Name: In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende a realizar imagen de calcio in vivo en músculos de la pared corporal de C. elegans mediante optogenética y sensores de calcio codificados genéticamente. Este método permite estudiar la homeostasis de calcio y el acoplamiento excitación-contracción en un organismo modelo genéticamente tratable.

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Los autores agradecen al Dr. Alexander Gottschalk por ZX1659, la RCaMP y la canalización que contiene cepa de gusanos, el Dr. Hongkyun Kim por la cepa de gusano slo-1(eg142) y el Proyecto Nacional de Biorecursos para la cepa de gusanos sca-1(tm5339).

1. Configuración del microscopio
<ol><li>Utilice un microscopio compuesto con capacidades de fluorescencia. Para este estudio, se recogieron datos en un microscopio vertical(Tabla de Materiales)equipado con LEDs para excitación.</li>
	<li>Con el fin de visualizar adecuadamente los cambios de fluorescencia en los músculos de la pared del cuerpo, utilizar un objetivo de aumento alto.<ol>
<li>Para preparaciones diseccionadas, utilice un objetivo de inmersión en agua 60x NA 1.0(Tabla de materiales).</li>
		<li>Para preparaciones con nanoperlas, utilice un objetivo de inmersión en aceite 60x NA 1.4(Tabla de materiales). Este aumento garantiza una resolución suficiente de los músculos en el sensor de la cámara.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice una cámara de alta sensibilidad conectada al microscopio para capturar imágenes a una velocidad de fotogramas alta con el fin de realizar un seguimiento de los cambios rápidos en los niveles de calcio. Para este estudio, la imagen con un sistema sCMOS(Tabla de Materiales)capaz de imágenes de marco completo a 100 Hz, ya que los tiempos de subida para las señales Ca2+ pueden ser tan rápidos como decenas de milisegundos.</li>
	<li>Controle la adquisición de cámaras y la excitación por fluorescencia LED con un software de microadministrador que se ejecuta en ImageJ10 de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).</li>
	<li>Utilice un plugin de plataforma electrónica de código abierto, que conecta una placa externa de microcontrolador de código abierto(Tabla de materiales),para gestionar los pulsos de temporización externos para controlar la excitación de la fluorescencia. NOTA: Las salidas digitales están disponibles en los pines digitales 8 a 13, proporcionando los bits de salida 0 a 5. Estos se pueden abordar como valores base 2 de 1, 10, 100, etc. La configuración del puerto serie se indica en la Tabla 1 y está disponible en el sitio web del microadministrador(Tabla de materiales). El firmware de la placa del microcontrolador está disponible de forma similar en este sitio web.</li>
	<li>Para controlar la lógica de temporización, active el protocolo de adquisición de micromanageres en el software de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales). NOTA: Esto inicia simultáneamente una duración de fotograma de cámara preestablecida y el número de fotogramas que se activarán, así como el obturador lógico y el LED ámbar preestablecido para la excitación de la fluorescencia. En este caso, el interruptor de estado sólido LED ámbar es controlado por la salida de bit 1 del microcontrolador a través del pin 9. La cámara enmarca TTL (placa trasera hacia fuera 3 conector) activa un estimulador. Esto precisamente multiplica la activación del LED de luz azul para la activación de la cedrodrodina en un tiempo establecido después de la activación de la secuencia de imágenes.</li>
	<li>Para estimular la cedrodrodina con luz azul y registrar los cambios de RCaMP, utilice dos LED. Active la canalrodicina con un LED con una longitud de onda de emisión máxima de 470 nm y un filtro de paso de banda (455 a 490 nm) y excite RCaMP con un LED con una longitud de onda de emisión máxima de 594 nm y un filtro de paso de banda (570 a 600 nm).</li>
	<li>Con el fin de activar simultáneamente la cedredopsina y capturar los cambios en los niveles fluorescentes de RCaMP, co-ilumine ambos LED y transmita la luz a la misma trayectoria óptica utilizando un combinador de haz dicroico.</li>
	<li>Controle el tiempo de iluminación LED con interruptores de estado sólido(Tabla de materiales)controlados por señales TTL (tiempo máximo de encendido nominal, 1 ms, tiempo de apagado 0,3 ms: 0 a 90% de encendido y tiempo de apagado de < 100 s).</li>
	<li>Ajuste la intensidad del LED con las fuentes de alimentación lineales de bajo ruido controladas por corriente(Tabla de materiales).</li>
	<li>Para asegurar la sincronización precisa del LED de luz azul, actívelo directamente por pulso TTL al relé de estado sólido desde un estimulador. Programe el protocolo de estimulación de la luz azul en un estimulador(Tabla de materiales),que actúa como un temporizador preciso desde el inicio de la adquisición de imágenes hasta la iluminación LED azul. En este experimento, activa la estimulación de la luz azul después de 2 s de capturar la fluorescencia RCaMP solamente y usa un tren de 5, 2 ms pulsos de luz azul con intervalos interpulsos de 50 ms para activar channelrhodopsin. NOTA: El retardo antes de los pulsos de luz azul, la duración de los pulsos de luz azul, el tiempo entre pulsos y el número de pulsos en el tren se pueden ajustar en este punto y deben reflejar los parámetros específicos de interés experimental.</li>
</ol>2. Preparación de muestras de C. elegans y adquisición de datos
<ol><li>Para estimular ópticamente las neuronas presinápticas, obtener animales que expresan cdicrodopina en neuronas colinérgicas excitatorias, impulsados con la región promotora unc-17, y RCaMP expresado en todos los músculos de la pared del cuerpo impulsados con el promotor de mio-3 región2. NOTA: Sólo se recomienda el uso de animales con transgenes integrados y niveles robustos de fluorescencia, ya que la expresión variable en los tipos de células correspondientes puede afectar a la fiabilidad de la adquisición de datos.</li>
	<li>Hacer un stock de trabajo de la retinatrans diluyendo el polvo de la retina(Tabla de Materiales)en etanol para crear una concentración final de 100 mM y almacenar a -20 oC. Este stock de trabajo será estable durante aproximadamente un año.</li>
	<li>Crear un stock de OP50 E. coli,cultivado en medios LB, complementado con laretina trans de la culata de trabajo hecha en el paso 2.2, a una concentración final de 80 m. El volumen utilizado para el material de retina OP50+retinal dependerá del número de placas necesarias para el experimento.</li>
