Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

El informe principal es realmente la importancia del estrés de localizar con precisión la región de frecuencia específica de la membrana basilar en la mayoría de los modelos, donde se pueden analizar los números de sinapsis alterados y la función. La localización coclear de las regiones de frecuencia específicas se realiza de forma fiable utilizando mapas de frecuencias de lugar junto con los datos de cocleación. El microscopio proporciona información sobre varios estudios de investigación.

Apoya la noción de que la neuropatía coclear es los eventos iniciales primarios específicamente anteriores a la pérdida auditiva, tinnitus e hiperacusis. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del de la dedo del diente en un ratón macho C57 negro 6J adulto de ocho semanas anestesiado. Coloque el ratón en una almohadilla de calor de 37 grados centígrados en una habitación blindada eléctrica y acústicamente.

A continuación, coloque un electrodo subdérmico de grabación de aguja de calibre 20 milímetros 28, con la profundidad de tres milímetros debajo de la piel en el vértice del cráneo. Un electrodo de referencia en la región parótida ipsilateral, debajo del pinna del oído medido y un electrodo de tierra en la región parótida contralateral. Coloque un altavoz de campo cerrado equipado con un tubo de plástico de dos centímetros con una punta en forma de cono junto al ratón y ajuste la punta en el canal auditivo externo.

Para una respuesta de tronco encefálica auditiva, o grabación ABR, genere pips de tono en niveles de presión sonora decrecientes de 90 a 10 decibelios, en cinco a 10 decibelios de los pasos de nivel de presión sonora. Durante este paso, las respuestas se amplifican, filtran y promedian. En cada frecuencia, determine el umbral ABR, que es el nivel mínimo de presión sonora que da lugar a una grabación confiable ABR con una o más ondas distinguibles que se pueden identificar claramente mediante la inspección visual.

Después de la grabación ABR, exponga la bulla desde el lado ventral y abra la bulla con tijeras afiladas para acceder a la cóclea. Usando fórceps finos, retire los huesos temporales y corta la arteria de las estapas. A continuación, retire las estapas de la ventana ovalada y rompa la membrana redonda de la ventana.

Gire suavemente la punta de una aguja de calibre 13 milímetros 27 para hacer un pequeño agujero en el ápice de la cóclea, antes de usar una pipeta con punta fina para lavar suavemente el 4%paraformaldehído a través de la ventana en los espacios perilófaméticos. A continuación, enjuague los huesos tres veces durante cinco minutos por lavado con PBS molar 0.1 frío por lavado. Seguido de descalcificación de los huesos con 10%EDTA durante cuatro horas a temperatura ambiente y 20 rotaciones por minuto en una coctelera horizontal.

Al final de la incubación, transfiera un hueso temporal descalcificado a PBS 0.1 molar fresco bajo un microscopio diseccionador. Utilice 3 y 5 fórceps Dumont y una aguja de calibre 27 para diseccionar las regiones de cóclea apical, media y basal a su vez. Utilice una cuchilla de afeitar para hacer una pequeña serie de cortes a lo largo del ligamento espiral y eliminar la membrana tectorial y la membrana de Reissner.

Diseccionar aún más el epitelio auditivo restante, incluido el limbo espiral, en giros cocleares individuales para preparaciones de montaje completo. A continuación, utilice el objetivo de aceite 40X de un microscopio de luz para medir la longitud de la membrana basilar con una escala de 250 micrómetros colocada en la pieza ocular. Se puede ajustar a lo largo de la estereocilia de las células internas del cabello.

Después de la disección, coloque cada giro coclear en tubos individuales de centrífuga de 2,5 mililitros. Bloquee cualquier unión no específica con 10% de suero de cabra en PBS en 0.1%Triton X-100 durante una hora a temperatura ambiente en un rotador. Al final de la incubación, utilice la punta de pipeta de 200 microlitrotros para extraer la solución bajo un microscopio de disección.

Incubar los especímenes con los anticuerpos primarios de interés diluidos en 5% de suero de cabra y PBS en 0.1%Triton X-100 durante la noche a 4 grados Celsius en un rotador. A la mañana siguiente, enjuague las muestras de tejido tres veces durante cinco minutos con PBS molares fríos por lavado para eliminar cualquier anticuerpo primario residual. A continuación, etiquete los especímenes con los anticuerpos secundarios apropiados diluidos en suero de cabra al 5% en PBS en 0,1%Tritón X-100 durante dos a tres horas a temperatura ambiente en el rotador, protegido de la luz.

