Name: Incorporación de un procedimiento de biopsia del hígado Survivable en ratones para evaluar la resolución de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 14 s
Description: Aprenda un procedimiento de biopsia hepática supervivible en ratones con esteatohepatitis no alcohólica para evaluar terapias como liraglutida. Este método imita diseños de ensayos clínicos y permite medir con precisión la eficacia de fármacos.

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Los autores reconocen con gratitud la ayuda de Sally Lee y Holly Koelkebeck por experiencia en procesamiento de tejido e inmunohistoquímica. Los autores agradecen también Donna Goldsteen y el personal de recursos de animales de laboratorio (MedImmune, Gaithersburg, MD) por su ayuda con cuidado y cría de animales y procedimientos técnicos.

Todos los experimentos in vivo se realizaron conforme a las políticas de cuidado de Animal institucional y Comité uso (IACUC) de MedImmune, LLC de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8va edición (2011). Ratones machos C57BL6J se colocaron en la dieta alta en grasas, alta fructosa, colesterol AMLN. Se realizaron biopsias del hígado después de 26 semanas en dieta, 3 semanas antes del inicio de la intervención farmacológica.
1. obtener y preparar materiales quirúrgicos
<ol><li>Instrumentos estériles del autoclave (pequeñas puntas punta Tijeras, pinzas de punta Roma, torundas de algodón, cuadrados de gasa, clips 7 mm grapas de la herida y grapadora).</li>
	<li>Obtener, estériles para suturas para el cierre de pared abdominal (revestido Sutura absorbible 5-0 con una aguja de PC-1 es conveniente), esponja de gelatina absorbible comprimido (para ser utilizados con fines hemostáticos), cortinas estériles y guantes, scrub base de yodo y 70% etanol hisopos/toallitas , buprenorfina (0.05-0.1 mg/kg dosis por ratón, por lo menos 3 dosis al ratón) y ungüento del ojo quirúrgico/lubricación.</li>
	<li>Preparar relleno con isoflurano vaporizador para la anestesia.</li>
	<li>Gire en un esterilizador de bolas, para la esterilización rápida del instrumento entre los animales.</li>
	<li>Girar sobre una superficie de calentamiento o almohada, que se utilizará para la recuperación de animales.</li>
	<li>Don equipo de protección personal (EPP) (es decir, máscara, vestido, gorro de pelo, guantes).</li>
</ol>2. pre-quirúrgicos preparados
<ol><li>Coloque el ratón en la cámara de inducción con 2-3% flujo de isoflurano al efecto.</li>
	<li>Observar el ratón hasta que la falta de respuesta al dedo del pie-pinch confirma que la profundidad de la anestesia es apropiada.</li>
	<li>Usar ungüento para evitar la sequedad de la córnea asociado con la anestesia.</li>
	<li>Administrar la buprenorfina por vía subcutánea (0.05-0.1 mg/kg).</li>
	<li>Afeitar el sitio quirúrgico inmediatamente caudal del proceso xifoides, utilizando podadoras animales.</li>
	<li>Mueva el ratón a una superficie caliente (37 ° C) después de afeitar el sitio quirúrgico. Coloque el ratón de tal manera que la superficie dorsal es hacia abajo, y el abdomen está expuesto. Introduzca la nariz del ratón en el cono de nariz de anestesia para facilitar entrega de isoflurano en un caudal de 2-3%.</li>
	<li>Limpiar el sitio quirúrgico con hisopos alternadas de betadine y etanol al 70% (3 veces).</li>
	<li>Abierto y crear instrumentos quirúrgicos estériles.</li>
	<li>Quitar guantes y reemplazar con guantes quirúrgicos estériles.</li>
</ol>3. quirúrgico
<ol><li>Haga una incisión longitudinal con tijeras (1-2 cm), inmediatamente caudales del proceso xifoides y ligeramente al lado izquierdo del ratón, en la piel abdominal.</li>
	<li>Blunt disecar la piel de la pared abdominal utilizando pinzas y tijeras.</li>
	<li>Exponer la pared abdominal y visualizar hígado debajo.</li>
	<li>Usando una marca de la hoja de bisturí estéril una incisión (1-2 cm) en la pared abdominal para visualizar el lóbulo lateral izquierdo (LLL) del hígado. Nota: Ser consistente durante todo el estudio. Otros lóbulos común de interés son el lóbulo medial derecho (RML) y lóbulo medial izquierdo (LML).</li>
	<li>Extraer el lóbulo lateral izquierdo a través de la incisión.</li>
	<li>Opción 1: Masaje suavemente el abdomen con los dedos pulgar e índice para exponer una porción de la LLL.</li>
	<li>Opción 2: Colocar un hisopo de algodón estéril por debajo del LLL que tire una porción hacia fuera a exponerse.</li>
	<li>Coloque un pedazo de remojados en solución salina estéril de Gasa por debajo de la LLL para permitir una superficie estéril e hidratada para el hígado mentir sobre.</li>
	<li>Cortar una pieza en forma de cuña del hígado del LLL haciendo dos cortes con una tijera estéril. Nota: Del tamaño del hígado se eliminan es 30-50 mg (< 5% del hígado en ratones).</li>
	<li>Cortar un trozo de esponja de gelatina similar en tamaño a la pieza de cuña del hígado. Introducir la esponja en la porción del corte del hígado usando fórceps.</li>
	<li>Mantener la esponja con pinzas y mantener contacto con el hígado hasta que se adhiere a la superficie del hígado y se logra la hemostasia.</li>
	<li>Lugar la pieza de biopsia del hígado en el tubo apropiado (es decir, congelados, fijador, etcetera.).</li>
	<li>Suavemente Coloque el hígado en la cavidad abdominal, teniendo cuidado de no perturbar la esponja.</li>
	<li>Sutura de la pared abdominal con cubierta Sutura absorbible 5-0 inicial y final con un nudo cuadrado completo.</li>
	<li>Cierre la piel con pinzas de herida de 7 mm (o grapas).</li>
	<li>Inspeccione los ganchos de la herida para asegurarse de que hay un cierre completo de la incisión.</li>
	<li>Quitar el mouse del cono de la nariz y colocar en una jaula limpia en una superficie caliente.</li>
	<li>Instrumentos de lugar en esterilizador de bolas entre ratones de 10-20 s. Asegúrese de que todo el material orgánico debe eliminarse de los instrumentos usando solución salina estéril antes de colocar en el esterilizador de bolas de cristal.</li>
</ol>4. postoperatorio cuidado
<ol><li>Controlar el ratón hasta que recupera la conciencia y puede la derecha sí mismo.</li>
	<li>Grabar observaciones postoperatorias y compruebe los ratones diariamente para la dehiscencia.</li>
	<li>Administrar una segunda y tercera dosis de buprenorfina (0.05-0.1 mg/kg) por vía subcutánea 6-8 h después de la cirugía y otra vez después de la cirugía 24 h.</li>
	<li>Eliminar clips de la herida en el post-operatorio de 7 a 10 días.</li>
</ol>