	<li>Placas de medios de crecimiento de nematodos de semillas (NGM) con aproximadamente 300 l de la planta de retina OP50+retinal y permiten que las placas se sequen durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Cultivar C. elegans cepas a la edad deseada en la oscuridad en placas OP50 + retinal NGM a 20 oC. Para este experimento, utilice gusanos adultos.<ol>
<li>Para el experimento utilizando la preparación diseccionada, sólo utilizar gusanos adultos gravídicos como realizar la disección en animales más jóvenes y más pequeños es extremadamente difícil. Deje a los animales en las placas de retina OP50 durante un mínimo de 3 días para una activación eficaz de la canalrodilina.</li>
	</ol></li>
	<li>Si utiliza la preparación diseccionada8,11 (Figura 1A),realice disecciones con poca luz.<ol>
<li>Coloque los animales en un plato dissecting con una base de cubreobjetos recubierta de silicona que esté llena de una solución extracelular de 1 mM Ca2+ compuesta de 150 mM de NaCl, 5 mM De KCl, 1 mM de CaCl2, 4 mM MgCl2, 10 mM de glucosa, sacarosa de 5 mM y 15 mM DEHE (pH 7.3 , -340 Osm).</li>
		<li>Pegue a los animales usando el adhesivo líquido tópico de la piel con coloración azul a lo largo del lado dorsal del gusano y haga una incisión de cutícula lateral a lo largo de la interfaz de pegamento/gusano usando agujas de vidrio.</li>
		<li>Utilice una pipeta bucal para eliminar las vísceras internas de la cavidad del gusano.</li>
		<li>Pegue el colgajo de la cutícula del animal para exponer los músculos de la pared corporal medial ventral para la toma de imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Si utiliza la preparación de nanoperlas (Figura 1B)<ol>
<li>Hacer una solución fundida de agarosa al 5% utilizando ddH2O a un volumen final de 100 ml.</li>
		<li>Usando una pipeta Pasteur, coloque una gota de solución de agarosa fundida en un portaobjetos de vidrio e inmediatamente coloque un segundo tobogán de vidrio sobre la parte superior, perpendicular a la primera, usando una presión suave para crear una almohadilla de agarosa uniforme. Retire la diapositiva superior antes de usarla.</li>
		<li>Añadir aproximadamente 4 l de nanoperlas de poliestireno(Tabla de materiales)al centro de la almohadilla de agarosa.</li>
		<li>En la luz baja, recoger 4-6 C. elegans en la solución de nanoperla, asegurándose de que los animales no se coloquen uno encima del otro, y coloque cuidadosamente un cubreobjetos en la parte superior.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque la diapositiva o la placa de disección preparada en el microscopio, y busque y concéntrese en un gusano usando aumento 10x e iluminación de campo brillante tenue.</li>
	<li>Cambie a aumento de 60x y excitación por fluorescencia RCaMP para identificar un músculo de pared del cuerpo ventromedial que es anterior a la vulva y en el plano focal correcto. NOTA: Los músculos anteriores a la vulva se seleccionan ya que reflejan los músculos comúnmente estimulados en experimentos de electrofisiología.</li>
	<li>Cambie la ruta de la imagen del ocular a la cámara extrayendo el interruptor y haciendo clic en Vivir dentro del software de adquisición de datos(Tabla de materiales). NOTA: Asegúrese de que la vía de estimulación de la luz azul esté apagada en este punto para asegurarse de que la canalrodrodina no se active antes de capturar imágenes.</li>
	<li>Enfoque la imagen dentro del software de adquisición de datos utilizando el enfoque fino del microscopio.</li>
	<li>Una vez que el músculo está claramente enfocado, apague la imagen en vivo deshaciendo clic en el botón Live.</li>
	<li>Haga clic en el botón ROI en el software de adquisición de datos y cree una caja alrededor del músculo en el que se está centrando.</li>
	<li>En el estimulador, encienda la vía de estimulación de la luz azul que se ha programado previamente en el paso 1.10.</li>
	<li>Haga clic en Adquirir en el software de imágenes para capturar la imagen a través de la cámara CMOS. Para ello, establezca el tiempo de exposición a 10 s con 1.000 fotogramas y 2x binning.</li>
</ol>3. Análisis de datos
<ol><li>Abra el archivo de datos en el softwarede imágenes (Tabla de materiales)y, utilizando la herramienta Polígono, delinee el músculo de interés. Este es el ROI.</li>
	<li>Ir a la imagen de la imagen de la imagen de la imagen de Pilas ? Trazar el perfil del eje Z y exportar los puntos de datos resultantes en el software de hoja de cálculo(Tabla de materiales). Esta función traza el valor medio de selección de ROI frente al punto de tiempo.</li>
	<li>Mueva el ROI muscular creado con la herramienta Polígono fuera del animal para obtener una medición de fluorescencia de fondo utilizando los pasos descritos en 3.2. Exporte los datos resultantes al libro de hojas de cálculo.</li>
	<li>En el libro de hoja de cálculo, reste los valores de fluorescencia de fondo de los valores de fluorescencia muscular en cada punto de tiempo. Esto proporciona la señal fluorescente restada de fondo.</li>
	<li>Promedio del fondo restado fluorescencia para los primeros 2 s de puntos de datos. Esto dará la medición de fluorescencia basal, F.</li>
	<li>Utilice la medición de fluorescencia basal para calcular el nivel de fluorescencia normalizado en cada punto de tiempo. Para ello, utilice la ecuación (F/F)+1. •F representa (F(t)-F), donde F(t) es la medición de fluorescencia en un punto de tiempo dado y F es el valor de referencia. El +1 se agrega como un desplazamiento del eje Y.</li>
	<li>Repita los pasos 3.2-3.6 para cada imagen muscular que se recopile. El uso de células musculares individuales o múltiples por imagen es a discreción del investigador. La n del experimento se puede determinar realizando un análisis de potencia.</li>
	<li>Utilice los datos procesados de los pasos 3.2-3.6 para hacer un seguimiento de los valores fluorescentes en el software de gráficos de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).</li>
	<li>A partir de este rastro, medir la cinética del transitorio de calcio, como el aumento de tiempo pico y la mitad del tiempo de descomposición, utilizando las herramientas proporcionadas en el software de gráficos según las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las GECIs son una herramienta poderosa en neurobiología de C. elegans. El trabajo anterior ha utilizado técnicas de diagnóstico por imágenes de calcio para examinar una amplia variedad de funciones tanto en las neuronas como en las células musculares, incluidas las respuestas sensoriales y conductuales, con diversos métodos de estimulación. Algunos estudios han utilizado estímulos químicos para desencadenar transitorios de calcio en las neuronas ash sensoriales22,<sup class="xr...

