Name: Microfoco CT de rayos X (microCT) Imagen de Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) y Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende microCT de rayos X para imagen de invertebrados marinos como Actinia equina, Harmothoe sp. y Xenoturbella japonica. Este protocolo accesible permite montaje flexible y análisis 3D de morfología interna.

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Nos gustaría agradecer a Toshihiko Shiroishi por su ayuda y por proporcionar el entorno de investigación durante este estudio. Agradecemos a Kensuke Yanagi y Takato Izumi por el asesoramiento sobre A. equina,y Masaatsu Tanaka por consejos sobre el espécimen Harmothoe sp. Nos gustaría agradecer al personal del Centro de Investigación Marina de Shimoda, universidad de Tsukuba, y de la Estación Biológica Marina misaki, la Universidad de Tokio, por su ayuda en colecciones de muestras. Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.jp) por la edición en inglés. Este trabajo fue apoyado por la JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP26711022) a HN, y JAMBIO, Asociación Japonesa de Biología Marina.

1. Fijación
<ol><li>Para Actinia equina,relajar a los animales en 10% MgCl2 agua de mar durante unos 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera al 70% de etanol y almacene a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para Harmothoe sp., anestesiar a los animales colocándolos en agua de mar helada durante unos 15 minutos. Traslado a una solución de formalina del 10% (v/v) con agua de mar y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para Xenoturbella japonica,relaja al animal usando 7% MgCl2 en agua dulce. Fijar en 4% paraformaldehído (PFA) en agua de mar filtrada durante la noche. Colocar en 70% etanol y almacenar a 4oC. ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa y debe manipularse con cuidado.</li>
</ol>2. Tinción
<ol><li>Transfiera las muestras al 50% de etanol y guárdelas a temperatura ambiente durante 15 h. Reemplace el 50% de etanol por etanol al 25% y guárdelas a temperatura ambiente durante 2 h. NOTA: Esto no es necesario para la muestra Harmothoe sp. en solución de formalina del 10% (v/v) con agua de mar.</li>
	<li>Sustituya la solución por agua destilada (DW) y guarde las muestras en DW a temperatura ambiente durante 2 h. Repita este paso tres veces.</li>
	<li>Prepare un 25% de la solución de Lugol diluyendo la solución en stock (abajo) al 25% con DW. La solución de stock (solución 100% Lugol)contiene 10 g de KI y 5 g de I 2, ajustada a 100 ml con DW. NOTA: La solución Lugol es sensible a la luz, por lo que debe almacenar y manipular la solución protegida de la luz. Siga las regulaciones de cada país e institución para la manipulación de yodo y la eliminación de residuos.</li>
	<li>Decantar el DW de las muestras y verter en la solución de Lugol 25%. Mancha durante 24 h a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. Montaje en etapa
<ol><li>Preparar el 0,5% de agarosa disolviendo 500 mg de agarosa en 100 ml de DW en un matraz cónico de 250 ml en microondas (800 W, aproximadamente 1-3 min). Enfriar a unos 30-40 oC manteniendo a temperatura ambiente. ADVERTENCIA: No sobrecaliente ni selle completamente el matraz al calentar para evitar que la agarosa hierva.</li>
	<li>Monte muestras grandes como A. equina utilizando un tubo de 50 ml. NOTA: Utilice tubos de 50 ml para montar muestras grandes que no encajen en una punta azul de micropipeta de 1.000 ml.<ol>
<li>Coloque la muestra teñida en un plato de 60 mm con DW para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie.</li>
		<li>Vierta suavemente 5 ml de agarosa al 0,5% en un tubo de 50 ml y endurezca la agarosa sobre hielo. Tenga cuidado de no hacer burbujas en la agarosa.</li>
