Name: Aislamiento, propagación y expresión de la proteína del prión durante la diferenciación Neuronal de células madre de pulpa Dental humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Aprende a aislar y propagar células madre de pulpa dental humana con alta eficiencia. Este protocolo evalúa la expresión de la proteína prión durante la diferenciación neuronal para aplicaciones en medicina regenerativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por la "Fondazione Varrón" y Rieti Universidad "Sabina Universitas" a Vincenzo Mattei.
Figura 5 (A, B) reimpreso con el permiso de la editorial Taylor & Francis Ltd de: complejos multimoleculares de papel de prión proteína EGFR durante la diferenciación neuronal de dentales pulpa derivada de células madre humanas. Martellucci, S., V. de Manganelli, Santacroce C. F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei prión. 2018 4 de Mar. Taylor & Francis Ltd.

Terceros molares en el estudio fueron suprimidos de los pacientes (13-19 años) sin historia previa de consumo de alcohol o drogas, todas para no fumadores y con adecuada higiene oral. En el día de la explicación, en el Departamento de ciencia odontología y maxilofacial de la Universidad "Sapienza" de Roma, se obtuvo consentimiento informado de los pacientes o los padres. Consentimiento informado se obtuvo basado en consideraciones éticas y la aprobación del Comité de ética.
1. el diente y la extracción de la pulpa Dental
<ol><li>
Preparación de medio apropiado para la conservación o el transporte.
	<ol>
<li>Preparar media baja concentración modificado Eagle de Dulbecco de glucosa (DMEM-L) con L-glutamina (494,5 mL).</li>
		<li>Añadir 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) y 0.5 mL de anfotericina (0,1%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraer el tercer molar de la paciente, rápidamente lavar con PBS, colocar en un tubo de ensayo de 15 mL con el medio y transferir al laboratorio en menos de 2 h.</li>
	<li>Bajo una campana de biohazard, abrir el diente con una fresa de pasada de corte coronal paralelo y tangente a través del techo de la cámara pulpar.</li>
	<li>Suavemente Retire la pulpa con una excavadora pequeña y colóquela en un tubo de ensayo.</li>
	<li>Lavar con PBS tres veces y centrifugar a 2.500 x g durante 10 min a TA.</li>
</ol>2. procesamiento de la pulpa Dental y liberación de células madre
<ol><li>Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado en solución de Hank y colocar en una placa Petri. Incubar por 2 h a 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>
Tipo de preparación de solución de colagenasa IV.
	<ol>
<li>Preparar 0,8 mL de DMEM-L.</li>
		<li>Derretir 1 mg de colagenasa de tipo IV en 0,8 mL de DMEM-L y agitar durante varios minutos.</li>
		<li>Agregar DMEM-L a tener una concentración final 1 mL 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtrar la solución con un filtro de 0,22 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire la solución de Hank por centrifugación a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente y dividir la pulpa en rebanadas pequeñas de aproximadamente 1 mm cada uno con un bisturí desechable.</li>
	<li>Colocar las rebanadas de la pulpa en un plato de petri e incubar con 1 mL de colagenasa tipo IV durante 15 min a 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>
Preparación de medio de cultivo (500 mL).
	<ol>
<li>A 445 mL de DMEM-L con L-glutamina.</li>
		<li>Añadir 50 mL de suero bovino Fetal (FBS) (10%).</li>
		<li>Añadir 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado en el medio (paso 2.5) y la cultura en T25 frasco específico para células madre a 37 ° C en 5% CO2.</li>
</ol>3. propagación y cultivo de células de vástago
<ol><li>Cada día Compruebe la cultura y, después de 3 días de crecimiento, observar diferentes clones de células adherentes dentro de la mufla.</li>
	<li>Cada 3 días cambiar el medio de cultivo.</li>
	<li>Entre 7 y 12 días, una vez que las células adherentes tienen alcance confluencia, separar la les, tratar las células con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C o con la ayuda de un raspador celular.</li>
	<li>Añadir 4 ml (relación 1:5) del medio de cultivo (paso 2.5) para detener la acción de la tripsina.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células de 6 min a 259 x g, quite el sobrenadante y colocar las células en un frasco de T25 para propagar. Nota: Cada 3 días las células llegar a confluencia.</li>
	<li>Se propagan las células hasta los 21 o 28 días (aproximadamente 6-8 pasos) para evitar la presencia de no madre como las células en el cultivo.</li>
	<li>Separar las células con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 minutos a 37 ° C o raspando suavemente. Centrifugue la suspensión de células de 6 min a 259 x g.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y las células para el análisis de cytofluorimetric (paso 6).</li>
</ol>4. transitorio PrPC silenciar por siRNA
<ol><li>Las placas de 6 pozos de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) con 2 mL de medio de cultivo (paso 2.5) por 24 h de cultivo.</li>
	<li>
Al día siguiente, preparar medio de PrP de siRNA (400 μL).
	<ol>
<li>A un tubo de ensayo estéril, añadir 384 μl DMEM-L.</li>
