Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

En este protocolo, podemos identificar las interacciones entre las proteínas y el ADN, revelando la regulación transcripcional del gen. Esto ayuda a entender los mecanismos moleculares en las células. Modificamos los protocolos preexistentes y luego establecemos protocolos de ensayo sencillos y más claros.

Simplemente siga el protocolo desde el primer paso para que el ensayo se pueda hacer con éxito. Para preparar cromatina reticulada, en una campana de humo, agregue cuatro mililitros de medios de cultivo celular 1%VCaP y 0.229 mililitros de 18.5%PFA a un plato de seis centímetros. Revuelva suavemente el plato para distribuir el PFA uniformemente.

Incubar a temperatura ambiente durante exactamente 10 minutos. A continuación, añadir 0,47 mililitros de solución de glicina 1,25-molar al plato, e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos para dejar de reticular más. Después de lavar las células según el manuscrito, raspe las células y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Centrifugar el tubo con la suspensión celular a 3.000 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente para recuperar el pellet celular. Utilice una pipeta para eliminar completamente el PBS. Registre el número de celda por tubo y almacene el pellet celular en menos 80 grados Celsius.

Para realizar la lysis celular, primero descongele los pellets de células VCaP almacenados sobre hielo. Añadir 300 microlitros del tampón de lelisis de células ChIP preparado complementado con PIC a cada tubo, y resuspender el pellet a fondo. Vórtice el tubo durante 15 segundos e incubar la suspensión sobre hielo durante 10 minutos.

Centrifugar a 9.000 g durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante por completo y agregue 300 microlitros de tampón de digestión MNase para resuspender el pellet. Diluir MNase con Tampón de digestión MNase en un tubo de 1,5 mililitros para producir 50 unidades de gel por microlitro.

Añadir la MNase diluida a la suspensión, e incubar a 37 grados Celsius durante exactamente 10 minutos. Ajuste la mezcla por inversión cada 2 minutos y medio. Para terminar la digestión MNase, agregue 30 microlitros de 0,5 molares EDTA a pH ocho, y vórtice brevemente.

Después de la incubación durante cinco minutos sobre hielo, centrifugar a 9.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante por completo y resusppend el pellet en 300 microlitros del tampón de dilución ChIP preparado complementado con PIC. A continuación, en un sonicador equipado con una sonda de microtipo, establezca las condiciones de sonicación en amplitud dos, tiempo de procesamiento 15 segundos, pulso ON cinco segundos y pulso OFF 30 segundos.

Sonicar la suspensión sobre hielo. Dibuje un microlitro de la suspensión y colóquelo en un vaso deslizante. Bajo un microscopio, observe para asegurarse de que la estructura celular está casi rota.

Centrifugar el tubo a 9.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Guarde 20 microlitros de la cromatina digerida en un tubo de tornillo de 1,5 mililitros para un tratamiento posterior, y almacene el resto en menos 80 grados centígrados. En primer lugar, en cada tubo de tornillo de 1,5 mililitros, añadir 75 microlitros de agua, cuatro microlitros de cloruro de sodio cinco molares, y un microlitro de proteinasa K.To eliminar la reticulación entre proteína y ADN, añadir 20 microlitros de cromatina digerida de cada condición de digestión MNase a un tubo de tornillo.

Cierre bien la tapa, mezcle completamente e incubar el tubo a 65 grados centígrados durante la noche. Por la mañana, después de centrifugar el tubo a dos a 3.000 veces g durante unos segundos, agregue 100 microlitros de PCI. Vórtice vigorosamente para formar una emulsión.

Centrifugar el tubo de nuevo a la velocidad máxima durante 30 segundos a temperatura ambiente. A continuación, prepare dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros por condición. Agregue 100 microlitros de PCI a un tubo.

Añadir 10 microlitros de acetato de sodio de tres molares a pH 5.2 y dos microlitros de glucógeno a otro tubo. Del tubo sacado de la centrífuga, dibuje cuidadosamente la fase superior que contiene el ADN y agréguelo al tubo que contiene PCI. Vortex vigorosamente, y centrifugar el tubo a la velocidad máxima durante 30 segundos a temperatura ambiente.

A continuación, transfiera la fase superior al tubo que contiene acetato de sodio y glucógeno preparados previamente. Añadir 250 microlitros de etanol, y mezclar por inversión. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar el tubo a máxima velocidad durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Confirme los pellets en la parte inferior del tubo. Retire cuidadosamente el sobrenadante para no molestar el pellet, y agregue 500 microlitros de 70%etanol.