<ol><li>Brunt, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease+%28NAFLD%29+activity+score+and+the+histopathologic+diagnosis+in+NAFLD%3A+distinct+clinicopathologic+meanings%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings.</a> Hepatology. 53 (3), 810-820 (2011).</li>
<li>Brunt, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Pathology of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 7 (4), 195-203 (2010).</li>
<li>Kleiner, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+histological+scoring+system+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Hepatology. 41 (6), 1313-1321 (2005).</li>
<li>Diehl, A. M., Cause Day, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis%2C+and+Treatment+of+Nonalcoholic+Steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic Steatohepatitis.</a> New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).</li>
<li>Golabi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+complications+and+challenges+in+nonalcoholic+steatohepatitis+screening+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Current complications and challenges in nonalcoholic steatohepatitis screening and diagnosis.</a> Expert Reviews of Gastroenterology and Hepatology. 10 (1), 63-71 (2016).</li>
<li>Roth, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+histologic+alcoholic+hepatitis+based+on+clinical+presentation+limits+the+need+for+liver+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Prediction of histologic alcoholic hepatitis based on clinical presentation limits the need for liver biopsy.</a> Hepatology Communications. 1 (10), 1070-1084 (2017).</li>
<li>Kristiansen, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obese+diet-induced+mouse+models+of+nonalcoholic+steatohepatitis-tracking+disease+by+liver+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Obese diet-induced mouse models of nonalcoholic steatohepatitis-tracking disease by liver biopsy.</a> World Journal of Hepatology. 8 (16), 673-684 (2016).</li>
<li>Trevaskis, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+receptor+agonism+improves+metabolic%2C+biochemical%2C+and+histopathological+indices+of+nonalcoholic+steatohepatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (8), G762-G772 (2012).</li>
<li>Tolbol, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+hepatic+effects+of+liraglutide%2C+obeticholic+acid+and+elafibranor+in+diet-induced+obese+mouse+models+of+biopsy-confirmed+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Metabolic and hepatic effects of liraglutide, obeticholic acid and elafibranor in diet-induced obese mouse models of biopsy-confirmed nonalcoholic steatohepatitis.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (2), 179-194 (2018).</li>
<li>Clapper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+mouse+model+of+fatty+liver+disease+and+nonalcoholic+steatohepatitis+reflecting+clinical+disease+progression+and+methods+of+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Diet-induced mouse model of fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis reflecting clinical disease progression and methods of assessment.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 305 (7), G483-G495 (2013).</li>
<li>Armstrong, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liraglutide+safety+and+efficacy+in+patients+with+non-alcoholic+steatohepatitis+%28LEAN%29%3A+a+multicentre%2C+double-blind%2C+randomised%2C+placebo-controlled+phase+2+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Liraglutide safety and efficacy in patients with non-alcoholic steatohepatitis (LEAN): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 2 study.</a> Lancet. 387 (10019), 679-690 (2016).</li>
</ol>

