Name: Un modelo in vitro para estudiar la agregación de Tau utilizando la transducción de neuronas humanas mediada por lentivirales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Aprende a establecer un modelo in vitro de tauopatía humana mediante transducción lentiviral de neuronas humanas. Este método permite evaluar rápidamente la toxicidad de tau y potenciales terapias para enfermedades neurodegenerativas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores le agradecen al Dr. Peter Davies en el Albert Einstein College of Medicine por suministrar anticuerpos PHF-1 y CP13 y al Dr. Marc Diamond en la Universidad de Texas, Southwestern, por proveer las construcciones tau. Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación de Alzheimer (NIRG-14-322164) a S.H.Y. y del Instituto de Medicina Regenerativa de California (TB1-01193) a P.R.

1. preparación de medios y reactivos
<ol><li>Descongelar el recubrimiento de matriz de membrana del sótano para placas de cultivo a 4 ° c (no permita que la matriz de membrana del sótano se caliente o se solidifique). Hacer alícuts de 1 mL y almacenarlos a-20 ° c o-70 ° c.</li>
	<li>Reconstituir el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en solución salina estéril amortiguada por fosfato (PBS) a 10 μg/mL y hacer alícuas de 10 μL. Guárdela a 4 ° c.</li>
	<li>A una botella nueva, sin abrir, de 500 mL de DMEM/F12 con glutamina, añadir B27 (10 mL), N2 (5 mL) y penicilina-streptomicina (5 mL). Colocar 50 mL de este medio de la célula madre neural (NSC) en un tubo cónico y añadir 10 μL de 10 μg/μL (2 μg/mL final) bFGF. Almacene los medios NSC (+) bFGF a 4 ° c.</li>
	<li>Para hacer (-) los medios bFGF, utilice la misma receta que se describe en el paso 1,3 pero no agregue bFGF. Estos medios se utilizarán para diferenciar los NSCs a las neuronas y para mantener las culturas neuronales después de la diferenciación.</li>
</ol>2. construcciones lentivirales
Nota: Antes de comenzar a trabajar con construcciones lentivirales, asegúrese de que el laboratorio ha sido aprobado para usar agentes de bioseguridad nivel 2 (BSL-2). Además, se deben utilizar campanas de cultivo BSL-2, equipo de protección personal (EPP) y métodos de eliminación cuando se trabaja con vectores lentivirales.
<ol><li>Obtenga construcciones tau empaquetadas en lentivirus de una fuente preferida (véase Sanders et al.10 para construir información).</li>
</ol>3. cultivo de células madre neuronales humanas
Nota: Los NSCs son típicamente sembrados en 100000 – 150000 células/cm2 y la mayoría de los NSCs disponibles comercialmente se venden como 1 x 106 células/vial. Este protocolo se ha optimizado para los platos de cultivo de células de 10 cm (aunque se pueden utilizar otros tamaños de platos); por lo tanto, si se están utilizando los NSCs disponibles comercialmente, los NSCs pueden necesitar ser ampliados por primera vez cultivados en platos de seis-pozo con el fin de dar lugar a suficientes células para sembrar 10 cm de platos. Este protocolo puede ser adaptado alternativamente para una variedad de tamaños de plato de cultivo celular (pero no contiene instrucciones para el paso de los NSCs ya que estos protocolos están disponibles en otros lugares11,12).
<ol><li>
Para la preparación de placas de cultivo celular, retire una alícuota de recubrimiento de matriz de membrana de sótano congelado para placas de cultivo celular y permita que se descongele a 4 ° c (las alícuotas se pueden colocar a 4 ° c durante la noche del día antes de que las células se sembren). Añadir 385 μL de recubrimiento de matriz de membrana sótano a 5 mL de medios DMEM/F12 + penicilina-streptomicina. Nota: 5 ml de medios DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina es suficiente para recubrir un solo plato de 10 cm (1 ml de esta solución de recubrimiento de matriz de membrana sótano es suficiente para recubrir un pozo de un plato de seis pozo). Alternativamente, si las células deben ser fijas e inmunostinadas, o teñidas para tioflavina, las células de cultivo en cubreobjetos de vidrio en los platos de cultivo de 24-well.<ol>