		<li>Añadir suavemente 20 ml de agarosa al tubo de 50 ml y colocar sobre hielo hasta que la agarosa comience a endurecerse. Coloque el espécimen dentro de la agarosa del 0,5% usando fórceps. Tenga cuidado de no hacer burbujas en la agarosa.</li>
		<li>Ajuste la posición y la orientación de la muestra con fórceps y endurezcan la agarosa sobre hielo.</li>
		<li>Coloque la arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque el tubo de 50 ml en la arcilla (Figura2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte muestras pequeñas como Harmothoe sp. y X. japonica usando una punta de micropipeta 'azul' de 1.000 l. NOTA: Para muestras más pequeñas, se puede utilizar una punta 'amarilla' de micropipeta de 200 l. En este caso, utilice 30 s de agarosa para el tapón y agregue 200 l de agarosa o agua destilada.<ol>
<li>Dibuje 100 sl de agarosa al 0,5% en una punta 'azul' de micropipeta de 1.000 ml y endurezca la agarosa sosteniendo la punta sobre el hielo, haciendo un tapón en la punta (Figura2B-a).</li>
		<li>Decantar la muestra manchada en un plato de 60 mm sin usar fórceps.</li>
		<li>Transfiera suavemente la muestra utilizando pinzas de anillo en otro plato de 60 mm con DW para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie.</li>
		<li>Añadir 1.000 l de agarosa o DW al 0,5% de agarosa o DW en la punta enchufada (paso 3.3.1) con un micropipeta. NOTA: Se recomienda el uso de agarosa al 0,5%, pero utilice DW para muestras frágiles o preciosas en las que se debe evitar la agarosa.</li>
		<li>Transfiera suavemente la muestra de la placa de 60 mm a la agarosa o DW en la punta enchufada utilizando pinzas de anillo.</li>
		<li>Ajuste suavemente la posición y la orientación de la muestra con una aguja peciolada o pinzas de precisión. Tenga cuidado de no hacer burbujas en el medio de montaje. Asegúrese de que la muestra es estable entre las paredes de la punta cuando DW se utiliza como medio de montaje (Figura2D-b). Coloque la punta sobre hielo para endurecer la agarosa si se utiliza como medio de montaje.</li>
		<li>Corte la punta de una nueva punta 'azul' de micropipeta de 1.000 l (Figura2B-b,c)e inserte la punta de la punta enchufada en la nueva punta.</li>
		<li>Coloque la arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque las puntas con la muestra en el interior de la arcilla (Figura2C,D). NOTA: La solución de tinción comenzará a lavar la muestra una vez que se coloca en DW, así que continúe con el siguiente paso de escaneo con prontitud.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Escaneo de MicroCT
<ol><li>Encienda el haz de rayos X a 80 kV, 100 oA.</li>
	<li>Mientras observa la imagen de transmisión de rayos X en el centro de la pantalla (Figura3A), mueva el escenario para que se pueda ver toda la muestra haciendo clic en los botones de los ejes X y Z (Figura3A)y manualmente ajustando la perilla del eje Y en la etapa de montaje (Figura3B). Establezca el contraste de la imagen para que las estructuras internas puedan observarse ajustando las condiciones de contraste (Figura3A: Contraste de imagen).</li>
	<li>Ajuste la orientación de la muestra cambiando el ángulo del tubo/punta en la arcilla (Figura 2A). Gire la etapa 90o estableciendo el eje de rotación (Figura3A) en 90 y haciendo clic en el botón de movimiento relativo (Figura3A). Realiza la misma maniobra cuatro veces para completar una rotación completa. NOTA: Apague manualmente el haz de rayos X cada vez que se abra la puerta de muestra, a menos que el sistema lo apague automáticamente.</li>