S.O. y C.R. son empleados y accionistas de MedImmune/AstraZeneca. JLT era un empleado y accionista de MedImmune/AstraZeneca en el momento que se llevaron a cabo estos experimentos.

Aquí describimos en detalle el procedimiento de biopsia del hígado del ratón primero descrito por badajo et al10y son un ejemplo de su utilidad en un modelo murino de NASH, similar a los anteriores informes6,9. El procedimiento de biopsia del hígado es una valiosa herramienta para evaluar el fenotipo de NASH antes y después del tratamiento, de manera similar a la realizada en los ensayos clínicos terapéuticos. La biopsia permite la comparación directa de cada materia, es decir, que los ratones mismo pueden ser utilizados para ambos puntos del tiempo. También nos demuestran su potencial traslacional. En un ensayo clínico en sujetos de NASH biopsia-probada, liraglutida produce una tasa de respuesta del 39% (pacientes con mejoría) en NAS, mientras que en nuestro estudio se observó una tasa de respuesta del 66% para NAS mejoradas. Por otra parte, 26% de los pacientes tenía fibrosis mayor puntuación con 9% empeoramiento, frente al 14% y 36% en el brazo de placebo, respectivamente11. En nuestro estudio, se observó una tasa de 17% de mejoría con tratamiento liraglutida. Estas comparaciones destacan el poder de la biopsia hepática de base y confirman comprensión traslacional potenciales, al menos para esta clase de terapéutica.
Es fundamental para cosechar un pedazo bastante grande de tejido del hígado durante el procedimiento de biopsia para analizar adecuadamente las características histológicas, pero también no demasiado grande de un pedazo de hígado para comprometer la función del hígado. Se observó una tasa de mortalidad de cero con esta cirugía, y los animales aparecieron completamente recuperados dentro de 1 día con la reanudación de la conducta alimentaria normal. Así, el tiempo entre la biopsia y la iniciación del estudio intervención es limitado no por la recuperación de animales pero probablemente por el tiempo de procesamiento de las muestras, análisis y posterior asignación al azar.
Utilizando el procedimiento de biopsia del hígado como método de confirmación de la fibrosis antes de intervención ayudó a reducir la variabilidad en nuestro estudio, lo que nos permite excluir los ratones que no se desarrolló completamente cierto grado de fibrosis hepática como consecuencia de la dieta de inducción AMLN NASH. Además, mejora nuestra capacidad de entender mejor el impacto de posibles intervenciones de mejora de NASH, en comparación con sólo tener una muestra hepática terminal y puntuación de NASH. Hasta que nuevas técnicas no invasivas son exploradas y aceptadas ampliamente, la biopsia del hígado es la única probada para determinar a NASH.

Esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una enfermedad progresiva del hígado y una forma más grave de la hepatopatía grasa (EHGNA), que se está convirtiendo en cada vez más frecuente debido a su asociación con obesidad y diabetes tipo 2. No hay terapias aprobadas para la EHGNA/NASH o biomarcadores aprobados fácilmente evaluar la progresión de la enfermedad. NASH se diagnostica histológicamente mediante la evaluación de la inflamación, el exceso de lípidos hepática (esteatosis), hepatocitos en globo y fibrosis1,2,3,4. En los ensayos clínicos, estos extremos son evaluados antes del estudio en una muestra de hígado recogido mediante biopsia y de una segunda biopsia del hígado después de un periodo de tratamiento. Así, se evalúa la efectividad del agente de prueba mediante el cambio en la patología del hígado en sujetos con previamente identificar/cuantificar (es decir, biopsia-probado) NASH que se asignaron al azar a grupos de tratamiento. Estos mismos extremos histologic se utilizan en modelos de roedores evaluar potencial terapéutica de NASH en estudios preclínicos, pero sólo en el tejido terminal de sacrificaron ratones y, por tanto, sin una comprensión del grado de eficacia en la línea de base y la incapacidad de para controlar diferencias en el estado de la enfermedad de base entre los grupos de tratamiento.
Aunque el 25% de adultos con HGNA se presume que NASH basado en niveles de la aminotransferasa sérica elevada, no existen métodos definitivos alternativos para confirmar a NASH que no sean evidencia histológica4. Se han desarrollado métodos no invasivos, tales como las modalidades radiológicas (ecografía, tomografía computada y resonancia magnética) para detectar esteatosis hepática, pero estos métodos no pueden diagnosticar a NASH o determinar la etapa de fibrosis. Elastografía transitoria ofrece una modalidad no invasiva prometedora para medir la rigidez hepática. Se ha demostrado ser preciso en distinguir etapas de fibrosis. Sin embargo, la precisión disminuye con mayor índice de masa corporal (IMC) y tejido adiposo. 5 esto es problemático debido a la mayoría de los pacientes de NASH siendo obesos. Más allá de la relevancia clínica de estos enfoques, ninguna de estas modalidades se utilizan en estudios preclínicos.
Para superar esto, el grupo de investigación del Dr. Jonathan Roth fueron los primeros en poner en práctica un procedimiento de biopsia del hígado en el modelo de ratón de Amylin NASH (AMLN) de NASH6,7,8. Describe la validez predictiva de la biopsia con grado de la enfermedad de NASH y correlación con enfermedad metabólica. Aquí describimos en detalle el procedimiento de biopsia del hígado en el modelo AMLN de NASH y su utilidad en un entorno terapéutico, específicamente para evaluar la eficacia de liraglutida.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutura</td><td>Ethicon</td><td>J834G</td><td></td></tr><tr><td>7 mm Pinzas para heridas</td><td>Reflex</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de gelatina absorbible (GelFoam)</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td>Comprimido, cualquier tamaño</td></tr><tr><td>Almohadilla de preparación con alcohol</td><td>VWR</td><td>75856-902</td><td></td></tr><tr><td>Cortadoras de animales</td><td>Oster</td><td>78005010002</td><td>Tamaño 40</td></tr><tr><td>Cuchilla Lágrimas Artificiales</td><td>Henry Schein</td><td>048272</td><td>Tubo</td></tr><tr><td>Buprenorfina (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser&nbsp;</td><td>NDC 12496-0757-5</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas de preparación de yodo</td><td>Nice Pak Products</td><td>C12400</td><td></td></tr><tr><td>Cortinas estériles</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Guantes quirúrgicos</td><td>Medline</td><td>54720</td><td></td></tr></tbody></table>