Este artículo presenta métodos para la toma de imágenes de calcio in vivo de los músculos de la pared corporal de C. elegans utilizando estimulación neuronal optogenética. El emparejamiento de un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) con luz azul desencadenó la despolarización neuronal y proporciona un sistema para observar claramente los transitorios de calcio postsináptico salidados. Esto evita el uso de estimulación eléctrica, permitiendo un análisis no invasivo de mutantes que afectan a la dinámica de calcio postsináptica.
Los GECI de un solo fluoróforo, como GCaMP, utilizan una sola molécula de proteína fluorescente fusionada al dominio M13 de la quinasa de cadena ligera de miosina en su extremo N-terminal y calmodulina (CaM) en el C-terminus. Tras la unión al calcio, el dominio CaM, que tiene una alta afinidad por el calcio, sufre un cambio conformacional que induce un cambio conformacional posterior en la proteína fluorescente que conduce a un aumento en la intensidad de la fluorescencia1. La fluorescencia GCaMP se excita a 488 nm, por lo que no es adecuado para ser utilizado en combinación con la canalrodilina, que tiene una longitud de onda de excitación similar de 473 nm. Por lo tanto, con el fin de acoplar las mediciones de calcio con la estimulación de la canalroditina, la proteína fluorescente verde de GCaMP debe ser reemplazada por una proteína fluorescente roja, mRuby (RCaMP). El uso del músculo rCaMP expresado, en combinación con la expresión de la neurona motora colinérgica de la canalrodiasina, permite estudios en la unión neuromuscular del gusano (NMJ) con el uso simultáneo de la optogenética y la imagen funcional dentro del mismo animal 2.
El uso de la cedrodonina evita la necesidad de la estimulación eléctrica para despolarizar las uniones neuromusculares de C. elegans,lo que sólo se puede lograr en preparaciones diseccionadas, haciendo así esta técnica más fácil de emplear y más precisa cuando se dirige a tejidos específicos. Por ejemplo, channelrhodopsin se ha utilizado previamente en C. elegans para activar de forma reversible neuronas específicas, lo que conduce a la activación robusta de las neuronas excitatorias o inhibitorias3,4. El uso de la despolarización estimulada por la luz también elude el problema del daño neuronal debido a la estimulación eléctrica directa. Esto proporciona una oportunidad para examinar los efectos de muchos protocolos de estimulación diferentes, incluyendo estimulaciones sostenidas y repetidas, en la dinámica de calcio postsináptica4.
La naturaleza transparente de C. elegans lo hace ideal para el análisis funcional de imágenes fluorescentes. Sin embargo, al estimular las neuronas de acetilcolina excitatorias en el NMJ, se espera que los animales respondan con una contracción muscular inmediata4,haciendo que la inmovilización de los gusanos crítico para visualizar cambios discretos de calcio. Tradicionalmente, se han utilizado agentes farmacológicos para paralizar a los animales. Uno de estos fármacos utilizados es levamisol, un agonista del receptor de acetilcolina colinérgico5,6,7. Dado que el levamisol conduce a la activación persistente de un subtipo de receptores musculares excitatorios, este reactivo no es adecuado para el estudio de la dinámica muscular de calcio. La acción del levamisol induce la despolarización postsináptica, elevando el calcio citosólico y ocluiendo observaciones después de la estimulación presináptica. Para evitar el uso de medicamentos paralizantes, examinamos dos métodos alternativos para inmovilizar C. elegans. Los animales fueron pegados y luego diseccionados abiertos para exponer los músculos de la pared del cuerpo, similar al método de electrofisiología C. elegans NMJexistente 8,o nanoperlas se utilizaron para inmovilizar animales intactos9. Ambos procedimientos permitían las mediciones reproducibles del reposo y evocaban transitorios musculares de calcio que eran fácilmente cuantificables.
Los métodos en este artículo se pueden utilizar para medir los niveles basales de calcio citosólico y transitorios en las células musculares de la pared del cuerpo postsináptico en C. elegans. Se proporcionan ejemplos de datos que emplean las dos técnicas de inmovilización diferentes. Ambas técnicas aprovechan la optogenética para despolarizar las células musculares sin el uso de estimulación eléctrica. Estos ejemplos demuestran la viabilidad de este método en la evaluación de mutaciones que afectan el manejo de calcio postsináptico en los gusanos y señalan los pros y los contras de los dos enfoques de inmovilización.

