Name: Aislar maligno y no maligno de células B lck:eGFP pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a aislar células B malignas y no malignas de pez cebra lck:eGFP para estudiar leucemia linfoblástica aguda. Este método permite analizar el desarrollo de linfocitos y comprender los mecanismos del cáncer pediátrico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a Megan Malone-Perez para el cuidado del pez cebra y la base de cytometry del flujo OUHSC. Este trabajo fue financiado por becas del Hyundai Hope sobre ruedas, el centro de Oklahoma para el avance de la ciencia y la tecnología (HRP-067), un premio de proyecto piloto de INBRE NIH/NIGMS (P20 GM103447). JKF sostiene el E.L. & Thelma Gaylord Cátedra en hemato-oncología pediátrica de la Fundación del Hospital de los niños.

Todos los procedimientos de pez cebra fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en el Universidad de Oklahoma Health Sciences Center.
1. aislar no malo B y los linfocitos T de transgénicos lck:eGFP pescado
<ol><li>Anestesiar los peces Metanosulfonato de 0.02% (MS-222) en el agua del sistema de pescado.</li>
	<li>Examinar el pescado de 2 a 6 meses para thymi fluorescente, que se encuentran en el aspecto dorsomedial de la cavidad branquial del pez cebra y otros teleósteos14. Usar un microscopio de epifluorescencia (470/40 longitud de onda de excitación y emisión de 525/50 filtro) para detectar la GFP.</li>
	<li>Prepara con antelación 50 mL de 1 filtro esterilizado x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) que contiene 1% fetal bovino suero y 1% penicilina-estreptomicina (clasificación media). Sin utilizar medios de clasificación pueden almacenarse a 4 ° C hasta por 2 meses.</li>
	<li>Eutanasia a los peces colocando en un vaso de precipitados que contiene 0.2% Metanosulfonato de aproximadamente 5 minutos, seguido por la inmersión del baño de hielo. Confirman muerte por el cese del movimiento opercular (gill).</li>
	<li>Coloque el pescado sacrificaron en una placa Petri y diseccionar órganos linfoides de interés, utilizando el microscopio de fluorescencia para disecar la GFP+ thymi14y ajustes de microscopía de campo brillante disección del riñón médula y bazo15. Resultados aquí presentados fueron obtenidos usando 3 meses pescado. Proporciones de linfocitos y números absolutos varían por edad y genotipo (véase discusión para más detalles).</li>
	<li>Colocar cada órgano disecado en un tubo de 1,5 mL conteniendo 500 μl de fría clasificación de los medios de comunicación.</li>
	<li>Homogeneizar el tejido sobre el hielo usando un homogeneizador de micro tubo de mortero.</li>
	<li>Pasar el tejido homogeneizado a través de un filtro de malla de 35 μm para generar una suspensión unicelular. Mantener las células en hielo hasta su análisis.</li>
</ol>2. aislamiento de linfocitos malignos de doble transgénico rag2:hMYC; lck:eGFP pez cebra
<ol><li>
Microscópico a partir en 2-4 meses, pantalla rag2:hMYC; Lck:EGFP pescado de patrones anormales de la GFP. Nota: las células de B son GFPlo en el fondo de lck:eGFP , B-todo requiere práctica de reconocer; T-todo es obvio, porque las células T son GFPHola. En consecuencia, el rag2:hMYC, lck:eGFP línea doble transgénico tiene dos fenotipos: brillantemente fluorescentes T-ALL, que generalmente se derivan del timo y extender en el cuerpo y débilmente fluorescente-todas.<ol>
<li>Usando un microscopio de fluorescencia, los peces utilizando la configuración de "baja exposición" (200 ms, ganancia de 2,4 x) identificar brillante T-ALL (figura 1A) y "exposición" de la pantalla (1,5 s, 3,4 x ganancia) para identificar dim-todas (figura 1A). Controles de peso y pescado pre leucémico tiene GFP localizada únicamente en el timo (figura 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestesiar y examinar el pescado tal como se describe en los pasos 1.1 – 1.2.</li>
	<li>Categorizar los peces basados en la medida de la fluorescencia de GFP, usando un simple sistema de tres Categoría: Nota: Nivel 1: Fluorescencia aparece como un tumor tímico con sólo limitada propagación local. Nivel 2: Fluorescencia aparece más allá del timo, que < 50% del cuerpo. Nivel 3: Fluorescencia se extiende más allá del 50% del cuerpo.</li>
	<li>Separe el pescado con todos de los que no tienen cáncer. Monitor pre leucémico peces (es decir, sin tumores GFP+ ) una vez cada mes para el desarrollo de nuevo todo. ~ 9 meses, todos rag2:hMYC, lck:eGFP peces desarrollan T-ALL, B-ALL, o ambos.</li>
	<li>Para el aislamiento de la célula T o B todos, seleccione nivel 3 peces (todo con > 50% del cuerpo), que producen más de 2 x 106 todas las células y por lo general muchos más.</li>