incorporación de un procedimiento de biopsia del hígado survivable en ratones para evaluar la resolución de la esteatohepatitis no alcohólica (nash)

Incorporation of a Survivable Liver Biopsy Procedure in Mice to Assess Non-alcoholic Steatohepatitis (NASH) Resolution

Ensayos clínicos que evalúan los tratamientos para el tratamiento de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) implican una línea de base y final de la biopsia del hígado del estudio y evaluación de la mejora en las terminales de la enfermedad, reflejadas a menudo como un porcentaje de cada brazo de tratamiento que mejoraron, empeoró o permaneció sin cambios. Tradicionales estudios preclínicos de roedores para las supuestas terapias de NASH a menudo están limitados por no saber el nivel de hígado enfermedad/NASH presente en el inicio de la intervención terapéutica, en lugar de asignaron al azar grupos de tratamiento en los extremos fácilmente medibles como peso corporal, estado metabólico o similar. Aquí, describimos una técnica de biopsia del hígado en una inducida por la dieta NASH modelo con ratones, para la evaluación de la enfermedad hepática de base para excluir a los ratones que no presentan fibrosis y distribuir igualmente animales con fibrosis similar entre grupos de tratamiento. Estos niveles luego se pueden comparar con los niveles terminal, después de la intervención para una comprensión más verdadera de efectos farmacológicos in vivo y así más reflejan estrategias de diseño de los ensayos clínicos. El ratón es correctamente anestesiado y preparado para la cirugía con las condiciones de esterilidad. Se hace una pequeña incisión en el abdomen superior y se expone el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Quirúrgico se extrae una cuña del hígado, y una pieza de tamaño similar de gelatina absorbible es poner en su sitio para detener cualquier sangrado. El ratón es quirúrgico suturado y engrapado cerrado y se recuperará a la normalidad dentro de 1 día. Todo el proceso tarda 5-10 min por ratón. Aquí ejemplifican la utilidad de este procedimiento mediante el aprovechamiento de la biopsia pre-estudio para evaluar el impacto de la liraglutida glucagon-como peptide-1 (GLP-1) receptor agonista en extremos de NASH en ratones.