<table><tbody><tr><td>todo-trans retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2500</td><td>Necesario para la excitación del canal rodopsina</td></tr><tr><td>Ámbar LED</td><td></td><td></td><td>Iluminación RCaMP</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>Mouser</td><td>782-A000066</td><td>Controles Iluminación de fluorescencia Iluminación</td></tr> de <tr><td>canalizaciónRodopsina</td><td>LED azul</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX51WI microscopio Olympus</td><td></td><td></td><td>Microscopio compuesto de estado fijo</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación lineal de bajo ruido controlada por corriente</td><td>Ametek</td><td>Sorenson</td><td>Controles Intensidad del LED</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>Wavemetrics</td><td>Wavemetrics.com</td><td>Software de gráficos</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov</td><td>software de procesamiento de imágenes</td></tr><tr><td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objetivo de inmersión en agua para Preparación diseccionada</td></tr><tr><td>Master-8 Estimulador</td><td>A.M.P.I</td><td></td><td>Temporizador maestro para la adquisición de imágenes y la iluminación LED</td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td></td><td>micro-manager.org</td><td>Controla la adquisición de la cámara y la excitación de los LED</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Microsoft Hoja de cálculo Software</td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 CMOS</td><td>Cámara pco.</td><td>4.2</td><td>Cámara de alta velocidad</td></tr><tr><td>PlanApo N 60x aceite NA 1.4</td><td>Olympus</td><td></td><td>Objetivo de inmersión en aceite para la preparación de nanoperlas</td></tr><tr><td>Microesferas de poliperlas</td><td>Polybead Polysciences, Inc.</td><td>00876-15</td><td>Para</td></tr><tr><td>interruptores de estado sólido</td> de inmovilización por gusano <td>Sensata Technologies</td><td>Crydom</td><td>CMX100D6 Controla la temporización de la iluminación LED</td></tr><tr><td>Cepa transgénica, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td>SY1627</td><td>Canal neuronal excitatoriorodopsina y músculo de la pared corporal Línea de gusano que expresa RCaMP con alelo mutante SERCA</td></tr><tr><td>Cepa transgénica, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Richmond Lab</td><td></td><td>Canal neuronal excitatoriorodopsina y músculo de la pared corporal Línea de gusano que expresa RCaMP con alelo mutante de canal de potasio BK activado por calcio</td></tr><tr><td>Cepa transgénica, [zxIs6{Punc17::chop-2 (h134R)::yfp,lin-15(+)}; Pmyo3::RCaMP35]</td><td>Gottschalk Lab</td><td>ZX1659</td><td>Canal neuronal excitatoriorodopsina y músculo de la pared corporal RCaMP que expresa línea de gusano</td></tr></tbody></table>