		<li>Añadir 1 μl de cada tipo de siRNA PrP DMEM-l para una concentración final de 5 nM (4 siRNA PrP fueron utilizados y verificados por el proveedor para garantizar una eficiencia de precipitación ≥70%).</li>
		<li>Añadir 12 μl de transfectionreagent DMEM-l.</li>
		<li>Vórtice la mezcla e incubar 10 min a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de transfección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 400 μL de medio de PrP siRNA a cada muestra e incubar durante 6 h a 37 ° C.</li>
	<li>Sin descartar el medio de PrP de siRNA, añadir 1,6 mL (relación de 1 a 5) del medio de cultivo (paso 2.5).</li>
	<li>Salir de las células durante 72 h a 37 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y lavar 3 veces con 2 mL de PBS a TA.</li>
	<li>Añadir 2 mL de medio de cultivo neuronal por 7 o 14 días (paso 5.1).</li>
	<li>Cambiar el medio de cultivo neuronal cada 3 días. Nota: Reemplazar el siRNA PrP solución cada reemplazo de tiempo el medio de cultivo neuronal.</li>
	<li>En el final del tiempo, lavar 3 veces con 2 mL de PBS a temperatura ambiente y prueba de antígenos de la superficie neuronales por análisis de Western Blot.</li>
</ol>5. neuronal proceso de inducción de hDPSCs
<ol><li>
Preparación de medio de cultivo neuronal (500 mL).
	<ol>
<li>Preparar 444,7 mL de medio basal a las células neuronales.</li>
		<li>Al medio de añadir 50 mL de suplemento libre de suero que utiliza para apoyar la viabilidad a largo plazo de células embrionarias y adultas del vástago neuronales (10%).</li>
		<li>Añadir 200 μL de básico Factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) (concentración final 40 ng/mL) y 100 μl de Factor de crecimiento epidérmico (EGF) en el medio (concentración final 20 ng/mL).</li>
		<li>Añadir 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) en el medio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultura hDPSCs en placas de 6 pocillos (2 x 105 células/mL) hasta 28 días de la separación de la pulpa y estimular con 2 mL de medio de cultivo neuronal.</li>
	<li>Cada 3 días deseche el sobrenadante y lavar 3 veces con 2 mL de PBS a temperatura ambiente vuelva a colocar 2 mL de medio de cultivo neuronal.</li>
	<li>Después de 7 o 14 días, separar las células con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C o suavemente con una espátula.</li>
	<li>Añadir 4 mL (relación 1:5) del medio de cultivo (paso 2.5) para detener la acción de la tripsina.</li>
	<li>Prueba para la presencia de antígenos de superficie neuronales (paso 6) o la expresión de la proteína del prión (paso 7) por análisis de citometría de flujo.</li>
</ol>6. Caracterización de la hDPSCs por citometría de flujo
<ol><li>Estromal mesenquimal (MSC) de seleccionar-antígenos de superficie específicos o neuronales.</li>
	<li>La cultura hDPSCs en placas de 6 pocillos (2 x 105 células/mL) con 2 mL de medio de cultivo (paso 2.5).</li>
	<li>Soltar hDPSCs a los 28 días de la separación de la pulpa dental o después de 14 días de medio de cultivo neuronal (paso 5.1) con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 minutos a 37 ° C o ligeramente raspador.</li>
	<li>Añadir 4 ml (relación 1:5) del medio de cultivo (paso 2.5) para detener la acción de la tripsina y centrifugado a 259 x g durante 6 min a TA. lavar otro 2 veces con 2 mL de PBS a TA.</li>
	<li>Fijar la hDPSCs no tratada o tratada con paraformaldehído al 4% en PBS por 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilizar hDPSCS con tensioactivo no iónico 0,1% (v/v) en PBS durante 10 minutos adicionales a TA.</li>
	<li>Realizar el bloqueo con 5% leche en polvo descremada en 1 mL de PBS durante 1 h a TA.</li>
	<li>Lavar 3 veces con 1 mL de PBS e incubar las células con anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 las células), anti β3-tubulina (1: 100 / 5 x 105 células), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 células) y anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 células) mAb por 1 h a TA.</li>
	<li>Lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS e Incube anti-ratón PE (1:50 / 5 x 105 células) o anti-conejo CY5 (1:50 / 5 x 105 células) mAb para adicional 1 h a TA.</li>
	<li>Utilizar los anticuerpos secundarios para bloquear las células immunopositive (PE anti-ratón o anti-conejo CY5 mAb) y analizar todas las muestras con un citómetro de flujo y adquirir por lo menos 20.000 eventos.</li>
</ol>7. evaluación de la expresión de PrPC en hDPSCs por análisis de citometría de flujo
<ol><li>Las placas de 6 pozos de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) con 2 mL de medio de cultivo (paso 2.5) de la cultura.</li>
	<li>Quitar hDPSCs a los 21 y 28 días de la separación de la pulpa dental y después de 7 o 14 días con medio de cultivo neuronal (paso 5.1) con 1 mL de tripsina-EDTA y detener la acción de la tripsina como se describe en el paso 6.4. Fijar a las muestras con paraformaldehído al 4% en PBS por 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Permeabilizar con 0,1% (v/v) no iónicos surfactantin PBS durante 10 minutos en RT. eliminar el sobrenadante y las células con conejo anti-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 células) la mancha mAb por 1 h a RT. incubar con anti-conejo CY5 (1:50 / 5 x 105 células) mAb para adicional 1 h a TA.</li>
	<li>Analizar todas las muestras con un citómetro de flujo y adquirir por lo menos 20.000 eventos.</li>
</ol>