Para este estudio, ratones fueron asignados al azar a los grupos de tratamiento (n = 12/grupo) basado en el estudio previa biopsia fibrosis grado y peso corporal. Administraron a ratones vehículo (PBS) o liraglutida (5 nmol/kg) durante 42 días (vehículo o compuestos administrados 10 mL/kg volumen, la dosis por vía subcutánea, una vez al día). Día 42, ratones fueron sacrificados (a través de inhalación de CO2 ) en el estado de no ayuno y el hígado suprimida y procesado para histología.
Hígado biopsia y terminal piezas fueron fijadas durante la noche en formalina al 10%, parafina luego integrados y procesados por hematoxilina y eosina y tinción mediante protocolos estándar9Sirius roja. Las secciones de tejido se evaluaron de manera cegada por un patólogo según el sistema de puntuación de actividad de NASH (NAS)1,2. La NAS refleja el grado de la enfermedad de esteatosis, inflamación lobular y hepatocitos en globo (cada parámetro dado una puntuación de 0-3) como se describió anteriormente9.
Incorporación de una biopsia del hígado en el diseño de este estudio permitida una puntuación de fibrosis (previa biopsia) línea de base. Un total de 118 ratones fueron hechas una biopsia después de 26 semanas de dieta de NASH y la esteatosis y la fibrosis hepática se anotaron para cada biopsia (figura 1). De estos 118 ratones, 49 ratones fueron excluidos basado en baja fibrosis fibrosis alta (grado 0), (grado 4, que exhiben patología anormal) y pérdida de peso anormal o la cicatrización de heridas. Estos criterios de exclusión para 69 ratones a la izquierda para asignar en grupos de estudio y buscar mejoras en el fenotipo de NASH después del tratamiento (figura 1).
Ratones fueron tratados con el vehículo o el agonista GLP-1R la liraglutida (5 nmol/kg) durante 6 semanas. En el grupo tratado con vehículo, 1 ratón expuesta fibrosis empeoró y 4 ratones mostraron peor puntuación NAS (Figura 2A-B). Tratamiento liraglutida se asoció con una mejora general de la fibrosis (figura 2), con 17% de la mejora del grupo de tratamiento y el 83% restante sin cambiar. Asimismo, liraglutida tratamiento mejoró el NAS total score (Figura 2D), con el 66% del grupo de haber mejorado puntuación NAS y 33% permanecía sin cambios.
Además, el tratamiento liraglutida mejoró la inflamación, con el 75% del grupo de tener una baja puntuación de inflamación y 25% permaneció sin cambios (Figura 3B). Tratamiento del vehículo empeora la inflamación, con 17% del grupo con una puntuación mayor de inflamación y 83% permanecido sin cambios (Figura 3A). Esteatosis puntuación permaneció invariable desde el inicio al final del estudio en ambos el vehículo-liraglutida tratados y grupos (Figura 3A, B). Pre vs post biopsia comparaciones para ratones individuales sobre la inflamación y los parámetros de vuelo en globo también se muestran (figura 3-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59130/59130fig1.jpg"> Figura 1: pre-screening biopsia hepática fibrosis y puntuación NAS . (A) representación de todos los 118 ratones que se revisaron para la fibrosis, a través de la biopsia del hígado. (B y C) muestran la fibrosis basal y la puntuación de la NAS, respectivamente, después de que los ratones fueron ordenadas en grupos de estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59130/59130fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59130/59130fig2.jpg"> Figura 2: puntuación de Fibrosis y NAS, biopsia previa y posterior a la intervención. Análisis de respondedor por ciento para el vehículo (A, C) o ratones (B, D) tratados con liraglutida, medida de biopsia hepática basal a fin de hígado muestra para la etapa de fibrosis (A, B) y NAS (C, D). Para cada grupo, el cambio desde el estudio previo al estudio de la biopsia se indica por una línea. Los puntos en cada paso de la puntuación se desplaza ligeramente para permitir la separación visual de los animales, esto es sólo para propósitos de visualización y no reflejar cualquier diferencia en la puntuación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59130/59130fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59130/59130fig3.jpg"> Figura 3: esteatosis, inflamación y en globo, biopsia previa y posterior a la intervención. Análisis de respondedor por ciento para el vehículo (A, C, E) o ratones (B, D, F) tratados con liraglutida, medida de biopsia hepática basal a fin de muestra del estudio hígado por esteatosis puntuación (A, B), inflamación (C, D) y globos (E, F). Para cada grupo, el cambio desde el estudio previo al estudio de la biopsia se indica por una línea. Los puntos en cada paso de la puntuación se desplaza ligeramente para permitir la separación visual de los animales, esto es sólo para propósitos de visualización y no reflejar cualquier diferencia en la puntuación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59130/59130fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

En ajustes clínicos, una biopsia del hígado se utiliza para evaluar estadios de esteatohepatitis no alcohólica (esteatosis, inflamación, hepatocitos en globo y fibrosis). Aquí ilustramos una biopsia del hígado survivable en ratones que se puede utilizar para análisis histológicos para permitir la evaluación de los agentes terapéuticos de forma más alineada con los ensayos clínicos.