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

El organismo modelo C. elegans proporciona un excelente sistema para realizar imágenes de calcio in vivo. Su cuerpo transparente y su manipulabilidad genética permiten la expresión específica de sensores de calcio codificados genéticamente. Este protocolo describe el uso de estos sensores para la toma de imágenes in vivo de la dinámica de calcio en células objetivo, específicamente los músculos de la pared corporal de los gusanos. Mediante la utilización de la co-expresión de la carredopsina presináptica, la estimulación de la liberación de acetilcolina de las neuronas motoras excitatorias se puede inducir utilizando pulsos de luz azul, lo que resulta en la despolarización muscular y cambios reproducibles en el calcio citoplasmático Niveles. Dos técnicas de inmovilización de gusanos se discuten con diferentes niveles de dificultad. La comparación de estas técnicas demuestra que ambos enfoques preservan la fisiología de la unión neuromuscular y permiten la cuantificación reproducible de los transitorios de calcio. Al combinar la optogenética y las imágenes funcionales de calcio, los cambios en el manejo del calcio postsináptico y la homeostasis se pueden evaluar en una variedad de orígenes mutantes. Los datos presentados validan ambas técnicas de inmovilización y examinan específicamente las funciones de la C. elegans sarco(endo)plasmático DE calcio reticular ATPase y el canal de potasio BK activado por calcio en la regulación del calcio muscular de la pared corporal.

Esta técnica evaluó los cambios en los mutantes que se cree que afectan el manejo del calcio o la despolarización muscular. Se visualizaron los niveles basales de fluorescencia y los transitorios fluorescentes y se evaluó la cinética de calcio y calcio citosólico en reposo dentro del músculo. Es importante que los animales fueron cultivados en la retina trans durante al menos tres días para asegurar la incorporación exitosa de la retina, activando así posteriormente la canalrodia<strong c...