<li>Mantenga fríos los medios y el recubrimiento de la matriz antes y agregándolos a los platos de cultivo. Añadir el recubrimiento de matriz de membrana sótano a los platos de cultivo y colocar los platos en una incubadora (a 37 ° c) para 1 h. Para un recubrimiento óptimo, no Incube la matriz de membrana del sótano durante más de 1 h o menos. Después de 1 h, aspiran el recubrimiento de matriz de membrana del sótano de los platos de cultivos celulares. Asegúrese de que esto coincida con los NSCs que están listos para ser chapados. Nota: Si las celdas no se descongelan de las existencias congeladas, omita el paso 3,2 y continúe con el paso 3,3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si las células se descongelan de las existencias de NSC congeladas, tome un vial de células congeladas y caliente en un baño de agua calentado a 37 ° c moviendo el vial hacia atrás y hacia adelante en el agua. Una vez descongelada, pulverice el vial con etanol al 70% y colóquelo en una campana de cultivo celular. Transfiera las células a ~ 10 mL de medios DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina y centrifugue el tubo a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 min. Aspire los medios y resuspender las células en los medios NSC.</li>
	<li>Diluir las células en medios NSC para obtener la densidad de siembra apropiada para el recipiente de cultivo celular que se está utilizando. Nota: Por ejemplo, si los NSCs están siendo chapados en una placa de seis pozo — uno bien en un plato de seis cultivos tiene una superficie de 9 cm2— 900.000 a 1.350.000 las células se requieren para la semilla. Por lo tanto, un vial que contiene 1 millón células se puede precipitado resuspendido en 2 ml de medios y se añade a un solo pozo de un plato de seis podos.</li>
	<li>Agregue suficientes células suspendidas en los medios de la NSC para sembrar los platos de cultivo recubiertos con matriz de membrana basal (100.000 células/cm2) y cambie los medios cada dos días (si usa un caldo congelado, cambie los medios el día después del chapado y cada dos días después). Cultivar las células hasta que sean 75% – 80% confluentes. Nota: Las células probablemente alcancen 75% – 80% confluencia poco después de chapado, pero esto puede tomar más tiempo si se utilizan las existencias congeladas.</li>
	<li>Una vez que los NSCs son del 75% – 80% confluentes, comienzan la diferenciación neuronal quitando los medios de bFGF de la NSC (+) y reemplazándolos con los medios NSC (-) bFGF. Cultivo de las células en este medio (reemplazando los medios cada otro día) durante al menos 4 semanas. Nota: Las células continuarán dividiéndose durante unos días después de la retirada de bFGF; por lo tanto, las células pueden alcanzar 90 – 100% confluencia. Después de cultivar durante 4 semanas, las células tendrán un destino neuronal y estarán listas para el tratamiento del lentivirus.</li>
</ol>4. transducción y mantenimiento de cultivos neuronales
<ol><li>Para transducir neuronas con lentivirus, utilice un conteo de título de 3,4 x 105 transducibles unidades/célula (un 100% de 10 cm de confluido de plato contendrá ~ 10 millones neuronas). Diluir las unidades transducibles a la concentración necesaria en los medios de cultivo celular y añadirlas a las células (utilizar el volumen normal de los medios para el plato de cultivo celular). Dos días después de añadir el lentivirus, lave las células 1X con medios frescos (-) bFGF (sin lentivirus) y continúe cultivando en (-) medios de bFGF como de costumbre.</li>
	<li>Para el tratamiento post-lentiviral, alimente las neuronas transducadas cambiando el medio de cultivo celular ([-] medio de bFGF) cada otro día. Mantener las células durante ~ 8 semanas después de la transducción. Rutinariamente visualizar las células bajo un microscopio de luz para asegurar la viabilidad. Nota: La dispersión o las roturas dendríticas son signos de que las células ya no son viables.</li>
</ol>5. imágenes de las células
<ol><li>
Las imágenes de células vivas
	<ol>
<li>Después de la transducción (4 días después de la adición de lentivirus), observar las señales de YFP bajo un microscopio fluorescente capaz de imágenes de células vivas. Tome los platos de cultivo celular de la incubadora y asegúrese de que los pozos de cultivo permanecen estériles manteniendo la tapa en la parte superior de los platos de cultivo. Visualice las células usando un objetivo de 10x con una longitud de onda de excitación de ~ 514 nm y un filtro de emisión de ~ 527 nm. Nota: Los agregados son típicamente visibles en cultivos celulares transducados 6 – 8 días después de la aplicación del lentivirus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tinción de células fijas (etiquetado β-Tubulin III y tinción de tioflavina)