Incorporación de un procedimiento de biopsia del hígado Survivable en ratones para evaluar la resolución de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH)

Clinical trials assessing therapies for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) involve a baseline and end of study liver biopsy, and ...

Este procedimiento de biopsia de hígado sobrevivible en ratones con esteatohepatitis no alcohólica, o NASH, permite tanto la exclusión de animales que no tienen NASH como la medición precisa de las respuestas a las intervenciones. Este procedimiento imita de cerca el diseño del ensayo clínico para los estudios de NASH que comparan la patología post-versus pre-tratamiento del hígado y permite una evaluación más precisa de la eficacia del fármaco. Exponer el lóbulo hepático puede ser un desafío al principio.Practique exponer el tejido con el dedo o un aplicador con punta de algodón primero para encontrar el mejor ajuste para usted. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, haga una incisión longitudinal de la piel de la piel de uno a dos centímetros inmediatamente caudal al proceso de xifoide y ligeramente al lado izquierdo del ratón anestesiado. Utilice fórceps y tijeras para diseccionar la piel hasta que la pared abdominal esté expuesta y el hígado se pueda visualizar debajo del tejido muscular.Usando una cuchilla de bisturí estéril, haga una incisión de uno a dos centímetros en la pared abdominal para exponer el lóbulo lateral izquierdo del hígado, y coloque un hisopo de algodón estéril debajo del lóbulo lateral izquierdo para extraer suavemente la porción que se exponga a través de la incisión. Coloque una gasa estéril empapada en solución salina debajo del lóbulo expuesto, y use tijeras estériles para extirpar una pieza de tejido en forma de cuña de 30 a 50 miligramos del hígado extraído. Cortar un pedazo de gelatina absorbible esponja comprimida similar en tamaño a la pieza de cuña del hígado, y utilizar fórceps estériles para insertar la esponja en la porción cortada del hígado.Sostenga la esponja en su lugar con los fórceps hasta que la gelatina se adhiera a la superficie del hígado y se logre la hemostasia antes de colocar la biopsia hepática en un recipiente adecuado para su análisis aguas abajo. Devolver suavemente el hígado a la cavidad abdominal, teniendo cuidado de no molestar a la esponja, y, comenzando y terminando con un nudo cuadrado completo, suturar la pared abdominal con 5-0 suturas absorbibles recubiertas. Luego, cierra la piel con clips de herida de siete milímetros, confirmando un cierre completo después de la colocación, y regresa el ratón a una jaula limpia en una superficie calentada con monitoreo hasta la recuperación completa.En este experimento representativo, 118 ratones fueron biopsiados después de 29 semanas en una dieta personalizada alta en grasas, fructosa y colesterol para inducir NASH. El nivel de fibrosis y esteatosis se obtuvo para cada biopsia. Los ratones fueron excluidos del estudio basado en fibrosis baja o alta y pérdida de peso anormal o cicatrización de heridas, y los ratones restantes fueron tratados con vehículo o el péptido-1 receptor agonista de glucagón-1 liraglutida durante seis semanas.En los grupos tratados con vehículos, un ratón exhibió un aumento en la fibrosis y cuatro ratones demostraron un aumento en la puntuación de actividad de NASH. El tratamiento con liraglutida se asoció con una mejora general de la fibrosis, con una mejora del 17% del grupo de tratamiento que mejora y el 83% se mantiene sin cambios. Del mismo modo, el tratamiento con liraglutida mejoró la puntuación global de NASH, con el 66% del grupo presentando una puntuación mejorada de actividad de NASH, y el 33% se mantuvo sin cambios.Además, el tratamiento con liraglutida mejoró la inflamación, con un 75% del grupo con una puntuación de inflamación más baja después del tratamiento, mientras que los animales tratados con vehículo experimentaron un aumento de la inflamación. La esteatosis no se vio afectada por el tratamiento agonista, permaneciendo inalterada en ambos grupos antes y después de la intervención. Tenga cuidado de no dañar demasiado la pieza de hígado extirpado para asegurarse de que se puede analizar adecuadamente para sus necesidades.Este procedimiento se puede utilizar para imitar los diseños de ensayos clínicos comparando los efectos previos y posteriores al tratamiento de nuevas terapias en los hígados NASH.