	<li>Eutanasia a los peces como en el paso 1.4. Nota: Existen dos métodos para obtener todas las células: cuerpo entero de homogeneización y una lavado peritoneal técnica16. Los métodos difieren en el número absoluto de células recogidas para la clasificación, y así, las cantidades de FACS tiempo necesario y coste (véase discusión para más detalles).</li>
	<li>Para cualquiera de los métodos, primero coloque el pescado sacrificaron en una placa Petri y utilizando una hoja de afeitar, retirar la cabeza incluyendo la región tímica. Esto puede ser procesado por separado, si lo desea, o tinción histológica.</li>
	<li>
Método de lavado peritoneal
	<ol>
<li>Con una pipeta P1000, lavar la cavidad peritoneal de pescado con 500 μl de fría clasificación de los medios de comunicación, recoger las células y los medios de comunicación en un tubo de 5 mL.</li>
		<li>Utilizando una nueva pipeta, inyectar un adicional 200 – 300 μL de medios clasificación frío en la cavidad del cuerpo. Entonces, utilizando la punta de la pipeta, aplique presión suave sobre el cuerpo de los pescados para extruir las células fuera de la cavidad del cuerpo. Recoger este medio y añadir al tubo de 5 mL.</li>
		<li>Repita el paso 2.8.2 2 – 3 veces. Mantener las células recogidas en la clasificación de los medios de comunicación en el hielo.</li>
		<li>Filtrar la suspensión de células aunque una malla de 35 μm filtro antes de citometría de flujo/FACS y mantener las células en hielo hasta su análisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Homogeneización de todo el cuerpo
	<ol>
<li>Después de quitar la cabeza de pescado, coloque el cuerpo en un tubo de 1,5 mL que contiene 200 μL de la clasificación de los medios de comunicación.</li>
		<li>Homogeneizar el cuerpo, utilizando un homogeneizador de micro tubo de mortero.</li>
		<li>Agregar un adicional de 300 μL de fría clasificación de los medios de comunicación. Filtrar la suspensión de células, aunque un filtro de malla de 35 μm. Agregue media clasificación para lavar todas las células a través del filtro, hasta que quede sólo restos de tejido en el filtro. Mantener las células en hielo hasta su análisis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cytometric del análisis de los linfocitos B normales o malignas
<ol><li>Definirse el análisis cytometric del flujo y parámetros de FACS según manual del fabricante.</li>
	<li>
Adquirir el número deseado de eventos inicialmente caracterizar la muestra. Analizar 1 x 104 5 x 104 eventos antes de la clasificación para determinar puertas específicas para pasos posteriores de clasificación.
	<ol>
<li>Determinar puertas: definir puertas célula linfocito y progenitoras utilizando forward scatter (FSC) y parámetros de scatter (SSC) de lado, excepto los detritos celulares (figura 2A-C)17. FSC y SSC corresponden al diámetro de la célula y granularidad, respectivamente. Nota: GFP–, GFPloy GFPHola las células difieren doble 10 a 100 en cuanto a su intensidad de fluorescencia de GFP, haciendo separación de estas poblaciones sencillas (figuras 2-5). Muertos viven discriminación puede ser evaluada en este punto con yodo de propidio (PI) o 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) tinción de viabilidad. Experimentos anteriores con PI demuestran típicamente > 95% de viabilidad de células GFP+ después de FACS.</li>
		<li>Excluir los dobletes de la célula, según los parámetros de la máquina de FACS se utiliza.</li>
		<li>Dentro de las puertas linfoides o precursor, determinar el número y porcentaje de células GFP+ .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uso ficoeritrina (PE) e intensidades GFP, definir puerta para GFP– vs GFPlo vs células GFPHola . Nota: Células B presentan fluorescencia de GFP dim y las células T muestran brillante GFP en líneas lck:eGFP . Muchos órganos linfoides o muestras tumorales contienen ambas poblaciones de GFP+ . B linaje células, B-todo son GFPlo y células de linaje T, T-todo son GFPHola. Definir puertas distinguir entre GFP–, GFPloy GFPHola las células y recoger por separado las poblaciones(Figura 2A-C, Figura 3A-C, Figura 4A y figura 5A).</li>
	<li>Ordenar cada población celular en tubos de polipropileno de diferentes 15 mL que contiene 2 mL de la clasificación de los medios de comunicación, o directamente en tubos de 1,5 mL diferentes con un tampón adecuado para análisis adicionales (por ejemplo, ARN, ADN o extracción de proteínas, allo-trasplante, etcetera).</li>
	<li>Mantener las células purificadas en hielo antes de mayores análisis.</li>
</ol>