	<li>Mueva el escenario para que la muestra esté en el centro de la vista haciendo clic en el botón del eje Z (Figura3A) y ajustando manualmente la perilla del eje Y en la etapa de montaje (Figura3B). Gire el escenario 90o y haga lo mismo. Gire el escenario 360o y compruebe que la muestra está en el centro de la vista desde todas las direcciones.</li>
	<li>Mueva el escenario a lo largo del eje X hacia la fuente del haz de rayos X haciendo clic en el botón Eje X (Figura3A) para ampliar la muestra y ajustarla según sea necesario para que solo encaje en la vista (Figura3C).</li>
	<li>Gire el escenario 360o y ajuste según sea necesario para que la muestra se ajuste a la vista desde todas las direcciones.</li>
	<li>Ajuste las condiciones de escaneado como se muestra en la Tabla1.</li>
	<li>Comience a escanear; toma unos 10 minutos.</li>
</ol>5. Reconstrucción de la imagen
<ol><li>Inicie el software de accesorios del sistema microCT (consulte la Tabla de materiales)y abra los datos escaneados.</li>
	<li>Ajuste las diferencias en el eje de rotación de la muestra durante el escaneo haciendo clic en el botón de cálculo del valor de desplazamiento automático (Figura4A: cuadro verde).</li>
	<li>Ajuste la orientación de la imagen girando las flechas naranjas (Figura4B). Si se ha cambiado la orientación, repita el paso 5.2.</li>
	<li>Haga clic en la pestaña de área (Figura4C: caja magenta) y recorte las áreas donde las muestras no están presentes (Figura4C: caja amarilla).</li>
	<li>Haga clic en la pestaña de reconfiguración (Figura4D:cuadro magenta) y establezca los filtros de la siguiente manera para eliminar el ruido. Filtro de reducción de artefacto de anillo: Filtro mediano -3; Filtro de eliminación de ruido: Filtro promedio-1.</li>
	<li>Realice la reconfiguración haciendo clic en el botón de reconfiguración (Figura4D: cuadro verde).</li>
	<li>Ajuste el brillo y el contraste de la imagen estableciendo los valores en blanco y negro como valor negro 0, valor blanco 250 (Figura4D:cuadro azul).</li>
	<li>Guarde el dataset de imagen TIFF reconstruido como un TIFF de 8 bits haciendo clic en el botón Guardar. Cambie el nombre de los archivos TIFF de la siguiente manera: Date_sample_resolution (m)_number.tiff. NOTA: Los conjuntos de datos microCT originales de este estudio están disponibles en el repositorio de Figshare, doi:10.6084/m9.figshare.767083736.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Inicie el software de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales)y habilite la importación de archivos TIFF haciendo clic en el icono Base de datos (Figura5A:cuadro magenta) y desactivando el cuadro que se muestra en la Figura 5B.</li>
	<li>Haga clic en el icono de importación (Figura5C:cuadro magenta), seleccione el conjunto de datos guardado en la sección 5 y haga clic en Abrir.</li>
	<li>Haga clic en el botón Copiar vínculos (Figura5D) para importar los datos.</li>
	<li>Muestre la sección transversal 2D haciendo clic en el icono del visor 2D (Figura5C:cuadro azul).</li>
	<li>Calibre el conjunto de datos haciendo clic en la pestaña Visor 3D (Figura5E: cuadro magenta) e introduciendo el valor de resolución en el escaneo (que era 0.018 en este estudio [Figura 5F]).</li>
	<li>Haga clic en el icono de brillo/contraste (cuadro verdede la figura 5E). Ajuste el brillo y el contraste moviendo el cursor dentro de la imagen 2D mostrada y cambiando el nivel de la ventana y el ancho de la ventana (Figura5G).</li>
	<li>Compruebe otras imágenes transversales moviendo la barra de desplazamiento (figura5G: caja).</li>
	<li>Cambie la orientación de la sección transversal haciendo clic en el icono de orientación (Figura5E: cuadro azul) y compruebe las imágenes en todas las orientaciones (Figura5H).</li>
	<li>Haga clic en la imagen mostrada y elija la pestaña de exportación para almacenar imágenes de sección transversal.</li>
</ol>