<ol><li>Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cell+assays%3A+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adult+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.</a> Nature. 418, 1-49 (2002).</li>
<li>Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).</li>
<li>Zannettino, A. C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-potential+Human+adipose-derived+stromal+stem+cells+exhibit+a+perivascular+phenotype+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo.</a> Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipid+rafts+in+neuronal+differentiation+of+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells.</a> Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).</li>
<li>Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+hematopoietic+stem+cells+from+the+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).</li>
<li>Young, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+heterogeneity+in+the+neuronal+and+glial+differentiation+of+dental+pulp+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells.</a> Stem Cells International. 2016, 1290561(2016).</li>
<li>Pisciotta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells+%28hDPSCs%29%3A+isolation%2C+enrichment+and+comparative+differentiation+of+two+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations.</a> BMC Developmental Biology. 15, 14(2015).</li>
<li>Atari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+of+the+third+molar%3A+a+new+source+of+pluripotent-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells.</a> Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).</li>
<li>Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+pluripotency+in+human+dental+pulp+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+oral+and+maxillofacial+surgery%3A+official+journal+of+the+American+Association+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells.</a> Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).</li>
<li>Gronthos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell properties of human dental pulp stem cells.</a> Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).</li>
<li>Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+dental+pulp+stem+cells+differentiate+toward+functionally+active+neurons+under+appropriate+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues.</a> Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskakov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+is+involved+in+controlling+cell+cycle+dynamics%2C+self-renewal%2C+and+the+fate+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation.</a> Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).</li>
<li>Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+%28PrPc%29+positively+regulates+neural+precursor+proliferation+during+developmental+and+adult+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).</li>
<li>Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+cellular+prion+protein%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The biological function of the cellular prion protein: an update.</a> BMC Biology. 15, 34(2017).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+cellular+prion+protein+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+contributes+to+apoptosis+execution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).</li>
<li>Linden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Function+of+the+Prion+Protein%3A+A+Cell+Surface+Scaffold+of+Signaling+Modules%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77(2017).</li>
<li>Garofalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+raft-like+microdomains+in+the+regulation+of+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis.</a> Apoptosis. , 621-634 (2015).</li>
<li>Watt, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+beta-cleavage+of+the+prion+protein+in+the+cellular+response+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).</li>
<li>Mattei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+Withdrawal+Modifies+Prion+Protein+Expression+in+Rat+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus.</a> PLoS One. 12, 0169571(2017).</li>
<li>Hu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+proteins%3A+physiological+functions+and+role+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders.</a> Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).</li>
<li>Sorice, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+PrPC+to+mitochondrial+raft-like+microdomains+during+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis.</a> Prion. 6, 354-358 (2012).</li>
<li>Martellucci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Prion+protein-EGFR+multimolecular+complex+during+neuronal+differentiation+of+human+dental+pulp-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells.</a> Prion. 12 (2), 117-126 (2018).</li>
<li>Lee, Y. J., Baskokov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+form+of+the+prion+protein+guides+the+differentiation+of+human+embryonic+stem+cell+into+neuron-%2C+oligodendrocyte-+and+astrocyte-committed+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages.</a> Prion. 8, 266-275 (2014).</li>
<li>Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+human+dental+pulp+cells%3A+various+isolation+methods+and+culturing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments.</a> Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).</li>
<li>Suchanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells+and+their+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+papers+of+the+Medical+Faculty+of+the+University+Palack%C3%BD%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells and their characterization.</a> Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).</li>
<li>Bressan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age-related+biological+properties+of+human+dental+pulp+stem+cells+change+in+nanostructured+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), 49146(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo, nos enfocamos en la metodología para el aislamiento y la diferenciación neuronal de hDPSCs; Además, evaluamos el papel del PrPC en este proceso. Existen varios métodos para aislar y diferenciar hDPSCs neurona-como las células y pasos críticos durante el proceso. hDPSCs son capaces de diferenciarse en varios linajes como condroblastos, adipocitos, osteoblastos y las neuronas. En nuestro trabajo, hemos investigado los mecanismos de la diferenciación neuronal y la presencia de PrPC. Co...