<ol><li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li>
<li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage%2C+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).</li>
<li>Schorpp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+functions+of+Ikaros+in+vertebrate+lymphocyte+development%3A+genetic+evidence+for+distinct+larval+and+adult+phases+of+T+cell+development+and+two+lineages+of+B+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish.</a> Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li>
<li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li>
<li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li>
<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC%3A+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia%3A+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li>
<li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Desarrollamos y proporcionar un protocolo para aislar las células de B de pez cebra transgénico lck:eGFP , añadir esto a otros modelos de D. rerio con linaje B etiquetas3,4. Sorprendentemente, la identificación de GFPlo B células en esta línea pasó desapercibida desde su descripción en el año 2004. Generalmente, lck es considerada específica de la célula de T6, pero estudios recientes encontraron expre...

Pez cebra ofrecen poderosos atributos, como manipulability genético, alta fecundidad, transparencia óptica y desarrollo rápido que facilitan el estudio del desarrollo de vertebrados utilizando enfoques genéticos. Estas ventajas, junto con las características compartidas de teleósteos y mamífera hematopoyesis, hacen D. rerio ideal para análisis in vivo de la linfopoyesis y linfocito función, desde su más temprana aparición en larvas a lo largo de la edad adulta. Desarrollo de sangre en el pez cebra depende de procesos genéticos bien conservados que se comparten con los mamíferos, y estos se extienden al sistema inmune adaptante. Además, los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo linfoide se conservan notable entre el pez cebra y mamíferos1.
En las últimas 2 décadas, transgénicos D. rerio líneas linajes de sangre específicos de etiqueta y las líneas mutantes deficientes en estos linajes se han creado2,3,4,5. Uno de ellos, la línea transgénica lck:eGFP , utiliza el promotor de pez cebra linfocitos proteína tirosina quinasa (lck) para unidad de expresión de GFP6. Este gen, que es altamente expresada por precursores de linaje T y los linfocitos T maduros, permite seguimiento de desarrollo de la célula de T tímico y ex vivo de purificación de las células de linaje T por FACS7en vivo. Anteriormente, utilizamos esta línea en una pantalla de mutagénesis ENU avance genético para identificar a mutantes del germline propensos a todo T y para estudiar fenómenos genéticos adquiridos somáticamente vinculados a la célula de T oncogénesis8,9.
Recientemente, nuestro laboratorio extendido más la utilidad del pez cebra lck:eGFP . En doble transgénico rag2:hMYC (MYC humano), lck:eGFP D. rerio que son conocidos por desarrollar todo T 10, descubrimos que B linaje también ocurren11. A diferencia de la T-ALL en este modelo, que es fluorescente brillante debido a la alta expresión de GFP, B-todos son débilmente fluorescente debido a niveles bajos de la GFP, que pescado con B-todo distinguirse groseramente de los T-todo por microscopia fluorescente. Esta expresión de GFP diferencial también permite la separación de GFPlo -todas las células desde GFPHola células T-todos usando FACS11. Por otra parte, expresión de lck de baja no es exclusiva de pez cebra B-ALL, como humanos-todas también expresan bajos niveles de LCK11,12. Asimismo, células normales B-linaje de D. rerio, ratones y seres humanos también expresan niveles bajos de lck/Lck/LCK, células B inmaduras con la más alta expresión11,13. Sobre una base por celular, las células de linaje B en líneas de pez cebra o derivado de lckeGFP expresan 1-10% tanto GFP como los linfocitos T. Estos GFPlo expresa característica mRNAs de la célula de B como pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzy otros de las células y puede ser purificado de la médula ósea, timo, bazo o periférico la sangre11. Por lo tanto, ambos linaje B y T las células pueden ser aisladas de pez cebra lckeGFP y en caso de rag2hMYC, lckeGFP animales, células B y T todos así11.
Aquí, presentamos nuestro protocolo eficiente FACS purificar células no malignas B de pez cebra lck:eGFP y las células de B no malignos o malignas de rag2hMYC; Lck:EGFP peces, con varios tejidos de origen. Tales células pueden cuantificarse por el flujo cytometry sin aislamiento de FACS, además si lo desea. Descubrimiento de la expresión de lck de baja- y en consecuencia, la baja expresión de GFP-b células abre nuevas puertas de posibilidades experimentales del pez cebra lckeGFP , como vivo en B estudios del desarrollo de la célula. Así, esta línea transgénica, primero divulgada en 2004, tiene nueva vida al intentar utilizarlo para obtener ideas frescas sobre inmunidad adaptativa de pez cebra.

<table><tbody><tr><td>35 y micro; m mesh</td><td>Sefar Tecnología de filtro</td><td>7050-1220-000-13</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubo de poliestireno de fondo redondo con tapón de filtro de celdas</td><td>Marca Falcon Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 mL</td><td>VWR international</td><td>525-0448</td><td></td></tr><tr><td>AZ APO 100 Microscopio fluorescente</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Qi1MC camara</td> Metanolsulfonato de 3-aminobenzoato de etilo <td>de Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>; MS-222</td><td>Sigma</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>lck:eGFP</td><td></td><td></td><td>Véase Langeneu et al., 2004</td></tr><tr><td>Software NIS Elements Nikon</td><td></td><td>versión 4.13</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizadores de microtubos Mortero</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>64788-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td></td><td></td><td></td> de transferencia de plástico</tr><tr><td>rag2:hMYC-ER</td><td></td><td></td><td>Véase Gutierrez et al., 2011</td></tr><tr><td>RPMI Media 1640 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table>