	<ol>
<li>Para fijar las células en paraformaldehído (PFA), retire los medios de cultivo de las neuronas transducidas cultivadas en cubreobjetos de vidrio. Lave las células 1X con PBS, extraiga el lavado y añada 300 – 500 μL (si utiliza placas de 24-Well) de 4% de PFA (diluido en PBS) a los cubreobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Retire la PFA y lave los cubreobjetos 2x con PBS.</li>
		<li>Preparar una solución de bloqueo que consiste en PBS, 3% albúmina sérica bovina (BSA), y 0,3% Triton X-100. Añadir 300 – 500 μL de la solución a los pozos e incubar los cubreobjetos durante 2 h a 4 ° c. Después de 2 h, diluir los anticuerpos primarios (a una concentración de anticuerpos de 1:500) en la solución de bloqueo y añadir 300 – 500 μL de solución de anticuerpos primarios a cada pozo. Coloque la placa en una plataforma oscilante o giratoria (a baja velocidad) durante la noche a 4 ° c.</li>
		<li>Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios y lave los cubreobjetos 3x durante 5 min cada uno con PBS. Diluir los anticuerpos secundarios en una solución tampón de bloqueo (con una concentración de 1:1000) y añadir una solución de anticuerpos secundaria a cada pozo. Seleccione el anticuerpo secundario apropiado utilizando una etiqueta fluorescente que no se superponga con la señal YFP (CY-3, por ejemplo). Incubar las células a temperatura ambiente durante 2 h en una plataforma oscilante o giratoria. Después de 2 h, retire la solución de anticuerpos secundarios y lave los cubreobjetos 3x durante 10 min cada uno con PBS.</li>
		<li>Lavar los cubreobjetos en agua desionizada doble (DDW) durante 10 min. extraer el DDW y añadir 300 μL/pozo de 0,015% de tioflavina-S diluido en etanol al 50% durante 10 min. Retire la solución de tioflavina y lave las cubiertas 2x por 4 min cada una con un 50% de etanol, seguida de 4 min lavar con etanol al 30% y dos lavados durante 5 min cada uno con un 30% de etanol. Lave los cubreobjetos 1X con DDW antes del montaje. Nota: La tinción de tioflavina descrita en el paso 5.2.4 es opcional.</li>
		<li>Para montar los cubreobjetos en diapositivas de vidrio, coloque una sola gota de soporte de montaje en el lado "+" de un portaobjetos de vidrio. Retire todo el líquido del pozo que contiene el recubrimiento de vidrio y, utilizando fórceps finos, retire con cuidado el recubrimiento de vidrio, manteniendo un registro de qué lado tiene las células cultivadas.</li>
		<li>Presione suavemente el borde de la cubreobjetos contra un Kimwipe para eliminar el exceso de humedad. Aún agarrando el cupado con fórceps finos, toque el borde (con el lado de la célula mirando hacia la gota de soporte de montaje) de la cubreobjetos a los medios de montaje, y luego, Coloque suavemente el cobertillo en el soporte de montaje (colocando las células cultivadas en el montaje medios de comunicación y intercalarlos entre el colador y el tobogán de cristal). Deje que el soporte de montaje se endurezca durante 30 minutos antes de la toma de imágenes. Las diapositivas se pueden almacenar a-20 ° c para su uso futuro.</li>
		<li>Imagen de las células utilizando un microscopio fluorescente y los espectros de excitación/emisión apropiados (YFP = ~ 514/527 nm, CY-3 = ~ 555/568 nm, y thioflavin S = ~ 390/426 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. métodos opcionales
<ol><li>Cada 2 días, recoger los medios acondicionados de las culturas y almacenarlos a-20 ° c para futuros análisis de especies de Tau liberados por las culturas.</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li>
<li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li>
<li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li>
<li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li>
<li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li>
<li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe la generación de un modelo in vitro de tauopatía humana que exhibe agregados de plata-mancha positiva y ovillos neurofibrilares positivos de tioflavina (NFTs). Además, las células transducadas muestran patologías inducidas por TAU, como defectos morfológicos, reducción de la sinaptogénesis y un aumento del volumen lisosomal. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona un modelo accesible y rentable de la tauopatía neuronal, que se puede utilizar para los estudios de detección de fárm...