Las células madre mesenquimales se han aislado de varios tejidos, incluyendo la médula ósea, sangre del cordón umbilical, la pulpa dental humana, tejido adiposo y sangre1,2,3,4,5 , 6. según varios autores, hDPSCs Mostrar adhesión de plástico, una típica morfología de fibroblasto-como. Estos representan una población muy heterogénea con diferentes clones y diferencias en la capacidad proliferativa y de diferenciación7,8. hDPSCs expresan marcadores específicos de células madre mesenquimales (es decir, CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), son negativos para algunos marcadores hematopoyéticos (como CD14 y CD19) y son capaces de diferenciación in vitro del multilineage9, 10,11.
Varios autores han demostrado que estas células son capaces de diferenciarse en neuronas-como las células utilizando diferentes protocolos, que incluyen la adición de NGF, bFGF, EGF en combinación con determinados medios y suplementos de7,12. Además, muchas proteínas están involucradas durante el proceso de diferenciación neuronal y, entre estos, varios trabajos muestran un papel relevante y significativa expresión de la proteína priónica celular (PrPC), tanto en las células madre embrionarias y adultas13, 14. PrPC representa una molécula pleiotrópica capaz de realizar diferentes funciones dentro de las células como cobre metabolismo, apoptosis, y resistencia a oxidativo estrés15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
En nuestro anterior documento23, investigamos el papel de PrPC en el proceso de diferenciación neuronal hDPSCs. De hecho, hDPSCs expresar precozmente PrPC y, después de la diferenciación neuronal, fue posible observar un aumento adicional. Otros autores la hipótesis de un posible papel del PrPC en los procesos de diferenciación neuronal de células madre. De hecho, PrPC conduce a la diferenciación de células madre embrionarias humanas en neuronas, oligodendrocitos y astrocitos24. El propósito de este estudio era hacer hincapié en la metodología para la obtención de células madre de pulpa dental, su proceso de diferenciación y la función de PrPC durante la diferenciación neuronal.