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<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se sabe que los fijadores que utilizan formalina, como la solución de formalina del 10% (v/v) en el agua de mar utilizada en este estudio, preservan la morfología de diversos invertebrados marinos y se utilizan a menudo para imágenes microCT18,24,25 ,26,28,30,33. Sin embargo, las restriccio...

Los investigadores biológicos generalmente han tenido que hacer secciones delgadas y realizar observaciones por microscopía ligera o electrónica con el fin de investigar las estructuras internas de los organismos opacos. Sin embargo, estos métodos son destructivos y problemáticos cuando se aplican a especímenes raros o valiosos. Además, varios pasos en el método, como la incrustación y la sección, consumen mucho tiempo, y pueden tardar varios días en observar una muestra, dependiendo del protocolo. Además, al manipular numerosas secciones, siempre existe la posibilidad de dañar o perder algunas secciones. Las técnicas de limpieza de tejidos están disponibles para algunos especímenes1,2,3,4,5, pero todavía no son aplicables para muchas especies animales.
Para superar estos problemas, algunos biólogos han comenzado a utilizar la tomografía computarizada de rayos X de microfoco (microCT) imágenes6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15. En la TC de rayos X, la muestra es irradiada con rayos X desde varios ángulos que se generan a partir de una fuente de rayos X que se mueve alrededor de la muestra, y los rayos X transmitidos son monitoreados por un detector que también se mueve alrededor de la muestra. Los datos de transmisión de rayos X obtenidos se analizan para reconstruir imágenes transversales de la muestra. Este método permite la observación de estructuras internas sin destrucción de la muestra. Debido a su seguridad y facilidad, se utiliza comúnmente en aplicaciones médicas y dentales, y los sistemas de TC se pueden encontrar en hospitales y centros dentales de todo el mundo. Además, la TC de rayos X industrial se utiliza con frecuencia para observar muestras no médicas para inspección y metrología en el campo industrial. A diferencia de la TC médica, en la que la fuente de rayos X y los detectores son móviles, las dos partes se fijan en TC industrial, con la muestra girando durante el escaneo. La TC industrial generalmente produce imágenes de mayor resolución que la TC médica y se conoce como microCT (resolución a nivel de micrométrico) o nanoCT (resolución a nivel de nanómetro). Recientemente, la investigación con microCT ha aumentado rápidamente en diversos campos de la biología14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34.
Los estudios biológicos que utilizan CT inicialmente se dirigió a estructuras internas que consisten principalmente en tejido duro, como el hueso. Los avances en las técnicas de tinción utilizando diversos agentes químicos permitieron la visualización de tejidos blandos en diversos organismos6,7,8,9,14,15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. De estos reactivos, los agentes de contraste a base de yodo son relativamente seguros, baratos y se pueden utilizar para la visualización de tejidos blandos en diversos organismos7,14. En cuanto a los invertebrados marinos, la microCT hasido ampliamente utilizada en animales como los moluscos 6,25,32,33, anélidos18,19, 20 , 28, y arthorópodos21,23,29,31. Sin embargo, ha habido pocos informes sobre otrasphyla animales, como bryozoans 6, xenacoelomorphs26,y cnidarios24,30. En general, se han realizado menos estudios con microCT en invertebrados marinos que en los vertebrados. Una de las principales razones de este uso limitado de los invertebrados marinos es la gran diversidad observada en estos animales. Debido a sus diversos tamaños, morfologías y fisiologías, cada especie reacciona de manera diferente a diferentes procedimientos experimentales. Por lo tanto, es crucial durante la preparación de la muestra elegir el reactivo de fijación y tinción más adecuado, y establecer las condiciones en cada paso, ajustado para cada especie. Del mismo modo, también es necesario establecer las configuraciones de escaneo, como el método de montaje, voltaje, corriente, velocidad de aumento mecánica y la potencia de resolución de espacio, adecuadamente para cada muestra. Para superar este problema, es esencial un manual sencillo y comprensible que cubra todos los pasos necesarios, explica cómo se puede ajustar cada paso dependiendo de la muestra, y muestra ejemplos detallados de múltiples muestras.
En el presente estudio, describimos el protocolo de imágenes microCT paso a paso, desde la fijación de muestras hasta el análisis de datos, utilizando tres especies de invertebrados marinos. Los especímenes de la anémona de mar Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) fueron recogidos cerca de la Estación Biológica Marina misaki, Universidad de Tokio. Tenían un cuerpo esférico y suave de unos 2 cm de diámetro (Figura1A-C). También se recogieron muestras de Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) cerca de la Estación Biológica Marina de Misaki. Eran gusanos delgados de unos 1,5 cm de longitud, con chaetas duras presentes a lo largo de todo el cuerpo (Figura1D). Un espécimen Xenoturbella japonica35 (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) fue recolectado cerca del Centro de Investigación Marina Shimoda, Universidad de Tsukuba, durante el 13o Estudio Conjunto de Organismos Costeros de JAMBIO. Era un gusano de cuerpo suave que tenía aproximadamente 0,8 cm de longitud (Figura1E). Los ajustes realizados para las condiciones y configuraciones de cada muestra se explican en detalle. Nuestro estudio proporciona varias sugerencias sobre cómo realizar imágenes microCT en invertebrados marinos, y esperamos que inspire a los biólogos a utilizar este protocolo para su investigación.

