Inducción y caracterización de la hipertensión pulmonar en ratones utilizando el modelo Hypoxia/SU5416

Este protocolo se puede utilizar para inducir hipertensión pulmonar y para realizar mediciones funcionales del ventrículo derecho. El modelo Sugen Hypoxia es fácil de implementar y puede recapitular algunas de las señas de identidad de la hipertensión pulmonar dentro de dos a tres semanas de la inducción. Usando este modelo, podemos identificar nuevas vías involucradas en el desarrollo de la enfermedad.

Podemos identificar nuevas dianas y probar su potencial terapéutico. Antes de comenzar el procedimiento de inducción, asegure los tanques de nitrógeno cerca de la cámara hipoxica y ajuste el controlador de oxígeno en un punto de 10%oxígeno. A continuación, cargue la solución SU5416 recién preparada en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 25 y retenga manualmente el primer animal que se inyecta.

Sujete la piel para formar una tienda paralela a la columna vertebral asegurándose de agarrar la parte posterior de la cabeza firmemente para evitar una posible lesión por mordedura por parte del ratón. Inserte la aguja por vía subcutánea sobre el flanco en el pliegue de piel suelta paralelo a la piel y entregue 100 microlitros del contenido de la jeringa. Después de 10 segundos, retire la aguja y devuelva el animal a su jaula.

Cuando se hayan inyectado todos los animales, coloque los ratones en una cámara ventilada de hipoxia. Para la exposición a la hipoxia, confirme que las cámaras están equipadas con un sensor de oxígeno para medir el nivel de oxígeno y abrir las cámaras durante no más de 20 minutos cada tres días para limpiar y agregar alimentos y agua. Inspeccione los animales diariamente en busca de signos de estrés y repita la inyección SU5416 semanalmente durante tres semanas consecutivas.

Antes de iniciar el procedimiento de medición de presión, prepare el conector del tubo Y y utilice el modo manual para comprobar la función del ventilador. Establezca la presión inspiratoria en menos de un centímetro de agua para evitar el barotrauma y establezca la frecuencia respiratoria en 110 respiraciones por minuto. Corte un catéter intravascular de calibre 20 para crear un tubo endotraqueal y encienda la unidad de control del volumen de presión.

Inicie el software de adquisición de datos y coloque el catéter de volumen de presión en un tubo centrífuga de 15 mililitros de PBS en un baño de agua Celsius de 37 grados. A continuación, calibre el catéter de acuerdo con el protocolo del fabricante. Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento y coloque una sonda rectal para la monitorización de la temperatura corporal.

A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo delfín en un ratón anestesiado y afeite las áreas del cuello y el pecho. Asegure las extremidades del ratón con cinta quirúrgica y haga una incisión de un centímetro en la piel cervical medial. Usando un aplicador con punta de algodón, separe sin rodeos las glándulas salivales parótidas y submandibulares para exponer los músculos subyacentes a la tráquea.

Corte cuidadosamente los músculos para exponer completamente la tráquea y use tijeras para hacer una pequeña incisión entre los cartílagos traqueales. Inserte el tubo endotraqueal preparado y retire la guía metálica del catéter intravascular. A continuación, conecte el catéter al respirador y verifique la posición del tubo traqueal inflando manualmente suavemente los pulmones.

Fije la posición con cinta adhesiva. Para la medición de la presión del ventrículo derecho, haga una incisión cutánea de un centímetro sobre el proceso de xifoide y la parte superior del abdomen y comenzando en la línea media distal al xifoide y moviéndose cuidadosamente lateralmente en ambos lados, separe la piel sobre el pecho y la pared abdominal. Abrir la cavidad abdominal, cortar el diafragma cuidadosamente, teniendo cuidado de no dañar el corazón latiendo o los pulmones.

Y utilice un aplicador con punta de algodón para eliminar suavemente el pericardio. Lleve el catéter de presión cerca del ratón y utilice un aplicador con punta de algodón equipado con una aguja para hacer una puñalada en la parte distal atípica del ventrículo derecho. Sustituya cuidadosamente la aguja por catéter de presión, insertando el catéter de presión paralelo a la dirección del ventrículo derecho con la punta frente a la arteria pulmonar.

Observe el trazado de las ondas de presión para garantizar el posicionamiento correcto del catéter. Una vez que la señal de presión se haya estabilizado, detenga las respiraciones y obtenga al menos tres mediciones. Una vez registradas todas las mediciones, devuelva cuidadosamente el catéter al tubo centrífuga lleno de PBS en el baño de agua.

Aquí, se muestran curvas de presión representativas y un análisis cuantitativo de la presión ventricular derecha al final del período de observación. El análisis histológico de las arterias pulmonares remodeladas después de la hipoxia más el tratamiento con SU5416 revela un aumento en el espesor de la pared medial en comparación con los animales normódicos. La tinción de aglutinina de germen de trigo para evaluar la hipertrofia de cardiomiocitos indica que la hipoxia más la exposición a SU5416 da como resultado un aumento marcado en el tamaño de los cardiomiocitos y la hipertrofia ventricular derecha.

Además, la evaluación morfométrica de la hipertrofia ventricular derecha mediante la medición del índice Fulton confirma un aumento de la hipertrofia ventricular derecha en los animales hipóxicos. Realizar las mediciones funcionales es importante para evitar el sangrado porque esto puede afectar negativamente a los resultados del estudio. Este protocolo también se puede utilizar para inducir hipertensión pulmonar en ratas con sólo ligeras modificaciones.

En particular, sólo una inyección de Sugen en ratas es suficiente para inducir hipertensión pulmonar.