<table><tbody><tr><td>Solución de anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>Se utiliza para complementar los medios de cultivo celular, es un antibiótico antifúngico de polieno de Streptomyce</td></tr><tr><td>Anti-B3tubulin</td><td>Cell Signaling Technology &nbsp;</td><td>#4466</td><td>Una de las seis isoformas de B-tubulina, se expresa altamente durante el desarrollo fetal y postnatal, permaneciendo alta en el sistema nervioso periférico</td></tr><tr><td>Anti-CD105&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611314</td><td>Endoglin (CD105), una de las principales glicoproteínas del endotelio vascular humano, es una proteína de membrana integral de tipo I con una gran región extracelular, una región transmembrana hidrofóbica y una cola citoplasmática corta</td></tr><tr><td>Anti-CD44</td><td>Millipore</td><td>CBL154-20ul</td><td>Marcadores celulares positivos Anticuerpos dirigidos contra células madre mesenquimales</td></tr><tr><td>Anti-CD73&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular&nbsp;</td><td>13160</td><td>CD73 es una glicoproteína de 70 kDa anclada a la membrana anclada a la glicoproteína fosfatidilinositol que cataliza la hidrólisis de los nucleósidos monofosfatos extracelulares en nucleósidos bioactivos</td></tr><tr><td>Anti-CD90</td><td>Millipore</td><td>CBL415-20ul</td><td>Marcadores celulares positivos anticuerpos dirigidos contra células madre mesenquimales</td></tr><tr><td>Anti-GAP43&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular&nbsp;</td><td>#8945</td><td>Es una proteína específica del sistema nervioso, asociada al crecimiento en conos de crecimiento y áreas de alta plasticidad</td></tr><tr><td>Anti-ratón PE&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7003</td><td>Es un anticuerpo utilizado en citometría de flujo o análisis FACS</td></tr><tr><td>Anti-NFH&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular&nbsp;</td><td>#2836</td><td>Es un anticuerpo que detecta los niveles endógenos de la proteína total Neurofilament-H</td></tr><tr><td>Anti-PrP mAb EP1802Y&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab52604</td><td>Conejo monoclonal [EP 1802Y] a proteína priónica PrP</td></tr><tr><td>Anti-conejo CY5&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6564</td><td>Es un anticuerpo utilizado en citometría de flujo o análisis FACS</td></tr><tr><td>Anti-STRO 1</td><td>Millipore</td><td>MAB4315-20ul</td><td>Marcadores celulares positivos anticuerpos dirigidos contra células madre mesenquimales</td></tr><tr><td>B27 Supp XF CTS</td><td>Gibco de life technologies</td><td>A14867-01</td><td>B-27&nbsp; se puede utilizar para apoyar la inducción de células madre neurales humanas (hNSCs) a partir de células madre pluripotentes (PSCs), expansión de hNSCs, diferenciación de hNSCs, y mantenimiento de neuronas maduras diferenciadas en cultivo</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 citómetro de flujo&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>AC6531180187</td><td>Citómetro de flujo equipado con un láser azul (488 nm) y un láser rojo (640 nm)</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Software&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>controla el sistema de citómetro de flujo BD Accuri C6 para adquirir datos, generar estadísticas y analizar resultados</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>100-18B</td><td>factor de crecimiento básico de fibroblastos&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga CL30R</td><td>Termofisher Scientific</td><td>11210908</td><td>es un dispositivo que se utiliza para la separación de fluidos, gases o líquidos, basado en la densidad</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 3541</td><td>Termofisher Scientific</td><td>317527-185</td><td>garantiza condiciones de crecimiento óptimas y reproducibles para cultivos celulares</td></tr><tr><td>Colagenasa, tipo IV&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>La colagenasa es una proteasa que rompe el enlace entre un aminoácido neutro (X) y la glicina en la secuencia Pro-X-Glyc-Pro, que se encuentra con alta frecuencia en el</td></tr><tr><td>colágeno Bisturí desechable&nbsp;</td><td>Swann-Morton</td><td>501</td><td>Se utiliza para cortar tejidos:</td></tr><tr><td>DMEM-L</td><td>Euroclon</td><td>ECM0060L</td><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose con L-Glutamina con Piruvato de Sodio</td></tr>, <tr><td>EGF</td><td>PeproThec, DBA</td><td>AF-100-15</td><td>Epidermal Growth Factor&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco de life technologies</td><td>10270-106</td><td>FBS es un suplemento de medios popular porque proporciona una amplia gama de funciones en el cultivo celular. FBS proporciona nutrientes, factores de crecimiento y unión y protege las células del daño oxidativo y la apoptosis mediante mecanismos que son difíciles de reproducir en sistemas de medios sin suero (SFM)</td></tr><tr><td>Filtropur BT50 0.2,500 mL Filtro de tapa de botella</td><td>Sarstedt</td><td>831,823,101</td><td>es un dispositivo que se utiliza para la filtración de soluciones</td></tr><tr><td>Flexitube GeneSolution para PRNP</td><td>Qiagen</td><td>GS5621</td><td>4 siRNAs para el gen Entrez 5621. Secuencia diana N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA&nbsp; N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA&nbsp; N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA&nbsp; N.4&nbsp; La</td></tr><tr><td>solución de Hank 1x</td><td>Gibco de life technologies</td><td>240200083</td><td>La función esencial de Hanks&prime; La solución salina equilibrada es para mantener el pH y el equilibrio osmótico. También proporciona agua e iones inorgánicos esenciales a las células</td></tr>.<tr><td></td>El <td></td><td>reactivo de transfección Qiagen 301705 HiPerFect es una mezcla única de lípidos catiónicos y neutros que permite una absorción efectiva de siRNA y una liberación eficiente de siRNA dentro de las células, lo que resulta en una alta eliminación de genes incluso cuando se utilizan bajas concentraciones de siRNA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco de life technologies</td><td>10888022</td><td>Neurobasal-A Medium es un medio basal diseñado para el mantenimiento y la maduración a largo plazo de las neuronas cerebrales puras postnatales y adultas&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>El paraformaldehído se ha utilizado para la fijación de células y secciones de tejido durante los procedimientos de tinción</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina&nbsp;</td><td>Euroclon</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td>Se utiliza para complementar los medios de cultivo celular para controlar la contaminación bacteriana</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato&nbsp; (PBS)</td><td>Euroclon</td><td>ECB4004LX10&nbsp;</td><td>PBS es una solución salina equilibrada utilizada para la manipulación y el cultivo de células de mamíferos. El PBS se utiliza para irrigar, lavar y diluir células de mamíferos. La amortiguación de fosfato mantiene el pH en el rango fisiológico</td></tr><tr><td>TC-Platte 6 pozos, Cell+,F</td><td>Sarstedt</td><td>833,920,300</td><td>Es una superficie de crecimiento para células adherentes</td></tr><tr><td>Matraz para cultivo de tejidos T-25,Cell+,Vented Cap</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,302</td><td>Matraz para cultivo de tejidos T-25, poliestireno, Cell+ superficie de crecimiento para células adherentes sensibles, por ejemplo, células primarias, cuello inclinado, tapón de ventilación, amarillo, estéril, libre de pirógenos, no citotóxico, 10 uds./bolsa</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Tensioactivo no iónico ampliamente utilizado para la recuperación de componentes de membrana en condiciones leves no desnaturalizantes</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Euroclon</td><td>ECB3052D&nbsp;</td><td>La tripsina escindirá los péptidos en el lado C-terminal de los residuos de aminoácidos de lisina y arginina. La tripsina se utiliza para eliminar las células adherentes de una superficie de cultivo</td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>Tubo 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td></tr><tr><td>VBH 36 C2 Compact</td><td>Steril</td><td>ST-003009000</td><td>Ofrece una protección total para el medio ambiente y el trabajador</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 &ndash; Invertido&nbsp; El microscopio</td><td>Zeiss 3849000962</td><td></td><td>ZEISS Axio Vert.A1 ofrece un precio de nivel de entrada único y puede proporcionar todas las técnicas de contraste, incluyendo campo claro, contraste de fase, PlasDIC, VAREL, contraste de modulación de Hoffman mejorado (iHMC), DIC y fluorescencia. Incorpore iluminación LED para obtener imágenes suaves de células marcadas con fluorescencia. Axio Vert.A1 está diseñado ergonómicamente para el trabajo rutinario y es lo suficientemente compacto como para colocarse dentro de campanas de cultivo de tejidos.</td></tr></tbody></table>