La agregación patológica de la proteína tau asociada a un microtúbulo es una característica definitoria de muchas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la AD, la demencia frontotemporal (FTD), la enfermedad de Pick y la parálisis la supranuclear progresiva (PSP)1. En un estado no enfermo, Tau se une y estabiliza los filamentos de microtúbulo en axones neuronales2. Sin embargo, la hiperfosforilación asociada a la enfermedad de Tau promueve la agregación de TAU, la disociación de los microtúbulos y la toxicidad neuronal3. Los efectos tóxicos de Tau agregada pueden implicar la activación aberrante de colinérgicos4 y los receptores glutamatérgicos5 resultando en la desregulación del calcio intracelular y, eventualmente, la muerte celular. En modelos animales, la reducción de Tau cerebral mejora la patología en ratones AD6 y en modelos de ratón de lesión cerebral traumática leve repetitiva7.
La evidencia de montaje demuestra que la estructura y la afinidad de unión de Tau derivado del ratón son distintas de Tau derivado del humano y que Tau de ratón es inadecuado para modelar Tauopatías humanas8. Sin embargo, los modelos de tauopatía celular humana no están ampliamente disponibles comercialmente. El objetivo general de este trabajo es describir un modelo in vitro de agregación tau en el que las neuronas humanas son transducidas con vectores de origen lentiviral que contienen construcciones tau humanas mutantes9. El agregado de tau que hace que las construcciones lentivirales se codifiquen para el dominio de repetición tau P301L y V337M mutaciones fusionadas con un reportero de YFP (tau-RDLM-YFP) mientras que el control construye el código para el dominio de repetición de Tau (WT) de tipo salvaje fusionado con un reportero de YFP (tau-WT-YFP). Los cultivos neuronales transducidas usando este método expresan aproximadamente nueve veces más tau que las culturas no transducadas. Aunque la cantidad de expresión de Tau expresada en exceso es aproximadamente igual entre las células de Tau-RdlM-YFP y tau-WT-YFP-transducidas, solo las neuronas transducidas con agregados de visualización tau-RdlM-YFP. Las culturas transladadas con tau-RDLM-YFP se mancha positivamente para tioflavina y muestran reducciones en la longitud axonal y la densidad sináptica. Por lo tanto, este modelo celular puede ser una herramienta útil para estudiar la agregación de Tau in vitro.