<table><tbody><tr><td>Matraz Erlenmeyer de 250 ml</td><td>Corning</td><td>CLS430183</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tubo de muestreo ST-500</td><td>BIO-BIK</td><td>103010</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo de polipropileno</td><td>Greiner Bio One International</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Plato sin tratar</td><td>IWAKI</td><td>1010-060</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>Punta de grado ecológico (azul) 1000 y micro; l</td><td>BMBio</td><td>BIO1000RF</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako Industrias Químicas Puras</td><td>057-00451</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Wako Industrias Químicas Puras</td><td>061-00416</td><td></td></tr><tr><td>Yodo</td><td>Wako Industrias Químicas Puras</td><td>094-05421</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Wako Industrias Químicas Puras</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Visor DICOM OsiriX</td><td>Pixmeo SARL</td><td>OsiriX MD v10.0</td><td></td></tr><tr><td>https://www.osirix-viewer.com Paraformaldehído</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-25983</td><td></td></tr><tr><td>Aguja peciolato</td><td>AS ONE</td><td>2-013-01</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeta Pipetman P200</td><td>GILSON</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000 Micropipeta</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de potasio</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>166-03971</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de precisión 5</td><td>DUMONT</td><td>0302-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>QuickRack MultI punta de ajuste (amarillo) 200 ul</td><td>Sorenson</td><td>10660</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Feather</td><td>FA-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de anillo</td><td>NAPOX</td><td>A-26</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>sistema de imagen de micro-TC de rayos X</td><td>Comscantechno</td><td>ScanXmate-E090S105</td><td></td></tr></tbody></table>

microfoco ct de rayos x (microct) imagen de actinia equina (cnidaria), harmothoe sp. (annelida) y xenoturbella japonica (xenacoelomorpha)

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging of Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), and Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Tradicionalmente, los biólogos han tenido que depender de métodos destructivos como la sección para investigar las estructuras internas de los organismos opacos. La tomografía computarizada por rayos X de microfoco no destructivo (microCT) se ha convertido en un protocolo potente y emergente en biología, debido a los avances tecnológicos en los métodos de tinción de muestras e innovaciones en hardware de microCT, computadoras de procesamiento y datos software de análisis. Sin embargo, este protocolo no se utiliza comúnmente, como lo es en los campos médico e industrial. Una de las razones de este uso limitado es la falta de un manual sencillo y comprensible que cubra todos los pasos necesarios: recolección de muestras, fijación, tinción, montaje, escaneo y análisis de datos. Otra razón es la gran diversidad de metazoos, particularmente invertebrados marinos. Debido a los diversos tamaños, morfologías y fisiologías de los invertebrados marinos, es crucial ajustar las condiciones experimentales y las configuraciones de hardware en cada paso, dependiendo de la muestra. Aquí, los métodos de imágenes microCT se explican en detalle utilizando tres invertebrados marinos filogenéticamente diversos: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) y Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). También se proporcionan sugerencias sobre la realización de imágenes microCT en varios animales.