aislamiento, propagación y expresión de la proteína del prión durante la diferenciación neuronal de células madre de pulpa dental humana

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

Cuestiones bioéticas relacionadas con la manipulación de células madre embrionarias han impedido avances en el campo de la investigación médica. Por esta razón, es muy importante obtener las células madre adultas de diferentes tejidos como el adiposo, cordón umbilical, médula ósea y sangre. Entre las posibles fuentes, la pulpa dental es particularmente interesante porque es fácil de obtener con respecto a consideraciones bioéticas. De hecho, células de madre pulpa Dental humana (hDPSCs) son un tipo de células madre adultas capaces de diferenciarse en células neuronales y puede obtenerse desde el tercer molar de pacientes sanos (edades de 13-19). En particular, la pulpa dental elimina con una excavadora, cortar en pequeñas rodajas, trataron con colagenasa IV y cultivada en un matraz. Para inducir la diferenciación neuronal, hDPSCs fueron estimuladas con EGF/bFGF durante 2 semanas. Previamente, hemos demostrado que durante el proceso de diferenciación del contenido de priónica celular proteína (PrPC) en hDPSCs aumentado. El análisis cytofluorimetric mostró una expresión temprana de PrPC que aumentó después del proceso de diferenciación neuronal. Ablación de PrPC por siRNA PrP previene la diferenciación neuronal inducida por EGF/bFGF. En este artículo ilustramos que mejoramos el aislamiento, separación y en vitro métodos de cultivo de hDPSCs con varios procedimientos fáciles, más eficientes células clones eran obtenido y gran expansión de las células madre mesenquimales (MSCs) se observó. También mostramos cómo hDPSCs, obtenidos con métodos detallados en el protocolo, son un excelente modelo experimental para estudiar el proceso de diferenciación neuronal de MSCs y los procesos celulares y moleculares posteriores.

Los procedimientos de aislamiento y separación de hDPSCs de la pulpa dental, obtenida del tercer molar, son procesos complejos en que pequeños cambios pueden provocar un resultado ruinoso. En este trabajo, utilizamos el protocolo de Arthur et al.. 12 con varias mejoras. Figura 1muestra un esquema representativo de los procedimientos.
hDPSCs representa una población h...

Aquí presentamos un protocolo para aislamiento de células de la pulpa Dental humana y propagación con el fin de evaluar la expresión de la proteína del prión durante el proceso de diferenciación neuronal.

Aislamiento, propagación y expresión de la proteína del prión durante la diferenciación Neuronal de células madre de pulpa Dental humana

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...