Centrifugar el tubo a velocidad máxima durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante por completo y seque el pellet durante aproximadamente cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, añadir 20 microlitros de TE para disolver el pellet.

Mida la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV. Después de la preparación de la cromatina digerida, descongele todas las muestras sobre hielo. Añadir 1200 microlitros del tampón de dilución ChIP preparado complementado con PIC para diluir la cromatina digerida a la concentración de cinco microgramos por cada 500 microlitros.

Agregue cinco microlitros de la cromatina digerida diluida a un tubo de tornillo de 1,5 mililitros como muestra de entrada. Almacene la muestra a menos 80 grados centígrados. Agregue 500 microlitros cada uno de la cromatina digerida diluida a un tubo de tornillo de 1,5 mililitros como muestra de inmunoprecipitación.

Agregue dos microgramos de anticuerpos a cada tubo y cierre la tapa. Incubar los tubos a cuatro grados centígrados durante la noche mezclando suavemente en una plataforma de balanceo. Por la mañana, agregue 30 microlitros de cuentas magnéticas de proteína G de grado ChIP a cada tubo.

Incubar los tubos de nuevo a cuatro grados centígrados durante dos horas con una mezcla suave. Después de eso, gire hacia abajo el tubo brevemente a dos a 3.000 veces g, y coloque el tubo en un estante de polietileno que contenga imanes de neodimio durante un minuto. Luego, retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.

A continuación, agregue 0,5 mililitros de tampón de lavado complejo inmune bajo en sal a cada tubo. Vórtice brevemente el tubo para dispersar las perlas. Incubar el tubo a cuatro grados centígrados durante cinco minutos con una mezcla suave en una plataforma de balanceo.

Repita el lavado con complejo inmune de alta sal y complejo inmune de cloruro de litio según el manuscrito. Después de retirar completamente el sobrenadante restante, agregue 150 microlitros de tampón de elución al tubo. Vórtice el tubo para dispersar las cuentas por completo.

Cierre la tapa e incuba el tubo a 65 grados centígrados durante 30 minutos. Para dispersar las cuentas a fondo, mezcle por inversión cada cinco minutos. Durante la incubación, prepare un tubo de tornillo de 1,5 mililitros y agregue seis microlitros de cloruro de sodio de cinco molares y dos microlitros de proteinasa K.Thaw la muestra de entrada del 1% previamente preparada sobre hielo.

Añadir 150 microlitros de tampón de elución, seis microlitros de cloruro sódico de cinco molares y dos microlitros de proteína K a la muestra de entrada. Después de la incubación del tubo que contiene cuentas, gire hacia abajo. Coloque el tubo en un bastidor magnético durante un minuto y transfiera el sobrenadante al tubo de tornillo que contiene cloruro sódico y microfotografías K.Representativas de los gránulos de células reticuladas antes y después de la sonicación muestran diferencias distintas.

Sin sonicación, la estructura celular permanece intacta, lo que indica que la cromatina está presente en los núcleos. Una breve sonicación rompe la estructura celular. La cromatina reticulada se preparó a partir de células VCaP y se digerió con varias cantidades de MNase.

Sin añadir MNase, apareció un patrón de frotis con un peso molecular muy alto. La adición de MNase dio un patrón de escalera, que muestra que MNase digiere internucleosoma. Sólo la condición que produjo fragmentos de cromatina de hasta 900 bp puede considerarse una digestión adecuada, mientras que un patrón de digestión inapropiado muestra una sobredigestión que resultó principalmente en la producción de mononucleosomas.

El patrón de digestión de la cromatina en las células VCaP indica una digestión adecuada de la cromatina. La mayor ocupación de H3K4methyl3 se observó alrededor de 0,5 kilobases y una kilobase aguas arriba del AR-TSS. Las regiones ubicadas a 19 kilobases y ocho kb aguas arriba y 12 kilobases aguas abajo de AR-TSS, sin embargo, tenían poca ocupación de H3K4methyl3, lo que indica que éstas se pueden utilizar como regiones negativas.

Determinar la condición de digestión MNase es lo más importante. Mantenga el número de célula, el volumen del búfer y la cantidad de enzimas en cada experimento. La condición debe identificarse para cada tipo de celda.

Podemos realizar la secuenciación de ChIP para la ocupación global de los factores y capturas de conformación de cromatina para determinar las interacciones entre las lesiones genómicas distales. Este método podría revelar los mecanismos de proceso de la transcripción. El ensayo ChIP es una poderosa herramienta para investigar la regulación transcripcional, pero es engorroso y no reproducible.

Nuestro método anima a los investigadores a llevar a cabo el ensayo de forma rutinaria y sencilla.