Realizamos imágenes microCT en A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) y X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) después de manchar las muestras con 25% de solución lugol. La tinción mejoró con éxito el contraste de las estructuras internas en todos los especímenes, permitiendo observaciones de los tejidos blandos internos (Figura6). Junto con informes anteriores6,7,<...

Aquí, los protocolos para realizar imágenes de tomografía computarizada de rayos X de microfoco (microCT) de tres animales invertebrados marinos se explican en detalle. Este estudio describe los pasos tales como la fijación de muestras, la tinción, el montaje, el escaneo, la reconstrucción de imágenes y los análisis de datos. También se proporcionan sugerencias sobre cómo se puede ajustar el protocolo para diferentes muestras.

Microfoco CT de rayos X (microCT) Imagen de Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) y Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Traditionally, biologists have had to rely on destructive methods such as sectioning in order to investigate the internal structures of opaque organisms. ...

Micro CT no se ha aplicado ampliamente a los invertebrados marinos debido a su diversidad en morfología. Nuestro método permite un fácil montaje de muestras en cualquier ángulo adecuado para su morfología. Se puede realizar con materiales comunes, como agua, arcilla y tubos, y si corresponde, a muestras con una variedad de formas, desde un gusano largo hasta una bola redonda.Demostrando el procedimiento estará Akiteru Maeno, técnico del Instituto Nacional de Genética de Japón. Para empezar, preparar el 0,5% de la agarosa disolviendo 500 miligramos de agarosa en 100 mililitros de agua destilada en un matraz cónico de 250 mililitros, y colocar el matraz en un microondas a la potencia de 800 vatios para calentar alrededor de uno a tres minutos. Enfríe el matraz a temperatura ambiente.Para montar muestras grandes que no caben en una punta azul de micropipeta de 1000 microlitros, como A.equina, coloque primero la muestra manchada en un plato de 60 milímetros con agua destilada para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie. En un tubo de 50 mililitros, vierta suavemente cinco mililitros de 0,5% de agarosa sin hacer burbujas. Coloque el tubo sobre hielo para endurecer la agarosa.Luego agregue 20 mililitros de 0.5% de agarosa al tubo, colóquelo sobre hielo hasta que la agarosa comience a endurecerse, y use fórceps para colocar el espécimen dentro de la agarosa. Ajuste la posición de la muestra para que su eje corporal sea vertical. Endurecer la agarosa sobre hielo.Coloque arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque el tubo de 50 mililitros en la arcilla. Para montar muestras pequeñas que caben en una punta azul de micropipeta de 1000 microlitros, como Harmothoe sp. y X.japonica, decantar la muestra manchada en un plato de 60 milímetros sin usar fórceps.Con pinzas de anillo, transfiera suavemente las muestras a otro plato de 60 milímetros lleno de agua destilada para lavar la solución de tinción excesiva de la superficie. A continuación, extraiga 100 microlitros de 0,5% de agarosa en una punta azul de micropipeta de 1000 microlitros y colóquela sobre hielo para endurecerla. Al manipular Harmothoe sp.añadir 1000 microlitros de 0,5% de agarosa en el enchufe de agarosa en la punta. Utilice pinzas de anillo para transferir suavemente Harmothoe sp. de la placa de 60 milímetros a la solución de agarosa en la punta.Con una aguja petiolada o pinzas de precisión, ajuste la posición y la orientación de la sp. de Harmothoe para que las chaetae no se doblen de forma antinatural. Asegúrese de que no haya burbujas presentes, y luego coloque la punta sobre hielo para endurecer la agarosa.Cuando manipule muestras frágiles como X.japonica, utilice una micropipeta para añadir 1000 microlitros de agua destilada en la punta azul con el tapón de agarosa