La forma estándar de obtener una célula madre de pulpa dental es poco eficiente, y esto depende de varias variables. Nuestro protocolo permitió obtener un aislamiento exitoso de células madre de dientes tratados en el 90% de los casos. Obtener un alto número de células en unas pocas semanas es la principal ventaja.Eso nos permite utilizar la célula en la medicina regenerativa y crear un biobanco que proporciona a otros científicos esta útil herramienta. El procedimiento para abrir el diente será realizado por el Dr. Constantino Santacroce. Posteriormente, el protocolo será mostrado por Stefano Martellucci, el estudiante de doctorado de mi laboratorio, que es el primer autor del artículo.Para empezar, extraiga el tercer molar del paciente, enjuáguelo rápidamente con PBS, coloque un tubo de ensayo de 15 mililitros con el medio y transfiérelo al laboratorio en menos de dos horas. Bajo una capucha de riesgo biológico, utilice un cortador para abrir el diente mediante un paso de corte coronal, paralelo y tangente, a través del techo de la cámara de pulpa. Con una pequeña excavadora, retire suavemente la pulpa y colóquela en un tubo de ensayo.Luego, lavar con PBS tres veces, y centrifugar a 2,500 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. Resuspender el pellet en la solución de Hank, y transferir la muestra a un plato de Petri.Retire la solución del Hank por centrifugación a 2.500 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, con un bisturí desechable, divide la pulpa en rodajas de aproximadamente un milímetro, y agrega un mililitro de colagenasa tipo IV. A continuación, centrifugar la muestra a 2.500 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos.Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en el medio. Cultivo en un matraz T25 específico para células madre a 37 grados Celsius en 5% dióxido de carbono. Durante el período de incubación, cambie el medio de cultivo cada tres días.Una vez que las células adherentes alcancen la confluencia, agregue un mililitro de solución de trippsina-EDTA a las células para separarlas, e incubar las células a 37 grados centígrados durante tres minutos. A continuación, agregue cuatro mililitros del medio de cultivo en una proporción de uno a cinco para detener la acción de la trippsina, y centrifugar la suspensión celular a 259 veces g durante seis minutos. Retire el sobrenadante.Luego, coloque las celdas en un matraz T25 para propagarlas. Luego, separa las células con un mililitro de trippsina-EDTA a 37 grados Celsius durante tres minutos. Centrifugar la suspensión celular a 259 g durante seis minutos.Retire el sobrenadante y proceda a probar las células para el análisis citofluorimétrico. Para realizar el paso de silenciamiento de la proteína priónica transitoria, primero escalculmente las células madre de pulpa dental humana en placas de seis pozos con dos mililitros del medio de cultivo durante 24 horas. Luego, agregue 400 microlitros del pequeño medio de ARN PrP interferente a cada muestra, e incubarlos a 37 grados centígrados durante seis horas.Sin descartar el medio siRNA PrP, agregue 1,6 mililitros del medio de cultivo en una proporción de uno a cinco, y deje las células a 37 grados centígrados durante 72 horas. Después del período de incubación, retire el sobrenadante y lave las células con dos mililitros de PBS tres veces a temperatura ambiente. Luego, agregue dos mililitros del medio de cultivo neuronal, y mantenga las células durante siete a 14 días en una incubadora a 37 grados centígrados.Después del período de incubación, lavar las células con dos mililitros de PBS tres veces a temperatura ambiente, y proceder al análisis de manchas occidentales para probar los antígenos de la superficie neuronal. Para realizar el proceso de inducción neuronal, cultivo 2 millones de células madre de pulpa dental humana en placas de seis pozos, hasta 28 días desde la separación de la pulpa. Cada tres días, desecha el sobrenadante.Lavar tres veces con dos mililitros de PBS a temperatura ambiente, y reemplazar dos mililitros del medio de cultivo neuronal. Después de siete a 14 días, separar las células con un mililitro de trippsina-EDTA a 37 grados Celsius durante tres minutos. A continuación, agregue cuatro mililitros del medio de cultivo en una proporción de uno a cinco para detener la acción de la trippsina.Para caracterizar las células madre de pulpa dental humana por citometría de flujo, cultivo 2 millones por mililitro de las células en placas de seis pozos con dos mililitros del medio de cultivo. A los 28 días de separación de la pulpa post-dental o después de 14 días adicionales con medio de cultivo neuronal, agregue un mililitro de la tripina-EDTA a 37 grados centígrados durante tres minutos para separar las células. A continuación, agregue cuatro mililitros del medio de cultivo en una proporción de uno a cinco para detener la acción de la trippsina, y centrifugar a 259 veces g a temperatura ambiente durante seis minutos.Fijar las células no tratadas o tratadas con 300 microlitros de 4%paraformaldehído en PBS a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, centrifugar, deseche el sobrenadante y permeabilice las células con un 1% de tensioactivo no iónico en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales. Luego, centrífugas de nuevo, deseche el sobrenadante y realice el bloqueo con 5% de leche seca sin grasa en un mililitros de PBS a temperatura ambiente durante una hora.Lavar tres veces con un mililitro de PBS, e incubar las células con anticuerpos monoclonales anti-CD105, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-tres-tubulina, anti-NFH y anti-GAP43 a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, centrifugar las células de nuevo tres veces consecutivas con un mililitro de PBS a intervalos de seis minutos, y luego incubar con anticuerpos monoclonales antiratón PE o anti-conejo CY5 a temperatura ambiente durante una hora adicional. Utilice los anticuerpos secundarios para atajer las células inmunopositivas y analice todas las muestras con un citómetro de flujo.Cultivo de 2 millones de células por mililitro de las células madre de pulpa dental humana en placas de seis pozos con dos mililitros del medio de cultivo. A los 21 y 28 días de separación de la pulpa post-dental o después de siete a 14 días adicionales con el medio de cultivo neuronal, agregue un mililitro de la trippsina-EDTA a 37 grados Celsius durante tres minutos para separar las células. Luego, centrífuga, deseche el sobrenadante, y luego fije los especímenes con 4%paraformaldehído en PBS a cuatro grados Celsius durante 10 minutos.A continuación, centrifugar, deseche el sobrenadante y, a continuación, permeabilizar con 1%surfactante no iónico en PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y manche las células con anticuerpo monoclonal anti-PrP de conejo a temperatura ambiente durante una hora. Finalmente, centrífuga, deseche el sobrenadante, y luego incubar con anticuerpo monoclonal CY5 antiejen a temperatura ambiente durante una hora adicional.Analice todas las muestras con un citómetro de flujo. Después de la separación de la pulpa, se ampliaron los racimos de células madre de pulpa dental humana en la periferia. Una comparación entre el crecimiento de estas células antes y después de la diferenciación neuronal inducida por EGF/bFGF mostró cambios significativos en la morfología celular y el crecimiento de las neuritas.Las células madre de pulpa dental humana no tratadas expresaron antígenos de superficie específicos mesenquimales multipotentes, como CD44, CD90, CD105, CD73 y STRO-1. Después de los estímulos de inducción neuronal apropiados, estas células expresaron marcadores neuronales específicos, como beta-tres-tubulina, NFH, y GAP43. Las células no tratadas no expresaron marcadores hematopoyéticos, como CD14 y CD19.Después de 28 días, la proteína priónica se expresó precozmente en células madre de pulpa dental humana en comparación con el control negativo correspondiente, y su expresión se incrementó después del proceso de diferenciación neuronal inducido por EGF/bFGF. El análisis de manchas occidentales mostró que silenciar la proteína prión por el ARN antes de que los estímulos de EGF/bFGF pudieran afectar el proceso de diferenciación neuronal de las células madre de pulpa dental humana al prevenir la expresión de marcadores neuronales beta-tres-tubulina y NHF. Lo más importante es la elección de la enzima para separar las células de la pulpa.De hecho, si la enzima es demasiado agresiva, las células podrían dañarse y su capacidad de crecimiento y diferenciación podría verse comprometida. Las células madre de pulpa dental son un excelente modelo experimental que se puede emplear en estudios in vivo e in vitro en el campo de la medicina regenerativa. Dado que la PrP desempeña un papel clave en el proceso de diferenciación neuronal de las células madre de pulpa dental, este marcador puede ser un excelente candidato como objetivo eficaz en enfermedades neurodegenerativas.El aspecto más importante a aconsejar es el estado de salud de los pacientes, como la ausencia de enfermedades infecciosas.