Al final de la incubación, lave las muestras tres veces con 0,1 PBS molares como se ha demostrado y transfiera las muestras a placas individuales de 35 milímetros que contengan 0,1 PBS molares. Coloque una gota de medio de montaje suplementado con DAPI en la corredera y transfiera las muestras de PBS al medio de montaje. Coloque un borde de un resbalón de cubierta en cada diapositiva y suéltelo para dejar que los resbalones de la cubierta caigan suavemente.

A continuación, seque los portaobjetos en una caja deslizante a cuatro grados centígrados durante la noche. Para crear imágenes de las muestras, utilice un microscopio confocal con los láseres apropiados y una lente de inmersión de aceite de alta resolución 63X para adquirir pilas Z confocales de ocho micrómetros de cada giro coclear. Para los recuentos de puncta sináptica, establezca las pilas Z con el tamaño de paso de 0,3 micrómetros para abarcar toda la longitud de las células internas del cabello, asegurando que todo el puncta sináptico se pueda crear una imagen y combine las imágenes puncta que contienen en una pila Z para obtener la proyección de acceso Z.

Importe las imágenes combinadas en un programa de software de procesamiento de imágenes adecuado. Divida los recuentos totales sinápticos en cada pila Z en regiones de frecuencia específicas por el número de células pilosas internas positivas DAPI para calcular el número de puncta sináptica para cada célula. En cada región de frecuencia específica, promedia toda la puncta sináptica en tres imágenes de diferentes campos microscópicos, que contienen de nueve a 11 células pilosas internas.

Para visualizar mejor la arquitectura citoesquelética y la localización sináptica, utilice la herramienta de cepillo para evaluar visualmente la estructura sináptica y la distribución de las células internas individuales del cabello. Para inspeccionar la yuxtaposición de cintas presinápticas y parches de receptores postsinápticos, utilice la herramienta de marquesina rectangular extraer el espacio de voxel alrededor de las cintas y utilizar el corte de imágenes para aislar las cintas individuales. A continuación, haga clic en el tamaño de la imagen y la imagen para adquirir una matriz de miniaturas de estas proyecciones en miniatura que se pueden utilizar para identificar sinapsis emparejadas frente a cintas huérfanas.

Los diez ratones en este experimento representativo exhibieron umbrales ABR en respuesta a ráfagas de tono que oscilan entre 25 y 70 decibelios por nivel de presión sonora dependiendo de la frecuencia del estímulo. El umbral auditivo de este experimento fue más bajo, con un valor de 16 kilohercios, correspondiente a aproximadamente el 43% de la distancia desde el ápice coclear, lo que sugiere que la sensibilidad acústica se reduce significativamente en otras regiones cocleares. Las monturas enteras del epitelio auditivo se diseccionan en tres piezas y las longitudes se miden y se convierten en su porcentaje de distancia desde el ápice coclear.

La ubicación de frecuencia en la membrana basilar de cada giro coclear se calcula utilizando la función logarítmica. En los oídos normales de ratones adultos, la inmunosumanidad revela pares yuxtapuestos de cintas sinápticas y parches receptores de glutamato. Estudio de la superficie de la membrana basolateral de las células internas del cabello, con ocho a 20 pares por célula.

Aunque la gran mayoría de los puncta aparecen como pares yuxtapuestos en oídos normales, las cintas huérfanas se observan con poca frecuencia con aumentos altos. El número de sinapsis de cinta de células capilares internas es más alto en la región de 16 kilohercios y disminuye significativamente a medida que aumenta la distancia desde esta ubicación. Lo más importante a recordar durante este procedimiento es que uno debe garantizar la integridad de la membrana basal coclear.

Tenemos que enfatizar la precisión hasta que se alcance la competencia técnica. Después de este procedimiento, se puede realizar la terapia génica para responder si la neuropatía coclear puede ser reparada por esta medida. Esta medida es una técnica más amplia para explorar la neuropatía coclear, que si los eventos iniciales primarios se asocian con tener pérdida de audición, tinnitus e hiperacusis.