endurecida. Coloque el X.Japonica en el agua destilada para que sea estable entre las paredes de la punta. Para muestras más pequeñas, se puede utilizar una punta amarilla de micropipeta de 200 microlitrotro.En este caso, utilice 30 microlitros de agarosa para el enchufe, y agregue 200 microlitros de agua ágaosa o destilada. A continuación, corta la punta de una nueva punta azul de micropipeta de 1000 microlitrotro e inserta la punta de la punta enchufada en la nueva punta. Coloque arcilla en la etapa de montaje de microCT y coloque las puntas con la muestra dentro en la arcilla.Inmediatamente después de montar las muestras, encienda el haz de rayos X a 80 kilovoltas y 100 microamperios. Mientras observa la imagen de transmisión de rayos X, mueva el escenario para que toda la muestra se pueda ver haciendo clic en los botones del eje X y Z, y ajustando manualmente la perilla del eje Y en la etapa de montaje. Ajuste las condiciones de contraste de la imagen para que se puedan observar las estructuras internas.Ajuste la orientación de la muestra cambiando el ángulo del tubo en la arcilla. Gire la etapa 90 grados estableciendo el eje de rotación en 90 y haciendo clic en el botón Movimiento relativo. Realiza la misma maniobra cuatro veces para completar una rotación completa.Apague manualmente el haz de rayos X cada vez que se abra la puerta de muestra, a menos que el sistema la apague automáticamente. Ahora haga clic en el botón del eje z y ajuste manualmente el mando del eje Y para mover la etapa de montaje de modo que la muestra esté en el centro de la vista. Gire el escenario 90 grados y ajuste la muestra al centro de nuevo.Gire la etapa 90 grados tres veces más y ajuste según sea necesario para asegurarse de que la muestra está en el centro de la vista desde todas las direcciones. A continuación, haga clic en el botón del eje X para mover el escenario a lo largo del eje X hacia la fuente del haz de rayos X para ampliar la muestra y ajustar según sea necesario para que solo se ajuste a la vista. Gire el escenario y ajuste según sea necesario para asegurarse de que la muestra se ajusta a la vista desde todas las direcciones.Ajuste las condiciones de escaneado y, a continuación, comience a escanear. En este experimento, se realizaron imágenes microCT en Actinia equina, Harmothoe sp. y Xenoturbella japonica después de la tinción con la solución de 25%Lugol.La tinción mejoró con éxito el contraste de las estructuras internas en todos los especímenes, permitiendo observaciones de tejidos blandos internos. Este método es aplicable a especímenes frágiles incluso con daños externos, como se puede ver en la muestra X.japonica con epidermis muy dañada. Se reconstruyó un único conjunto de datos de alta resolución de un espécimen completo para Harmothoe sp.y X.japonica a partir de múltiples escaneos realizados en diferentes partes pero superpuestas de la muestra. Asegúrese de colocar la muestra en el tubo o la punta y monte el tubo o la punta en el microCT para que no se mueva durante el escaneo. Los datos obtenidos de este procedimiento se pueden utilizar para reconstrucciones de imágenes tridimensionales, lo que permite al investigador comprender completamente la morfología interna y externa de la muestra.Todos los sistemas microCT utilizan rayos X, pero los detalles pueden ser diferentes de un sistema a otro, así que asegúrese de seguir de cerca las instrucciones de cada sistema.

microfocus-x-ray-ct-microct-imaging-actinia-equina-cnidaria-harmothoe

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Microfoco CT de rayos X (microCT) Imagen de Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) y Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha) (Video) | JoVE Journal

Microfoco CT de rayos X (microCT) Imagen de Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida) y Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

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