aislar maligno y no maligno de células b lck:egfp pez cebra

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Pez cebra (Danio rerio) son un poderoso modelo para estudiar el desarrollo de linfocitos. Como mamíferos, D. rerio poseen un sistema inmune adaptativo que incluye linfocitos B y T. Estudios de linfopoyesis de pez cebra son difíciles porque anticuerpos reconociendo D. rerio marcadores de superficie celular generalmente no están disponibles, que complica el aislamiento y caracterización de poblaciones de diferentes linfocitos, incluyendo B-linaje células. Líneas transgénicas con expresión fluoróforo específico de linaje se utilizan a menudo para eludir este desafío. La línea transgénica lck:eGFP se ha utilizado para estudiar el desarrollo de las células T D. rerio y se ha utilizado también para el desarrollo del modelo de la célula de T y leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Aunque lck:eGFP peces se han utilizado ampliamente para analizar el linaje T, no ha utilizado para estudiar las células de B. Recientemente, hemos descubierto que muchas células de pez cebra B también expresan lck, aunque a niveles más bajos. Por lo tanto, las células lck:eGFP B además expresan bajos niveles de GFP. Basado en este hallazgo, hemos desarrollado un protocolo para purificar células B linaje de peces cebra lck:eGFP , que se presenta aquí. Nuestro método describe cómo utilizar un clasificador célula fluorescente activada (FACS) para purificar las células de B de pescado lck:eGFP o líneas relacionadas, tales como doble transgénico rag2:hMYC; Lck:EGFP de pescado. En estas líneas, las células B, células B particularmente inmaduras, GFP expreso en niveles bajos pero detectables, lo que les permite distinguirse de las células T que expresan GFP altamente. B células pueden ser aisladas de médula ósea, timo, bazo, sangre u otros tejidos. Este protocolo proporciona un nuevo método para purificar células B D. rerio , permitiendo estudios enfocados en temas como el desarrollo de las células B y linfocitos B malignos.

Hemos utilizado la citometría de flujo para analizar y FACS para aislar GFPlo y GFPHola células de timo, médula ósea riñón y bazo de pez cebra transgénico lck:eGFP . El análisis de peces 3 meses reveló que el timo contiene principalmente linfocitos GFP+ . Las células GFP+ fueron confinadas en gran parte a la puerta linfoide descrita por Traver et al17. Dos poblaciones distintas de la GFP+ , GFPlo<...

Pez cebra transgénico lck:eGFP expresan GFP altamente en los linfocitos T y se han utilizado para estudiar el desarrollo de las células T y leucemia linfoblástica aguda. Esta línea puede utilizarse para células de estudio B, que expresan lck en niveles inferiores. Este protocolo describe la purificación de las células B malignas y no malignas del pez cebra lck:eGFP .

