0,7 micrómetros y ultradelgadas de 70 nanómetros, recogiendo las secciones semifinas en los soportes de vidrio y las secciones ultradelgadas en las rejillas de níquel. Mancha las secciones semifinas con 1%Toluidina azul en PBS durante cuatro minutos, seguido de varios lavados en agua desionizada, antes de examinar las secciones por microscopía de luz.Las secciones ultradelgadas pueden evaluarse directamente mediante microscopía electrónica de transmisión a 180 kilovoltas sin más modificaciones. Después de la sección, las rebanadas de tejido son fotografiadas por la fotografía tele-macro como se acaba de demostrar. Después de la osmicación y la inmersión en etanol, las secciones se vuelven a ver mediante una telesmografía de luz de interferencia, revelando un patrón de color específico para cada superficie de tejido.Después de la deshidratación adicional y la incrustación de resina, las áreas de interés se seleccionan y procesan posteriormente para la microscopía electrónica de transmisión. En el hipocampo y el cerebelo, se sabe que las sinapsis de fibra musgosas presentan características ultraestructurales únicas en comparación con otras sinapsis, incluyendo grandes boutones presinápticos. En sus perfiles de sección transversal, los boutons contienen un gran número de vesículas y mitocondrias, y muy a menudo encierran varias espinas dendríticas.En la médula espinal, el funiculus dorsal contiene muchas fibras axonales que son mielinadas por oligodendroglia. En las secciones transversales, el funiculus dorsal se puede encontrar entre ambos cuernos posteriores de la médula espinal. En las imágenes de microscopía electrónica de transmisión, los axones mielinados seccionados aparecen redondos, y las vainas de mielina que rodean los axones están organizadas en las lamelas.El atlas preparado y las imágenes de microscopía electrónica de transmisión micrográfica de los parámetros ultraestructurales no sólo son útiles para la comparación de la neuroplasticidad morfológica de diferentes secciones bajo diversas condiciones de tratamiento, sino también para las comparaciones entre parámetros dentro de la misma área. Recuerde planificar y preparar a fondo antes de comenzar la transducción en el útero, y asegúrese de tener respaldo de materiales e instrumentos en caso de complicaciones. Siguiendo nuestro método, se pueden agregar otras técnicas como el etiquetado de inmunooro antes de la microscopía electrónica para el rastreo ultraestructural de una molécula definida de interés.Comenzando con una visión holística de todo el organismo y haciendo zoom hacia la topografía molecular, somos capaces de estudiar y manipular la relación entre la función tisular y la morfología. El tetróxido de osmio es peligroso. Asegúrese de trabajar siempre debajo de la capucha, y de usar gafas protectoras y guantes de mano cuando trabaje con este reactivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

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Específica Striatum Cortex, hipocampo, Thalamus-, hipotálamo, núcleo-septal lateral y<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporación en el ratón C57BL / 6

Este artículo describe un método para generar una lesión por compresión de la médula espinal (LME) reproducible en el ratón neonatal. El modelo proporciona una plataforma ventajosa para estudiar los mecanismos de plasticidad adaptativa que subyacen a la recuperación funcional espontánea.

Un ratón neonatal lesión de médula espinal de compresión Modelo

Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

Desafiando las neuronas jóvenes en nuevas regiones del cerebro puede revelar penetraciones importantes en cómo el entorno esculpe maduración y destino neuronal. Este protocolo describe un procedimiento para cosechar precursores interneurona de regiones específicas del cerebro y transplantarlas o homotopically o heterotopically en el cerebro de crías de postnatales.

Homochronic trasplante de precursores de interneurona en cerebros de ratón Postnatal temprana

En este protocolo, describimos cómo inyectar lentivirus la cavidad amniótica del ratón en E7.5, lo que lleva a una transducción uniforme de toda la placa neural, con efectos perjudiciales mínimos sobre la supervivencia o el desarrollo embrionario.

Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5

Aprende a evaluar parámetros de neuroplasticidad ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión y transducción in utero en cerebro y médula espinal de ratón. Este método ofrece imágenes de alta resolución con potencial terapéutico translacional.

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal (Video) | JoVE Journal

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

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