<table><tbody><tr><td>Placas de cultivo de 10 cm</td><td>Thermofisher</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 mL Biopioneer</td><td></td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehído</td><td>Thermofisher</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de 24 pocillos</td><td>Thermofisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 50 mL</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol en botella</td> <td>rociadoraVarias fuentes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Basic FGF</td><td>Biopioneer</td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo celular</td><td>Varias fuentes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Varias fuentes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 Medios de cultivo con glutamina</td><td>Thermofisher</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (concentración del 50% o superior)</td><td>Varias fuentes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente</td><td>Varias fuentes, dependientes del experimento</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Varias fuentes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>de vidrio Thermofisher</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Thermofisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Células madre neurales humanas</td><td>Varias fuentes</td><td>NA</td> Vectores lentivirales Varias <td></td></tr><tr><td></td><td>fuentes</td><td>pedido</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Medios de montaje</td><td>Thermofisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios</td><td>Varias fuentes, dependientes del experimento</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma oscilante o giratoria</td><td>Varias fuentes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Campana</td> <td>de cultivo celular estérilVarias fuentes</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina S</td><td>Sigma</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Varias fuentes</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo in vitro para estudiar la agregación de tau utilizando la transducción de neuronas humanas mediada por lentivirales

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

La agregación aberrante de la proteína tau está implicada patogénicamente en una serie de enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (AD). Aunque los modelos de tauopatía de ratón han proporcionado un recurso valioso para la investigación de los mecanismos neurotóxicos de la Tau agregada, es cada vez más evidente que, debido a las diferencias interespecies en Neurofisiología, el cerebro del ratón es inadecuado para modelar la condición humana. Los avances en los métodos de cultivo celular han hecho que las culturas neuronales humanas sean accesibles para uso experimental in vitro y han ayudado en el desarrollo de neuroterapias. Sin embargo, a pesar de la adaptación de las culturas celulares neuronales humanas, los modelos in vitro de la tauopatía humana aún no están ampliamente disponibles. Este protocolo describe un modelo celular de agregación de tau en el que las neuronas humanas son transducadas con vectores de origen lentiviral que codifica para tau mutado patógeno fusionado a un reportero de proteína fluorescente amarilla (YFP). Las culturas transducadas producen agregados tau que se mancha positivamente para la tioflavina y muestran marcadores de neurotoxicidad, como la longitud axonal disminuida y el aumento del volumen lisosomal. Este procedimiento puede ser un modelo útil y rentable para el estudio de las tauopatías humanas.

Las neuronas de Tau-RdlM-YFP-transduced se etiquetaron con fluorescencia con YFP, y las culturas RdlM-transduced muestran agregados después de la transducción. Estas inclusiones manchadas positivas para tioflavina (figura 1). Como se muestra en la figura 1 , este protocolo produce cultivos neuronales que muestran agregados de Tau tioflavina positivos. Para los experimentos iniciales, se recomienda que la diferenciación neuronal se confirme mediante la inmunoglob...

Este protocolo detalla un procedimiento en el que las culturas neuronales humanas son transducidas con construcciones lentivirales codificando para tau humano mutante. Las culturas transducadas muestran agregados Tau y patologías asociadas.

Un modelo in vitro para estudiar la agregación de Tau utilizando la transducción de neuronas humanas mediada por lentivirales

