Un método libre de enzimas para el aislamiento y la expansión de las células madre mesenquimales derivadas de adiposo humano
16 de diciembre de 2019
Este protocolo proporciona un método libre de enzimas para aislar las células madre mesenquimales de muestras de abdominoplastia y lipoaspiración utilizando un método explantado. La ausencia de enzimas duras o pasos de centrifugación proporciona células madre clínicamente relevantes que pueden utilizarse para estudios in vitro o transferirse de vuelta a la clínica.
Este protocolo proporciona una manera sencilla y rentable de aislar los ASC sin el uso de enzimas duras o pasos de centrifugación, que pueden alterar el fenotipo celular y el comportamiento. La falta de pasos duros produce menos células manipuladas que las aisladas con enzimas y centrifugación, minimizando las preguntas sobre si las observaciones experimentales son un artefacto del método de aislamiento. Este método de explant puede generar ASCs clínicamente relevantes para ser introducido en un paciente para tratar una variedad de enfermedades o expandirse en la vida permitir aplicaciones de investigación.
Es difícil explicar completamente el método de picado en palabras. La demostración visual puede servir a otros científicos las molestias de aprender a romper el tejido ellos mismos. Métodos de explant similares se pueden utilizar para aislar otras poblaciones de MSC, como las de los tejidos umbilicales.
Para picar las muestras de tejido de abdominoplastia, primero transfiera el tejido a la tapa de una placa estéril de 100 milímetros. Luego usa una aguja estéril para sostener un pedazo de tejido en su lugar y usa un bisturí estéril para cortar el tejido en trozos de menos de un milímetro. Transfiera el tejido a un tubo fresco e invierta o agite la muestra de cinco a seis veces para asegurar la mezcla de todas las capas.
Luego, con una espátula estéril, transfiera de 2,5 a cinco mililitros de tejido a una placa de cultivo de tejido tratado con plasma de gas al vacío de 100 milímetros. Mida el volumen de la muestra vertiendo en un tubo de centrífuga fresco. A continuación, agregue un volumen equivalente de medios de cultivo de tejido a la placa y gire suavemente la placa para mezclar el contenido.
Incubar la placa a 37 grados celsius en cinco por ciento de dióxido de carbono hasta que se vea un número suficiente de células en la base de la placa. Una vez que se observa un número suficiente de células en la placa o después de siete días, lo que sea antes, retire todos los trozos restantes de tejido. A continuación, el cultivo de los ASC en medios de cultivo de tejidos hasta que alcancen el 70% de confluencia o hasta que los racimos se densan en qué momento se deben pasar las células.
Enjuague suavemente la placa con 1X de solución salina tamponada de fosfato. Para probar las células adherentes, aspirar la solución salina tamponada de fosfato, añadir un mililitro de tripsina complementada con 0,25% EDTA a cada plato e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Agregue una pequeña cantidad de medios a la placa para desactivar la tripina.
A continuación, pipetee suavemente la tripína media desde la parte superior de la placa hacia abajo, soltando las células débilmente unidas de la placa. Para sembrar las celdas, primero agregue medios a la placa. Luego, agregue las celdas de una manera gota y luego gire la placa para asegurar una distribución uniforme a través de la placa.
Después de tres pasajes, proceda a fluir los ensayos de citometría y diferenciación. Después de tres pasajes, se encontró que los ASC aislados de lipoaspirato y abdominoplastia tenían una morfología y fenotipo de MSC, similar a los ASC aislados después de una digestión enzimática. Al igual que otros MSC, los ASC aislados explant son negativos para CD45 y positivos para CD73, CD90 y CD105.
Al picar el tejido, el área superficial de cada pieza debe ser lo suficientemente grande para que los ASC migren fuera del tejido. Estas son células madre fundamentales que se pueden utilizar para una amplia gama de aplicaciones. Los ASC aislados se pueden utilizar para cualquier aplicación posterior, in vivo o in vitro.
Descripción general
Este protocolo describe un método sin enzimas para aislar células madre derivadas del tejido adiposo (ASCs) a partir de muestras de abdominoplastia y lipoaspirado, utilizando una técnica de explante. Este enfoque minimiza la manipulación celular, asegurando células madre clínicamente relevantes adecuadas para diversas aplicaciones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de Células Madre
- Medicina Regenerativa
- Técnicas de Aislamiento Celular
Antecedentes
- Los métodos tradicionales para aislar las ASC a menudo implican enzimas agresivas y centrifugación.
- Estos métodos pueden alterar el fenotipo y el comportamiento celular.
- El método de explante proporciona una alternativa más suave.