isolation-propagation-prion-protein-expression-during-neuronal

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los...

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Este video muestra una técnica para establecer un cocultivo de neuronas trigémino y células primarias de pulpa dental utilizando un filtro transwell. En esta condición físicamente separada, las células mesenquimales obtenidas del tejido de la pulpa dental secretan moléculas de señalización paracrina que atraviesan los poros, promoviendo la diferenciación y migración de las neuronas hacia las células mesenquimales estableciendo un sistema de cocultivo.

Establecimiento de un cocultivo de células de pulpa dental y neuronas del trigémino para la comunicación cruzada

Este video demuestra el proceso de inducir células madre pluripotentes humanas para diferenciarse en neuronas transfectándolas con lentivirus modificados genéticamente que llevan un gen de factor de transcripción neurogénico bajo el control de un elemento sensible a la tetraciclina, seguido de un tratamiento con un derivado de tetraciclina y un medio de maduración.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en neuronas utilizando lentivirus modificados

Este procedimiento produce neuronas telencefálicas pasando a través de los puntos de control que son similares a los observados durante el desarrollo humano. Las células se dejan a diferenciarse espontáneamente, están expuestas a factores que los empujan hacia el linaje neural, están aislados, y se sembraron sobre cubreobjetos para permitir la diferenciación terminal y la maduración.

La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.

Un método de cocultura para estudiar el crecimiento de Neurita en respuesta a las señales de paracrina de pulpa dental

Este artículo proporciona una guía paso a paso para establecer un cultivo primario de células madre de pulpas dentales utilizando el método de cultivo de explantes y la caracterización de estas células basada en las directrices del ICSCRT. Las células aisladas por este protocolo pueden considerarse como células madre mesenquimales para aplicaciones posteriores.

Cultivo primario de células madre de pulpa dental

Este protocolo enfatiza la extracción, el cultivo y la preservación de células madre multipotentes de la pulpa dental a través de la digestión enzimática. Además, demuestra su potencial para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos, lo que pone de manifiesto la importancia de la precisión y la consistencia en el proceso.

Aislamiento, cultivo y caracterización de células madre de pulpa dental a partir de dientes humanos deciduos y permanentes

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Este protocolo describe el aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo de cerdo (pADSC) de tejidos adiposos subcutáneos con examen de multipotencia. Los pADSC multipotentes se utilizan para delinear procesos de diferenciación de adipocitos y estudiar la transdiferenciación en múltiples linajes celulares de mesénquima mesodérmico o linajes adicionales de ectodermo y endodermo para estudios regenerativos.

El aislamiento y la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo de la especie porcina tejidos adiposos

Aprende a aislar y propagar células madre de pulpa dental humana con alta eficiencia. Este protocolo evalúa la expresión de la proteína prión durante la diferenciación neuronal para aplicaciones en medicina regenerativa.

Aislamiento, propagación y expresión de la proteína del prión durante la diferenciación Neuronal de células madre de pulpa Dental humana (Video) | JoVE Journal

Aislamiento, propagación y expresión de la proteína del prión durante la diferenciación Neuronal de células madre de pulpa Dental humana

Explorar más videos