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

En este protocolo detallamos un modelo in vitro de tauopatía humana. Este método llena una necesidad de materiales que pueden ser útiles para la detección de fármacos y estudios del mecanismo de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que el paradigma del cultivo celular permite una evaluación más rápida de la toxicidad tau y las posibles terapias tau en comparación con los estudios en animales para comenzar este procedimiento descongelar el recubrimiento de la matriz de membrana del sótano para placas de cultivo a cuatro grados Celsius.Haga alícuotas de un mililitro y guárdelas a menos 20 o menos 70 grados centígrados. A continuación, reconstituir el factor de crecimiento de fibroblastos básico en PBS estéril a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Haga alícuotas de 10 microlitros y guárdelas a cuatro grados centígrados.A continuación, establezca una nueva botella sin abrir de 500 mililitros de DMEM-F12 con glutamina. Añadir 10 mililitros de B27, cinco mililitros de N2, y cinco mililitros de penicilina-estreptomicina para preparar los medios de células madre neurales. Coloque 50 mililitros del medio NSC en un tubo cónico y agregue 10 microlitros del bFGF preparado.Almacene este NSC más medios bFGF a cuatro grados centígrados. En primer lugar, retire una alícuota de recubrimiento de matriz de membrana sótano congelado para placas de cultivo celular del congelador y permite descongelar a cuatro grados centígrados. Agregue 385 microlitros del recubrimiento de la matriz de membrana del sótano descongelado a cinco mililitros de medios DMEM-F12 que contengan penicilina-estreptomicina.Si las células se están descongelando de las existencias de NSC congeladas, tome un vial de células congeladas del congelador y caliente en un baño de agua calentado a 37 grados Celsius moviendo el vial hacia adelante y hacia atrás en el agua. Después de esto, rocíe el vial con 70%etanol. Luego, bajo una capucha de cultivo celular, transfiera las células a aproximadamente 10 mililitros de medios DMEM-F12 que contienen penicilina-estreptomicina.Centrifugar a temperatura ambiente a 1.000 g durante cinco minutos. A continuación, aspirar los medios y resuspender las células en medios NSC. Diluir las células en medios NSC para obtener la densidad de siembra adecuada para el recipiente de cultivo celular que se está utilizando.Añadir suficientes células suspendidas en medios NSC para sembrar los platos de cultivo recubiertos de matriz de membrana del sótano. Crecer las células a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono hasta que sean 75 a 80%confluentes, asegurándose de cambiar los medios cada dos días. Para transducir neuronas con lentivirus, utilice un recuento de títulos de 340.000 unidades transducibles por célula.Diluir las unidades transducibles en medios de cultivo celular a la concentración necesaria, y añadirlas a las células. Dos días después de agregar el lentivirus, lave las células una vez con medios frescos que no contengan bFGF. Continúe cultivando las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono en los medios sin bFGF.Mantener las células durante unas ocho semanas después de la transducción, asegurándose de cambiar los medios de cultivo celular cada dos días. Utilice un microscopio de luz para visualizar rutinariamente las células y garantizar la viabilidad. Después de la transducción, retire los platos de cultivo de la incubadora asegurándose de mantener la tapa en ellos para mantener el cultivo bien estéril.Utilice un microscopio fluorescente capaz de obtener imágenes de células vivas para visualizar las células bajo un objetivo 10X con una excitación de 514 nanómetros y un filtro de emisión de 527 nanómetros. En este estudio, las neuronas transducidas con lentivirus tau-RDLM-YFP se etiquetan fluorescentemente con YFP. Los cultivos culturales transducidos por RDLM se ven para mostrar agregados después de la transducción.Estas inclusiones manchan positivas para tioflavina. La diferenciación neuronal se confirma mediante el inmunoetiquetado del marcador específico de la neurona beta-tubulina III en cultivos. Es importante recordar que los anticuerpos secundarios con etiqueta fluorescente deben tener un espectro de emisión de excitación que no se superponga con el de YFP.Aunque los agregados tau de fluorescencia amarilla serán visibles en ausencia de tinción, la tioflavina también debe utilizarse para la toma de imágenes con el fin de confirmar que la señal fluorescente es tau agregada y no residuos celulares. Después de la generación de células sobreexpresantes de tau, se pueden realizar una serie de evaluaciones de la salud neuronal y la agregación tau. Por ejemplo, hemos descubierto que estas células muestran degeneración axonal.Además de los estudios de cultivo celular, hemos utilizado este método para examinar la patogenicidad de la tau derivada exosomal.

an-vitro-model-for-studying-tau-aggregation-using-lentiviral-mediated

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un ensayo basado en células que cuantifica la absorción de Tau por parte de la microglía murina utilizando agregados de Tau marcados con fluorescencia sensibles al pH, analizados a través de la clasificación de células activadas por fluorescencia para una evaluación cuantitativa.

Un ensayo basado en células para evaluar la absorción de la proteína Tau por la microglía

Este video demuestra el proceso de inducir células madre pluripotentes humanas para diferenciarse en neuronas transfectándolas con lentivirus modificados genéticamente que llevan un gen de factor de transcripción neurogénico bajo el control de un elemento sensible a la tetraciclina, seguido de un tratamiento con un derivado de tetraciclina y un medio de maduración.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en neuronas utilizando lentivirus modificados

Este video muestra el proceso de transducción de células neuronales humanas con un lentivirus que codifica una proteína tau humana mutante marcada con proteína fluorescente amarilla (YFP) para estudiar la agregación de proteínas. Describe los pasos desde la entrada viral hasta la expresión mutante de tau, que culmina en la formación de agregados citoplasmáticos visibles de tau en las neuronas.