- Las demostraciones visuales pueden ayudar a comprender el proceso de picado del tejido.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método sencillo y rentable para aislar ASC.
- Reducir el riesgo de artefactos en las observaciones experimentales causados por técnicas de aislamiento agresivas.
- Generar ASC clínicamente relevantes para aplicaciones terapéuticas.
Métodos Utilizados
- El tejido de abdominoplastía picado se cultiva en una placa de cultivo de tejidos.
- Las células se incuban a 37 °C en un ambiente de CO2.
- Tras un crecimiento celular suficiente, se eliminan los fragmentos de tejido restantes.
- Las células se pasan y caracterizan para marcadores de células madre.
Resultados principales
- Los ASC aislados exhiben una morfología y fenotipo similares a los obtenidos mediante digestión enzimática.
- Los ASC aislados por explante son negativos para CD45 y positivos para CD73, CD90 y CD105.
- El método proporciona células menos manipuladas, lo que mejora la fiabilidad experimental.
- Los ASC pueden utilizarse en diversas aplicaciones posteriores, tanto in vivo como in vitro.
Conclusiones
- El método de explante es una alternativa viable para aislar ASCs.
- Esta técnica preserva mejor las características celulares que los métodos tradicionales.
- Los ASCs aislados tienen un amplio potencial para aplicaciones en investigación y clínicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de aislamiento sin enzimas aborda un desafío clave en medicina regenerativa: obtener células madre mesenquimales relevantes clínicamente sin introducir artefactos derivados de procesos enzimáticos o mecánicos agresivos. Al preservar el fenotipo y la función celular nativos, el enfoque mejora la confianza predictiva en aplicaciones posteriores, como la modelización de enfermedades y el cribado terapéutico. El método respalda flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que la reducción de riesgos biológicos y la validación de dianas dependen de fuentes celulares confiables y mínimamente manipuladas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el uso de células madre derivadas del tejido adiposo con multipotencialidad y perfiles de marcadores de superficie conservados.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad en los resultados experimentales al eliminar alteraciones fenotípicas inducidas por enzimas.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo biológico mediante la generación de células menos manipuladas para ensayos de validación de dianas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Produce células madre derivadas del tejido adiposo adecuadas para ensayos in vitro estandarizados que requieren fenotipos mesenquimales consistentes.
- Valor operativo: Facilita la disponibilidad para ensayos mediante la expansión basada en explantes que mantiene la positividad para CD73, CD90 y CD105.
- Escalabilidad: Permite la producción reproducible de células para cribado de compuestos y estudios mecanicistas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Proporciona una fuente de células clínicamente relevante alineada con aplicaciones en medicina regenerativa.
- Modelo Preclínico: Permite la generación de células madre derivadas de tejido adiposo para sistemas relevantes a enfermedades sin exposición a enzimas xenógenas.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Disminuye las preocupaciones sobre artefactos de aislamiento que puedan afectar las evaluaciones de diferenciación o función inmunomoduladora.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde el aislamiento inicial de células madre hasta la validación preclínica, apoyando flujos de trabajo en los que la integridad de la fuente celular afecta la fiabilidad de los datos y las decisiones de avance o interrupción.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al proporcionar células madre derivadas del tejido adiposo con morfología y fenotipo similares a los nativos.
- Selección: Ofrece células estandarizadas y listas para expansión, para plataformas de ensayo que requieran características de células estromales mesenquimales.
- Análisis: Permite realizar citometría de flujo y ensayos de diferenciación tras tres pases para confirmar la identidad de las células madre.
- Investigación Traducional: Conecta el aislamiento con el potencial terapéutico mediante la preservación de propiedades celulares relevantes clínicamente.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable y libre de enzimas para la producción de células madre derivadas del tejido adiposo en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al minimizar los artefactos inducidos por aislamiento en experimentos con células madre.
- Valor operativo: Ofrece un protocolo sencillo y rentable sin dependencia de enzimas costosas ni centrifugación.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción mediante una mayor confianza en los resultados de los ensayos celulares.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al proporcionar células madre mesenquimales confiables para evaluación preclínica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere técnica aséptica y equipo básico de cultivo de tejidos para la minución mecánica y el cultivo de explantes.
- Depende de instrumentos estériles, incluyendo escalpelos, agujas y espátulas, para la preparación del tejido.
- Necesita condiciones estandarizadas de incubación a 37°C con 5% de CO2 para un crecimiento celular óptimo.
- Incluye el paso manual según la confluencia o la densidad de agregados tras la eliminación inicial del tejido.
- Se basa en citometría de flujo y ensayos de diferenciación para la confirmación fenotípica tras el aislamiento.