Aislar maligno y no maligno de células B lck:eGFP pez cebra

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Recientemente descubrimos que muchas células B en LCK GFP pez cebra expresa bajos niveles de GFP. Esto hace de esta línea una herramienta útil para estudiar las células B, así como las células T. La principal ventaja de esta técnica es que ahora podemos estudiar células B y células T de LCK GFP zebrafish o podemos estudiar células B-ALL y T-ALL de peces con cáncer.Estos métodos permiten el desarrollo de células B y estudios B-ALL en peces cebra. Que son relevantes para entender el sistema inmunitario adaptativo y sus neoplasias malignas comunes en el cáncer pediátrico. Si nunca ha hecho estas disecciones antes, es posible que desee refinar su técnica un par de veces hasta que pueda obtener buenas muestras de timo y médula.La demostración visual ayudará a los espectadores a reconocer fluoroso y B-ALL en peces y a seleccionar la configuración correcta para discriminar las células B y T para su aislamiento. Después de anestesiar con 0.02%Tricaine en el sistema de peces agua utilizar el filtro GFP en un microscopio de epifluorescencia para examinar el pez cebra de dos a seis meses de edad para timi fluorescente en el aspecto medial dorsal de la cavidad ramificada. Después de localizar el timo colocar pescado eutanizado en una placa Petri y utilizar el microscopio fluorescente para eliminar el timi positivo GFP.Y ajustes de microscopía de campo brillante para cosechar la médula renal y el bazo. Coloque cada órgano recogido en un tubo de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de medio de clasificación en frío y utilice un homogeneizador de microtubos de peste para homogeneizar los tejidos sobre hielo. Luego, tensa el tejido homogeneizado a través de un filtro de malla de 35 micrómetros para generar una sola suspensión celular y colocar las células sobre hielo.A partir de dos a cuatro meses, utilice un microscopio fluorescente para examinar el ragnú transgénico doble2: hMYC LCK EGFP fish utilizando ajustes de baja exposición para identificar la leucemia linfoblástica aguda de células T brillantes o T-ALL y ajustes de alta exposición para identificar animales B-ALL tenues. El control de tipo salvaje y los peces pre-leucémicos tienen GFP localizado sólo en el timo. Clasificar el pez en función de la extensión de la fluorescencia GFP utilizando un sistema simple de tres categorías.Los peces de nivel uno demuestran una señal fluorescente como un tumor timico con una propagación local limitada. Los peces de nivel dos demuestran una señal fluorescente más allá del timo que involucra a menos del 50% del cuerpo. Y los peces de nivel tres demuestran una señal fluorescente que se extiende más allá del 50% del cuerpo.Separe el pescado con TODOS de los que no tienen cáncer. Y monitorear el pescado pre-leucémico sin tumores positivos GFP una vez al mes para el desarrollo de nuevos ALL. Para el aislamiento celular T o B-ALL, utilice una cuchilla de afeitar para eliminar la cabeza y la región timica de un pez de nivel tres eutanizado y colocar el cuerpo en un plato de petri.Utilice una pipeta P-1000 para lavar la cavidad peritoneal de pescado con 500 microlitros de medio de clasificación en frío, recogiendo las células y el medio en un tubo de cinco mililitros. Usando una punta de pipeta fresca inyectar de dos a tres volúmenes adicionales de 200 a 300 microlitros de medio de clasificación en frío en la cavidad del cuerpo y utilizar la punta de la pipeta para aplicar una presión suave al cuerpo del pez para extruir las células fuera de la cavidad del cuerpo