Transducción lentiviral de neuronas humanas para el análisis de agregación de proteínas Tau

Proteínas tau no modificados y hiperfosforiladas fueron utilizados en dos ensayos de agregación in vitro para revelar la cinética de agregación rápida hiperfosforilación-dependiente. Estos ensayos allanar el camino para futuras pantallas para los compuestos que pueden modular la propensión de tau hiperfosforilada para formar fibrillas que subyacen a la progresión de la enfermedad de Alzheimer.

En Vitro agregación ensayos usando hiperfosforilada proteína tau

Este protocolo describe un método simple para el aislamiento y cultivo de neuronas de gránulo cerebral primario de ratón (CGNs) de cachorros de 6-7 días, transduction eficiente de CGNs por pérdida y ganancia de estudios de la función y modelado de excitotoxicidad neuronal inducida por el NMDA, muerte celular inducida por potasio bajo, daño del ADN y estrés oxidativo utilizando el mismo modelo de cultura.

Modelado de la muerte Neuronal y la degeneración en las neuronas del gránulo cerebeloso primario de ratón

El análisis de la agregación de tau se describe en este manuscrito imita las características anticipadas en vivo tau mal plegamiento y agregación.

In Vitro Análisis para el estudio de la agregación de la proteína Tau y detección de drogas

Aquí describimos un ensayo basado en células para evaluar cuantitativamente la absorción tau por microglia con el objetivo de crear una herramienta de investigación para caracterizar mejor los mecanismos de acción de los anticuerpos anti-tau.

Ensayo basado en células para estudiar despacho Tau anticuerpo-mediada por la microglía

El tau es una proteína neuronal presente tanto en el citoplasma, donde se une a los microtúbulos, como en el núcleo, donde ejerce funciones no convencionales, incluida la modulación de genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Aquí, describimos un método para investigar la función de Tau nuclear excluyendo cualquier interferencia proveniente de Tau citoplasma.

Modulación de la localización subcelular Tau como herramienta para investigar la expresión de genes relacionados con enfermedades

Se requiere un modelo fisiológico in vivo de α-sinucleína para estudiar y comprender la patogénesis de la enfermedad de Parkinson. Describimos un método para monitorear la citotoxicidad y la formación agregada de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizada.

Un método para estudiar la toxicidad y agregación de α-sinucleína utilizando un modelo de levadura humanizado

Aquí, demostramos cómo combinar la transfección de neuronas primarias de roedores del hipocampo con imágenes confocales de células vivas para analizar los efectos patológicos inducidos por proteínas en el transporte axonal e identificar las vías mecanicistas que median estos efectos.

Uso de imágenes de células vivas para medir los efectos de las proteínas patológicas en el transporte axonal en las neuronas primarias del hipocampo

Las ataxias espinocerebelosas de poliglutamina son causadas por expansiones CAG que producen proteínas propensas a la agregación. Este protocolo describe la producción vectorial, la entrega estereotaxica y el análisis de inclusiones y pérdida de marcadores neuronales, proporcionando una plataforma controlada para investigar mecanismos y evaluar terapias dirigidas para enfermedades neurodegenerativas.

Patología estriatal inducida por lentivirales como modelo preclínico de ataxias poliglutaminas, espinocerebelosas

Aprende a establecer un modelo in vitro de tauopatía humana mediante transducción lentiviral de neuronas humanas. Este método permite evaluar rápidamente la toxicidad de tau y potenciales terapias para enfermedades neurodegenerativas.

Un modelo in vitro para estudiar la agregación de Tau utilizando la transducción de neuronas humanas mediada por lentivirales

Explorar más videos