Este método proporciona una manera de acoplar optogenéticas y sensores de calcio codificados genéticamente para crear imágenes de los niveles basales de calcio citosólico y cambios en los transitorios de calcio evocados en los músculos de la pared corporal del organismo modelo C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Este protocolo proporciona dos métodos para movilizar a C.Elegans para realizar imágenes de calcio in vivo de los músculos de la pared del cuerpo. Este método puede ayudar a responder preguntas relacionadas con la homeostasis de calcio y el manejo del calcio, y una sinapsis accesible en organismos genéticamente manejables. Esta técnica puede proporcionar una mejor comprensión de los mecanismos que regulan la homeostasis de calcio muscular, y por lo tanto puede ser importante en la identificación de condiciones o vías moleculares que afectan el acoplamiento de contracción de excitación a través de la mala regulación del ciclo de calcio.Estos métodos pueden proporcionar información sobre áreas de investigación, incluyendo, pero no limitado también, neurobiología, biología del desarrollo y biología celular. Estas técnicas podrían adaptarse para estudiar una variedad de tipos celulares y C.elegans, otros nematodos relacionados, así como larvas de filsafat. La demostración visual de este método es fundamental para que el experimentador pueda entender la técnica de disección y ser capaz de evaluar con precisión los transitorios de calcio de animales correctamente inmovilizados.Comience c

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Investigación

JoVE Journal

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Bioquímica

Este video presenta los conceptos detrás de las imágenes de calcio e incluye un protocolo de ejemplo para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de gusanos contenidos en pocillos de agarosa moldeados.

Imágenes de calcio: un método para visualizar la actividad neuronal en C. elegans vivos

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Imágenes de calcio en neuronas individuales que regulan el comportamiento de puesta de huevos en Caenorhabditis elegans

Fuente: Doser, R., et al. Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Este video demuestra imágenes in vivo del flujo de calcio subcelular en las neuronas del cordón nervioso ventral de cepas transgénicas de Caenorhabditis elegans. Se emplean dos indicadores de calcio distintos: un indicador citoplasmático en una cepa y un indicador mitocondrial en otra. Las neuronas se observan bajo un microscopio de fluorescencia para monitorear los cambios en tiempo real...

Imágenes de la dinámica subcelular del calcio en neuronas de Caenorhabditis elegans

Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y...

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

La imagen del comportamiento y la actividad neuronal a largas escalas de tiempo sin inmovilización del animal es un requisito previo para comprender el comportamiento. Las imágenes de cámaras microfluídicas de agarosa (AMI) se pueden utilizar para obtener imágenes de la actividad y el comportamiento neuronal de todas las etapas de la vida de Caenorhabditis elegans.

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Este protocolo describe el uso de genéticamente codificados Ca2 + periodistas a registramos cambios en la actividad neuronal en comportarse gusanos Caenorhabditis elegans .

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

Aquí presentamos un protocolo de calcio imagen señalización en poblaciones individuales de tipos de células en la Unión neuromuscular murino.

Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

Aquí se informa un sistema para imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans que se comportan libremente con vibración bien controlada y no localizada. Este sistema permite a los investigadores evocar vibraciones no localizadas con propiedades bien controladas a un desplazamiento a nanoescala y cuantificar las corrientes de calcio durante las respuestas de C. elegans a las vibraciones.

Imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada y bien controlada

Las espinas dendríticas son características celulares importantes del sistema nervioso. Aquí se describen los métodos de imágenes en vivo para evaluar la estructura y función de las espinas dendríticas en C. elegans. Estos enfoques apoyan el desarrollo de pantallas mutantes para genes que definen la forma o función de la columna dendrítica.

Imágenes de espinas dendríticas en Caenorhabditis elegans

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Aquí, presentamos protocolos y herramientas para visualizar el calcio durante la fertilización y la embriogénesis temprana utilizando un reportero de calcio codificado genéticamente expresado en la línea germinal del nematodo modelo C. elegans.

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Aprende a realizar imagen de calcio in vivo en músculos de la pared corporal de C. elegans mediante optogenética y sensores de calcio codificados genéticamente. Este método permite estudiar la homeostasis de calcio y el acoplamiento excitación-contracción en un organismo modelo genéticamente tratable.

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

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