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Aquí, se describen métodos optimizados para generar modelos in vivo e in vitro de esteatosis hepática y para analizar los fenotipos esteatóticos y los parámetros fisiológicos relacionados.

Análisis optimizada de<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; La esteatosis hepática

Se describe un modelo animal simple y confiable para la esteatohepatitis no alcohólica inducida por la dieta, que se logra a través de la carcasa no SPF de los animales y la administración de una dieta alta en grasas específica. Describimos la identificación de los subconjuntos de células inmunes hepáticas y adiposas para recapitular las condiciones inmunológicas humanas exponiendo ratones a gérmenes ambientales.

Un modelo murino avanzado para esteatohepatitis no alcohólica en asociación con diabetes tipo 2

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Este protocolo describe el uso de una técnica de ultrasonido mejorada para observar y cuantificar de manera no invasiva los cambios en el tejido hepático en modelos de roedores de enfermedad del hígado graso no alcohólico.

Aplicación de imágenes de ultrasonido y elastografía de onda de cizallamiento en un modelo de rata de NAFLD/NASH

El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).

Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica

El protocolo describe un método sencillo de resección de un hígado de ratón intacto para estudios metabólicos a través de la perfusión de la vena porta.

Ex Vivo Perfusión hepática a través de la vena porta en el ratón

Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

Se ha demostrado que la asociación de la partición hepática y la ligadura de la vena porta para la hepatectomía por etapas (ALPPS) da lugar a una regeneración hepática notable después de varias semanas después de la cirugía de primera etapa. Se han desarrollado modelos animales que se han sometido a ALPPS para explorar la posible capacidad de regeneración hepática y lograr resultados clínicos favorables.

Un modelo de ratón de la partición hepática asociada y la ligadura de la vena porta para el procedimiento de hepatectomía por etapas con ayuda de microscopía

El modelo murino de hepatectomía parcial 2/3 (66%) está bien descrito en la literatura, pero rara vez se han utilizado hepatectomías más extendidas que imitan el síndrome de tamaño pequeño después del trasplante hepático. Describimos un procedimiento de hepatectomía extendida del 78% en un modelo de ratón que resulta en aproximadamente un 50% de letalidad postoperatoria en ratones sanos.

Hepatectomía extendida al 78% en un modelo quirúrgico de ratón

Modelo murino de enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica (MASLD) con disfunción metabólica, cambios en la expresión génica hepática y alteraciones histopatológicas hepáticas que se asemejan a la MASLD humana, incluida la fibrosis que progresa a la fase 3 de fibrosis avanzada. Este modelo se puede utilizar en estudios de fisiopatología de MASLD y en estudios preclínicos de nuevas terapias.

Modelo murino de enfermedad hepática esteatótica asociada a disfunción metabólica con fibrosis

Este protocolo presenta una cadena de imagen completa para visualizar y modelar la morfología de las células estrelladas hepáticas en tejido hepático intacto. Este enfoque combina marcaje fluorescente de fibroblastos usando genética de ratón, preparación tisular in situ basada en perfusión hepática y un método modificado de limpieza de tejidos iDISCO para lograr transparencia óptica.

Mapeo de la morfología de las células estrelladas hepáticas en modelos murinos de fibrosis hepática

Aprenda un procedimiento de biopsia hepática supervivible en ratones con esteatohepatitis no alcohólica para evaluar terapias como liraglutida. Este método imita diseños de ensayos clínicos y permite medir con precisión la eficacia de fármacos.

Incorporación de un procedimiento de biopsia del hígado Survivable en ratones para evaluar la resolución de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) (Video) | JoVE Journal

Incorporación de un procedimiento de biopsia del hígado Survivable en ratones para evaluar la resolución de la esteatohepatitis no alcohólica (NASH)

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