en el tubo de cinco mililitros. A continuación, tensar la suspensión celular a través de un filtro de malla de 35 microlitrotros.Y coloque las células sobre hielo hasta su análisis por citometría de flujo. Para la homogeneización de todo el cuerpo utilizar un homogeneizador de microtubo peste para homogeneizar el cuerpo del pez y añadir 300 microlitros adicionales de medio de clasificación en frío al tubo. Filtre la suspensión celular a través de un filtro de malla de 35 micrómetros, lavando el filtro con un medio de clasificación adicional según sea necesario hasta que solo queman restos de tejido en el filtro.Luego, coloque las células sobre hielo hasta su análisis. Para el análisis citométrico de flujo de las células aisladas, establezca los parámetros del citometro de flujo de acuerdo con las directrices del fabricante. Y adquirir de 10.000 a 50.000 eventos para establecer los parámetros de dispersión hacia adelante y dispersión lateral para definir las compuertas de linfocitos y células progenitoras y excluir los desechos celulares.Excluya los dobletes celulares y utilice las puertas linfoides y/o precursoras para determinar el número y el porcentaje de las células positivas de la GFP. El uso de fitoerytrina y las intensidades de GFP definen puertas para el GFP negativo frente a GFP bajo versus GFP células altas. Aprender dónde colocar las puertas para aislar las células altas de GFP bajas y GFP es fundamental para obtener poblaciones puras de células B y T.Dos poblaciones positivas de GFP distintas, células B bajas de GFP y células T altas de GFP se pueden obtener del timo. Las células B que residen en la médula renal de peces cebra de tres meses de edad expresan bajos niveles de GFP. Sin embargo, las células altas de la GFP son escasas, lo que indica que sólo un pequeño porcentaje de linfocitos T están presentes en la médula a los tres meses de edad.Del mismo modo, las muestras esplénicas muestran porcentajes más altos de GFP bajos que las células altas de GFP. En los peces doble transgénicos que aún no han desarrollado leucemia linfoblástica aguda, la expresión de la GFP en el timo, la médula y el bazo es similar a la observada en los peces LCK EGFP monotransgénicos. Sin embargo, el número de linfocitos por órgano aumenta.Presumiblemente, debido a la expansión impulsada por la MYC de las poblaciones inmaduras de células B y T en las que el promotor rag2 está activo. En peces doble-transgénicos con B y o T-ALL que han desarrollado cánceres fluorescentes a lo más de seis meses B-ALL son cánceres tenumente fluorescentes que contienen principalmente células bajas de GFP. Por el contrario, los peces fluorescentes brillantes pueden albergar poblaciones aisladas de T-ALL o mixtas de células B-ALL bajas de GFP y T-ALL altas de GFP.De hecho, según lo evaluado por el análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa, las células bajas de la PFN expresan niveles más altos de transcripciones de células B. Y las células altas de la GFP expresan niveles más altos de genes de células T, LCK y el marcador GFP. Es fundamental aprender a reconocer peces con B-ALL por microscopía.Y cómo definir correctamente las puertas de citometría de flujo para separar las poblaciones bajas de GFP y GFP altas. Después de este procedimiento, puede aislar el ADN, el ARN o la proteína de las células altas de GFP baja y GFP para PCR, la secuenciación, lo que hay en la sangre o experimentos de trasplante in vivo. Una vez que aprendimos LCK GFB peces tienen células B fluorescentes además de células T podríamos estudiar ambos tipos de células del mismo animal para evaluar B y T-ALL.

isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Limitación de la dilución ensayos de trasplante de células se utilizan para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células. Este protocolo describe un método para generar pez cebra singénico que desarrollan leucemia fluorescente marcado y los detalles de cómo aislar y trasplante de estas células de leucemia en la limitación de dilución en la cavidad peritoneal de los adultos de pez cebra.

Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.

Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra

Este protocolo describe la técnica de aislar células tumorales de leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) marcadas con fluorescencia de un pez cebra adulto y cuantificarlas utilizando un colorante azul de tripano.

Aislamiento de células T-ALL marcadas con fluorescencia: un método para aislar células T-ALL de pez cebra adulto

Aquí, presentamos un protocolo para el trasplante de células de músculo esquelético de pez cebra y rabdomiosarcoma embrionario (ERMS) en pez cebra mutante homocigoto rag2E450fs adulto inmunocomprometido. Este protocolo permite el análisis eficiente de la regeneración y transformación maligna de las células musculares.

Trasplante de células musculares normales y malignas en inmunológico comprometido adultos de pez cebra

Este protocolo describe un método para aislar células individuales de embriones de pez cebra, enriquecer para obtener células de interés, capturar células de pez cebra en sistemas multiplex de células individuales basados en microfluidos y evaluar la expresión génica de células individuales.

Aislamiento y caracterización de células individuales a partir de embriones de pez cebra

A continuación, describimos una técnica para aislar las células de población lateral de un modelo de pez cebra de células T myc inducida por la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T). Este ensayo población lado es muy sensible y se describe, por pez cebra T-ALL, pero puede ser aplicable a otros tipos de células de pez cebra malignas y no malignas.

Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda inducida por linfocitos T de Myc en peces cebra

Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Este artículo presenta el método de desarrollo, caracterización y seguimiento en tiempo real de la metástasis tumoral en el modelo de pez cebra del neuroblastoma, específicamente en la línea de pez cebra transgénico con sobreexpresión de MYCN y LMO1, que desarrolla metástasis espontáneamente.

Modelo de pez cebra de metástasis de neuroblastoma

Este trabajo describe un protocolo para el sistema modular de transgénesis Tol2, un método de clonación basado en pasarela para crear e inyectar construcciones transgénicas en embriones de pez cebra.

El sistema Zebrafish Tol2: un enfoque de transgénesis modular y flexible basado en pasarelas

Utilizamos la tinción de proliferación celular para identificar células quiescentes en el modelo de leucemia linfoblástica aguda T de pez cebra. La tinción se retiene en las células que no se dividen y se reduce durante la proliferación celular, lo que permite la selección de células inactivas para su posterior interrogación. Este protocolo proporciona una herramienta funcional para estudiar la autorrenovación en el contexto de la quiescencia celular.

Identificación de células quiescentes en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra mediante tinción de proliferación celular 

Aprende a aislar células B malignas y no malignas de pez cebra lck:eGFP para estudiar leucemia linfoblástica aguda. Este método permite analizar el desarrollo de linfocitos y comprender los mecanismos del cáncer pediátrico.

Aislar maligno y no maligno de células B lck:eGFP pez cebra

Explorar más videos